FOXC2與上皮型鈣黏蛋白對老年結(jié)直腸癌患者臨床預(yù)后及細胞活性的影響

彭傳林 曹惠 朱義生 劉龍 趙學軍 陳丹

(宿州市第一人民醫(yī)院 1普外科,安徽 宿州 234000;2內(nèi)鏡中心;3武漢大學基礎(chǔ)醫(yī)學院;4宣城市人民醫(yī)院老年科)

結(jié)直腸癌是我國老年人群中高發(fā)的惡性腫瘤,其患病率逐年增加,是急需重點防治的疾病之一〔1〕。雖然隨著近年來腫瘤治療技術(shù)的快速進步,手術(shù)、放化療等不斷完善,但每年死于結(jié)直腸癌的患者數(shù)未出現(xiàn)明顯下降,治療方案選擇的合理性是其中主要原因之一〔2〕。準確評估結(jié)直腸癌患者病情嚴重程度和預(yù)后是治療方案合理制定的前提。叉頭框蛋白(FOX)C2位于人類16號染色體,與對應(yīng)配體結(jié)合后能夠調(diào)控下游基因表達,在食管癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中呈高表達狀態(tài),促進腫瘤發(fā)展〔3,4〕,但在結(jié)直腸癌中的表達特點及作用的研究仍十分少見。上皮型鈣黏蛋白存在于人體上皮細胞表面,在細胞之間及細胞與基質(zhì)之間的連接中發(fā)揮通訊作用〔5〕,其表達下降是引發(fā)上皮細胞去分化和高浸潤性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔6〕。本研究旨在探討FOXC2與上皮型鈣黏蛋白對老年結(jié)直腸癌患者臨床預(yù)后及細胞活性的影響。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取2018年1月至2019年3月宿州市第一人民醫(yī)院收治的老年結(jié)直腸癌患者84例。入選標準:①年齡≥60歲,經(jīng)組織病理學檢查確診為結(jié)直腸癌;②首次確診,無放化療等抗腫瘤治療史;③接受手術(shù)治療,配合完成隨訪。排除標準:①合并精神性疾病者;②合并其他組織器官惡性腫瘤。其中男38例,女46例;年齡60～82歲,平均(67.58±5.61)歲;組織學分級:高分化34例,中分化32例,低分化18例;腫瘤直徑:<5 cm 52例,≥5 cm 32例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期47例,Ⅲ～Ⅳ期37例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例;浸潤深度:T1～T2 52例,T3～T4 32例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,患者均簽署知情同意書。

1.2細胞與主要試劑 人結(jié)直腸癌細胞系HCT116購于上?？道噬镉邢薰尽Ｃ庖呓M化檢測試劑盒購于北京百歐泰生物有限公司;血清FOXC2檢測試劑盒和血清上皮型鈣黏蛋白檢測試劑盒均購于上海谷研實業(yè)有限公司;胎牛血清,DMEM完全培養(yǎng)基購于上海錸博生化科技有限公司;CCK-8檢測試劑盒北京拜爾迪生物有限公司;Transwell小室購于南京迅貝生物有限公司;鼠抗人FOXC2單克隆抗體,兔鼠抗人上皮型鈣黏蛋白單克隆抗體,鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2單克隆抗體,鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶9單克隆抗體及對應(yīng)的二抗均購于上海恒遠生物有限公司。

1.3免疫組化法檢測組織標本中FOXC2、上皮型鈣黏蛋白表達 留取手術(shù)切除的結(jié)直腸癌病灶組織及術(shù)中留取距離腫瘤病灶邊緣5 cm以上的癌旁正常組織,石蠟包埋、切片。將石蠟切片烤片2 h,常規(guī)脫蠟,室溫下加入二甲苯中靜置10 min,無水乙醇中靜置5 min,95%乙醇中靜置5 min,雙蒸餾水洗滌后室溫下靜置。高壓修復(fù)抗原,磷酸緩沖液洗滌后滴加一抗,稀釋倍數(shù)均為1∶500,4 ℃冷藏過夜,次日滴加辣根過氧化物酶標記的二抗,室溫下靜置1 h,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,復(fù)染、脫水、透明、封片。顯微鏡下觀察FOXC2、上皮型鈣黏蛋白陽性染色均為黃色、棕黃色、棕褐色,FOXC2定位于細胞質(zhì),上皮型鈣黏蛋白定位于細胞膜,對陽性細胞比例和染色強度進行評分,兩項乘積0～2分為陰性,3～9分為陽性。

1.4資料收集和血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白濃度檢測 收集患者人口學特征及組織學分級、腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、浸潤深度,術(shù)后對患者進行3年隨訪,收集生存情況。術(shù)前采集患者空腹外周靜脈血,離心收集血清,酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白濃度。

