中藥千金子二萜醇對(duì)腎癌786-0細(xì)胞移植瘤S期激酶相關(guān)蛋白2的影響

龔永明 周磊 宋圣佑 趙俊峰

(1河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科,河南 鄭州 450002;2河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院)

腎細(xì)胞癌起源于腎小管上皮細(xì)胞,簡(jiǎn)稱腎癌,在泌尿系統(tǒng)中僅次于膀胱癌和前列腺癌,是泌尿系統(tǒng)中致死率最高的惡性腫瘤。腎癌的發(fā)病原因及其發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制仍不明確,有研究發(fā)現(xiàn)S期激酶相關(guān)蛋白(Skp)2對(duì)腎細(xì)胞癌的形成有一定影響,同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)中藥千金子二萜醇可抑制腎臟癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究旨在探討中藥千金子二萜醇對(duì)腎癌786-0細(xì)胞移植瘤Skp2的影響。

1 材料和方法

1.1材料與試劑 千金子二萜醇(四川維克奇生物科技有限公司);腎癌786-0細(xì)胞由(武漢普諾賽生命科學(xué)有限公司);4～8周齡的SPF級(jí)BALB/c裸鼠(北京斯貝福生物技術(shù)有限公司),16只(雌雄各半),體質(zhì)量16～21 g;0.25%胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司);10%胎牛血清及RPMI1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司);鼠抗人Skp2mAb、免疫組化(SP)試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2786-0細(xì)胞培養(yǎng) 將培養(yǎng)基中的786-0細(xì)胞在恒溫條件下完全培養(yǎng)到90%飽和,取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,首先用胰蛋白酶(濃度為0.25%)進(jìn)行消化,然后再用胎牛血清培養(yǎng)液(濃度為10%)配成一定濃度的細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml)。

1.3構(gòu)建移植瘤動(dòng)物模型及分組 將配好的786-0細(xì)胞懸液(0.2 ml/只)分別皮下注射于每只裸鼠右前肢腋窩處,然后隨機(jī)分成兩組:對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,每組8只。

1.4監(jiān)測(cè)移植瘤生長(zhǎng)情況 自腫瘤細(xì)胞注射1 w起,瘤體生成后每天觀察成瘤情況,待瘤體生長(zhǎng)無明顯差異后開始給予藥物干預(yù)。對(duì)照組移植瘤裸鼠給予等體積的生理鹽水灌胃,實(shí)驗(yàn)組移植瘤裸鼠給予20 mg/kg千金子二萜醇溶液灌胃。藥物開始干預(yù)后每3 d用毫米游標(biāo)卡尺分別測(cè)量瘤體的長(zhǎng)、寬、高最大直徑(mm),依據(jù)腫瘤體積(V)計(jì)算公式:V(mm3)=長(zhǎng)×寬×高/2,算出瘤體大小。在用藥21 d后處死裸鼠,切取瘤體組織備用。

1.5制作瘤體組織蠟塊及SP檢測(cè) 切取大小約1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的瘤體組織,均用濃度為10%甲醛固定,常規(guī)脫水及石蠟包埋后,對(duì)所有標(biāo)本組織蠟塊常規(guī)切片,厚度4～5 μm,每張切片用DAB溶液顯色,蒸餾水終止反應(yīng),蘇木素-伊紅(HE)染色,然后作形態(tài)學(xué)觀察。SP染色法嚴(yán)格按SP試劑盒說明書仔細(xì)操作,選擇有代表性的腫瘤區(qū)域及進(jìn)行標(biāo)記。用已知乳腺癌標(biāo)本作陽性對(duì)照,用等滲緩沖鹽溶液(TBS)代替一抗作陰性對(duì)照。

1.6結(jié)果判定制定判定標(biāo)準(zhǔn) Skp2在胞核胞質(zhì)中或只在胞核中表達(dá)為陽性,僅在胞質(zhì)中表達(dá)為陰性。隨機(jī)取5個(gè)高倍視野,然后計(jì)算每個(gè)高倍視野下陽性細(xì)胞數(shù)占總腫瘤細(xì)胞數(shù)的比率,最后再計(jì)算此5個(gè)高倍視野的平均百分比。Skp2陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性,≥10%為陽性,結(jié)果判定由2人一起完成,取兩人測(cè)得平均數(shù)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

裸鼠移植成瘤后灌藥21 d,處死裸鼠,將裸鼠瘤體組織剝離下來,然后用SP法檢測(cè)裸鼠瘤體組織Skp2表達(dá),Skp2主要表達(dá)在細(xì)胞核中,也有部分表達(dá)在胞核胞質(zhì)中。陽性染色呈現(xiàn)粗大棕黃色顆粒,見圖1。Skp2在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的裸鼠瘤體中表達(dá)率分別為87.50%(7/8)和12.50%(1/8),兩組差異顯著(χ2=0.12,P=0.04)。

圖1 兩組瘤體組織Skp2表達(dá)(DAB,×200)