1.5HCT116細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人結(jié)直腸癌細胞HCT116使用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基,在37 ℃ 5%體積的CO2培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)。將HCT116細胞接種于6孔板中,顯微鏡下觀察細胞生長至80%融合時更換為不含血清的培養(yǎng)基。使用脂質(zhì)體2000進行轉(zhuǎn)染,siRNA制備由北京靖瑞百康生物有限公司完成。使用無干擾活性的siRNA轉(zhuǎn)染HCT116細胞為陰性對照組,有FOXC2干擾活性的siRNA轉(zhuǎn)染HCT116細胞為FOXC2低表達組,僅加入脂質(zhì)體的HCT116細胞為空白對照組。

1.6CCK-8檢測HCT116細胞增殖能力 取對數(shù)期HCT116細胞,按4×105/ml密度鋪于96孔板中,并加入含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基100 μl,常規(guī)培養(yǎng)24 h進行同步化處理,根據(jù)分組轉(zhuǎn)染細胞,每組設(shè)置8個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染24、48、72 h加入濃度10%的CCK-8試劑10 μl/孔,讀取450 nm處的吸光度(OD)值。

1.7劃痕實驗檢測HCT116細胞遷移能力 取對數(shù)期HCT116細胞,按6×105/ml密度鋪于6孔板中,顯微鏡下觀察HCT116細胞生長融合度超過90%時做垂直劃痕,根據(jù)分組轉(zhuǎn)染細胞,設(shè)8個復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)細胞24 h,觀察劃痕寬度變化并拍照,測量劃痕面積,計算HCT116細胞劃痕的愈合率。

1.8HCT116細胞侵襲能力檢測 將基底膠∶DMEM=1∶9稀釋后加入Transwell上室,體積為50 μl,常規(guī)培養(yǎng)6 h,將HCT116細胞按6×105/ml密度加入Transwell上室;根據(jù)分組向Transwell下室加入相應(yīng)的細胞培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,結(jié)晶紫染色,光學顯微鏡下計數(shù)進入下室的細胞數(shù)量。

1.9Western印跡檢測細胞中FOXC2、上皮型鈣黏蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶表達 RIPA細胞裂解各組HCT116細胞的總蛋白,測定蛋白濃度,電泳后使用電轉(zhuǎn)法將目標蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,室溫下封閉1 h,滴加一抗∶鼠抗人FOXC2單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶300),兔鼠抗人上皮型鈣黏蛋白單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶500),鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶100),鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶9單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶100),鼠抗人GAPDH單克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶1 000),4 ℃冷藏過夜,次日滴加二抗,稀釋倍數(shù)1∶2 000,室溫下靜置1 h,電化學發(fā)光法(ECL)顯影,讀取條帶灰度值。

1.10統(tǒng)計學分析 采用SPSS25.0軟件進行方差分析、t檢驗、χ2檢驗及受試者工作特征(ROC)曲線分析。

2 結(jié) 果

2.1不同組織中FOXC2與上皮型鈣黏蛋白表達情況比較 結(jié)直腸癌組織中FOXC2陽性率〔58例(69.05%)〕高于癌旁正常組織〔17例(20.24%)〕,上皮型鈣黏蛋白陽性率〔14例(16.67%)〕低于癌旁正常組織〔65例(77.38%)〕,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=42.692、39.057,均P=0.000)。

2.2不同臨床病理特征患者FOXC2與上皮型鈣黏蛋白表達水平比較 TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度T3～T4的結(jié)直腸癌患者FOXC2陽性率明顯升高,上皮型鈣黏蛋白陽性率明顯降低(P<0.01,P<0.05);FOXC2、上皮型鈣黏蛋白陽性率在不同性別、年齡、分化程度、腫瘤直徑的結(jié)直腸癌患者之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征患者FOXC2與上皮型鈣黏蛋白陽性表達比較〔n(%)〕

2.3不同預(yù)后水平患者血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白濃度比較 隨訪3年期間,84例老年結(jié)直腸癌患者生存65例(77.38%)。死亡組血清FOXC2濃度〔(41.95±5.03)ng/ml〕高于生存組〔(8.29±1.51)ng/ml〕,上皮型鈣黏蛋白濃度〔(84.60±8.25)U/L〕低于生存組〔(122.42±11.67)U/L〕,差異有統(tǒng)計學意義(t=28.219、32.751,均P=0.000)。