3 討 論

腎癌是泌尿系常見的惡性腫瘤之一,占腎腫瘤的85%以上〔1〕,占所有惡性腫瘤的2%。在大多數(shù)國家和地區(qū),腎癌的發(fā)病率呈持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)〔2〕,每年約14萬人死于該病〔3〕,嚴(yán)重威脅人類的生命健康。腎癌的發(fā)病原因尚不明確,有研究發(fā)現(xiàn)腎癌的發(fā)病與家族遺傳、肥胖、職業(yè)、抽煙、飲食、糖尿病、高血壓、放射等多種因素有關(guān),主要表現(xiàn)為血尿、腰部疼痛、腰部腫物等不適。腎癌的治療首選根治性腎切除術(shù),由于腎癌對(duì)放療和化療均不敏感,因此不能作為常規(guī)的輔助療法。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn),20%的腎癌患者首次就診時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,這些患者需要新的輔助治療。近年來,隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步,發(fā)現(xiàn)了許多治療腎癌的新方法,比如免疫治療、靶向治療,為腎癌的治療帶來了新希望,但大部分患者在接受治療過程中由于獲得性耐藥而導(dǎo)致療效欠佳,進(jìn)而成為進(jìn)展性疾病〔4〕,導(dǎo)致有效的治療率仍較低〔5〕,再加免疫治療及靶向治療價(jià)格昂貴,仍不能普及應(yīng)用,因此仍有待于積極尋找更新、更多樣化的治療方法。

研究發(fā)現(xiàn),Skp2是叉頭盒(Fox)蛋白質(zhì)家族成員,它與Skp1、Cullin和Rbx1共同構(gòu)成,基因定位于人5號(hào)染色體短臂上(5p13),是一種泛素-蛋白連接酶復(fù)合物,是一個(gè)致癌基因,它調(diào)控著許多重要的生物學(xué)過程來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn),Skp2通過影響E鈣黏蛋白、周期蛋白激酶抑制因子(CKIs)、FOXM1、p57、基質(zhì)金屬蛋白酶9蛋白表達(dá)水平等調(diào)節(jié)細(xì)胞的周期進(jìn)程,影響細(xì)胞的凋亡和DNA的損傷,并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的糖酵解及調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞的分化等,進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等〔6,7〕,已有研究報(bào)道Skp2在乳腺癌、淋巴瘤、前列腺癌等許多惡性腫瘤中高表達(dá)。Skp2高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展和預(yù)后不良正相關(guān),在腎臟多種類型的惡性腫瘤中,如腎臟嫌色細(xì)胞癌、腎臟透明細(xì)胞癌和腎臟乳頭狀細(xì)胞癌,Skp2高表達(dá)者的生存期較低表達(dá)者明顯縮短,因此Skp2的高表達(dá)是腎癌預(yù)后欠佳的重要因素〔8〕。多種研究發(fā)現(xiàn),Skp2與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有緊密聯(lián)系,在多種惡性腫瘤中高表達(dá),根據(jù)此特性,抑制Skp2表達(dá)成為治療惡性腫瘤的新方法之一〔9,10〕。

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),千金子可抑制多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔11〕,已有報(bào)道千金子對(duì)白血病、食管癌、鼻咽癌等的治療均有很好的效果。千金子別名又叫千兩金、續(xù)隨子等,為大戟科植物,性溫,味辛,毒性小,主要含有大量脂肪油、二萜醇、香豆素等化合物,其中二萜醇類化合物是其主要成分,也是其重要的活性成分,主要用于內(nèi)治水腫、痰飲、積滯脹滿、二便不通、血瘀經(jīng)閉等,外治頑癬、疣贅。趙俊峰等〔12〕研究發(fā)現(xiàn),千金子二萜醇可在體外抑制腎癌Renca細(xì)胞和人腎癌786-0細(xì)胞的增殖,促進(jìn)腎癌Renca細(xì)胞的凋亡,并可抑制腎癌細(xì)胞的侵襲和遷移。

有研究發(fā)現(xiàn),姜黃素在一定程度上能抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中Skp2的表達(dá),通過調(diào)控Skp2-p27kip通路可能是其抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的分子機(jī)制之一〔13〕。丁虹等〔14〕研究發(fā)現(xiàn),半枝蓮提取物能夠顯著誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3信號(hào)的活化,降低Skp2表達(dá),使腫瘤細(xì)胞在G0/G1期受阻,從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,此研究結(jié)論為鼻咽癌的治療提供了新的思路與方向。

綜上,中藥千金子二萜醇能抑制786-0細(xì)胞移植瘤Skp2的表達(dá),從而得出千金子二萜醇可通過另外一條機(jī)制起到治療腎細(xì)胞癌的作用。但目前的研究還停留在動(dòng)物模型階段,對(duì)于臨床的應(yīng)用效果及對(duì)不同類型的惡性腫瘤是否具有同樣的治療作用還需要進(jìn)一步探索。