2.4血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白檢測對患者臨床預(yù)后的評估價值分析 ROC曲線分析顯示,血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白檢測對老年結(jié)直腸癌患者臨床預(yù)后具有較高的評估價值(P<0.05);其中血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白聯(lián)合檢測的評估價值最高曲線下面積(AUC)=0.939〕,靈敏度和陽性預(yù)測值明顯高于各指標單獨檢測。見圖1、表2。

圖1 血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白檢測對患者臨床預(yù)后的ROC曲線

表2 血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白檢測對患者臨床預(yù)后的評估價值分析

2.5各組結(jié)直腸癌細胞中FOXC2表達水平比較 FOXC2低表達組結(jié)直腸癌細胞中FOXC2 蛋白表達水平(1.15±0.13)低于陰性對照組(2.37±0.29)和空白對照組(2.41±0.35),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),陰性對照組與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組結(jié)直腸癌細胞中FOXC2蛋白表達的Western印跡

2.6各組結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力比較 FOXC2低表達組結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移、侵襲水平均明顯低于陰性對照組和空白對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);陰性對照組與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力及上皮型鈣黏蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶水平比較

2.7各組細胞上皮型鈣黏蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶表達水平比較 FOXC2低表達組結(jié)直腸癌細胞中上皮型鈣黏蛋白表達水平明顯高于陰性對照組和空白對照組,基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9表達水平明顯低于陰性對照組和空白對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3。

3 討 論

目前臨床已有手術(shù)、放化療、免疫治療、靶向治療等多種抗結(jié)直腸癌治療手段,準確評估患者病情和預(yù)后對治療方案的合理制定,改善預(yù)后具有重要意義。FOXC2可影響細胞核中DNA轉(zhuǎn)錄,參與調(diào)控下游基因表達〔7〕;研究顯示,FOXC2能夠促進淋巴管和血管的新生,還作為上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的誘導(dǎo)因子,促進惡性腫瘤細胞發(fā)生上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化,提升細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力〔8〕?；A(chǔ)研究顯示,FOXC2在腫瘤細胞中伴隨間質(zhì)表型蛋白高表達,而上皮型鈣黏蛋白等上皮標志物低表達〔9〕。已在食管癌、乳腺癌中發(fā)現(xiàn)FOXC2高表達參與病情的進展,但在結(jié)直腸癌患者中表達的研究仍十分少見。上皮型鈣黏蛋白是一種位于細胞連接面的跨膜糖蛋白,與鈣離子形成二聚體,參與調(diào)控同型細胞的黏附過程〔10〕。人上皮細胞中上皮型鈣黏蛋白是形成正常連接復(fù)合物的主要調(diào)節(jié)因子,與細胞骨架連接,胞外信號向胞內(nèi)傳遞,細胞分化、生長密切相關(guān)〔11〕。

本研究結(jié)果提示,結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中FOXC2高表達,上皮型鈣黏蛋白低表達,可能參與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移過程。本文老年結(jié)直腸癌患者生存率與相關(guān)研究報道中結(jié)直腸癌患者3年生存率75.8%、78.51%基本一致〔12,13〕,說明本地區(qū)老年結(jié)直腸癌患者生存率處于平均水平。本文表明,血清FOXC2、上皮型鈣黏蛋白單獨和聯(lián)合檢測對患者臨床預(yù)后具有較高的評估價值,聯(lián)合檢測的評估價值最高,可用于老年結(jié)直腸癌患的預(yù)后評估,指導(dǎo)治療方案的制定。

FOXC2在多種惡性腫瘤中高表達,促進腫瘤的浸潤與遷移;還能夠上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶表達,維持血管穩(wěn)定性,保證腫瘤生長過程中的營養(yǎng)供應(yīng)〔14〕。FOXC2能夠參與調(diào)控內(nèi)皮細胞、腫瘤干細胞的分化方向,影響細胞增殖、遷移等過程〔15〕。本研究結(jié)果提示,下調(diào)FOXC2表達能夠抑制結(jié)直腸癌細胞的生長、轉(zhuǎn)移和擴散。細胞間的黏附作用分為細胞與細胞間的黏附、細胞與基質(zhì)間的黏附兩種類型;上皮型鈣黏蛋白是細胞與細胞間黏附的主要調(diào)控因子,在腫瘤組織中低表達,能夠促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲〔16〕。腫瘤細胞遷移和侵襲過程需要基質(zhì)金屬蛋白酶降解相鄰胞外基質(zhì)來完成?；|(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9是與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系最密切的基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員,參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲〔17〕。本研究中下調(diào)FOXC2表達后結(jié)直腸癌細胞中上皮型鈣黏蛋白表達升高,基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9表達下降,提示FOXC2可能通過作用于上皮型鈣黏蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶2、基質(zhì)金屬蛋白酶9參與結(jié)直腸癌細胞的遷移和侵襲過程。