乳腺癌中ASS1的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性

聶雅婷,丁 蘭,袁 媛,劉 磊,沈立新

(1.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西 西安 710069;2.空軍軍醫(yī)大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,陜西 西安 710032)

2020年,世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer)公布的最新數(shù)據(jù)顯示,乳腺癌占全球所有新增癌癥病例的11.7%,取代肺癌成為世界第一大癌癥[1]。在中國(guó),乳腺癌發(fā)病率約等于婦科宮頸癌、卵巢癌、內(nèi)膜癌總和的1.7倍,是威脅我國(guó)女性生命健康的最主要疾病[1-2]。乳腺癌的異質(zhì)性很強(qiáng),針對(duì)不同的乳腺癌分型,尋找特異性靶點(diǎn)并采取精準(zhǔn)的個(gè)體化治療是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[3-4]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),尿素循環(huán)關(guān)鍵分子表達(dá)與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。

尿素循環(huán)主要發(fā)生在哺乳動(dòng)物的肝臟,以氨基酸等含氮化合物代謝產(chǎn)生的游離氨以及天冬氨酸為底物生成尿素,避免了機(jī)體中過(guò)量氨蓄積,維持機(jī)體的氨氮平衡。在其他器官中,尿素循環(huán)(urea cycle)是內(nèi)源性精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、瓜氨酸的唯一來(lái)源[5]。同時(shí),尿素循環(huán)也為多胺、一氧化氮、脯氨酸的合成提供底物,維持細(xì)胞的生存和增殖[6-9]。在尿素循環(huán)中,精氨酸代琥珀酸合成酶(argininosuccinate synthase 1,ASS1)和精氨酸代琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase,ASL)催化瓜氨酸至精氨酸的反應(yīng),為細(xì)胞提供內(nèi)源性精氨酸。

本研究通過(guò)TCGA及GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)分析1 212例乳腺癌患者,以及90例正常乳腺組織的RNA-seq數(shù)據(jù),確定尿素循環(huán)關(guān)鍵分子在乳腺癌中的表達(dá),進(jìn)一步分析差異表達(dá)分子與患者預(yù)后的關(guān)系。收集97例乳腺癌患者以及54例正常乳腺組織臨床病理標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋、切片以及免疫組化染色,確定乳腺癌中尿素循環(huán)關(guān)鍵分子ASS1的表達(dá),及其與乳腺癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。旨在探討尿素循環(huán)在乳腺癌中的作用,為乳腺癌的精準(zhǔn)治療提供理論基礎(chǔ)。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)的獲取和分析

1 212例乳腺癌患者尿素循環(huán)關(guān)鍵分子RNA-seq數(shù)據(jù)以及1 214名乳腺癌患者生存時(shí)間數(shù)據(jù)來(lái)自UCSC Xena 數(shù)據(jù)庫(kù)(https:∥xenabrowser.net/heatmap/)中的 TCGA Breast Cancer(BRCA),90例正常乳腺組織尿素循環(huán)關(guān)鍵分子mRNA數(shù)據(jù)來(lái)源于GTEx數(shù)據(jù)集,非配對(duì)t檢驗(yàn)分析基因表達(dá)差異,Kaplan-Meier進(jìn)行生存分析。

1.2 人乳腺癌標(biāo)本的臨床資料

選取2010年11月至2016年12月在西京醫(yī)院進(jìn)行乳腺癌手術(shù)治療的 97例乳腺癌組織以及54例非腫瘤組織(距腫瘤>5 cm),固定、制作組織芯片、切片染色。腫瘤組織經(jīng)病理診斷均為浸潤(rùn)性乳腺癌,非腫瘤組織為乳腺腺病。所有患者均為首次確診,術(shù)前均未接受任何放化療治療、內(nèi)分泌治療且未合并其他惡性腫瘤,排除妊娠期女性、男性乳腺癌患者、不能明確分子分型者,臨床病理資料完整。

1.3 乳腺癌分子分型的判定

基于不同的基因表達(dá)特點(diǎn)收集各個(gè)乳腺癌分子亞型病例,主要包括:Luminal A型(10例)、Luminal B型(47例)、過(guò)表達(dá)型(30例)和Basal-like型(10例)。本研究通過(guò)了西京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批,患者及家屬知情。

1.4 免疫組化染色檢測(cè)ASS1的表達(dá)

正常乳腺組織以及乳腺癌組織石蠟樣本切片、二甲苯、梯度乙醇脫蠟,自來(lái)水沖洗10 min;1×Tris-EDTA(10×Tris-EDTA堿修復(fù)液:Tris 12.1 g,EDTA 3.7 g,去離子水定容至500 mL)堿修復(fù)液進(jìn)行高壓抗原修復(fù);1% Triton X-100水溶液處理15～30 min進(jìn)行透化,1×PBS 清洗3次,每次3 min;滴加3%H2O2,避光放置10～20 min,結(jié)束后1×PBS清洗3次,每次3 min;采用非一抗來(lái)源的山羊血清封閉30 min;滴加兔來(lái)源抗人ASS1抗體(1∶300, Abcam, 貨號(hào):ab170952)4 ℃過(guò)夜孵育;室溫復(fù)蘇1 h,1×PBS清洗3次,每次3 min;二抗(山羊抗兔IgG,1∶10 000,Jackson,貨號(hào):111-035-003)室溫孵育1 h,1×PBS清洗3次,每次3 min。DAB 染色液顯色(ultra view universal DAB detection kit,中山金橋,ZLI-9018),并在顯微鏡(10×)下觀察,看到淡黃色著色后立即將切片置于自來(lái)水中終止著色。蘇木素復(fù)染5～10 s,1%鹽酸-酒精分化3～5 s,自來(lái)水沖洗10～20 min返藍(lán);脫水中性樹(shù)膠封片。

結(jié)果判讀采用半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),于高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):① 染色程度。無(wú)染色(0分),淡黃色(1分),棕黃色(2分),黃褐色(3分)。② 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)。≤5%(0分),6%～25%(1分),26%～50%(2分),51%～74%(3分),≥75% (4分)。依據(jù)上述兩項(xiàng)積分乘積進(jìn)行判定:0 分記為(-)/陰性,1～4分記為(+)/弱陽(yáng)性,5～8分記為(++)/陽(yáng)性,>8分記為(+++)/強(qiáng)陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用 SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行生存曲線制作。服從正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± SD)表示,采用方差分析進(jìn)行比較;不服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用四分位間距進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述,采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn))進(jìn)行組間比較。ASS1 蛋白水平與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系分析采用Spearman秩相關(guān)性分析,生存分析采用 Kaplan-Meier 法并進(jìn)行 Log-rank檢驗(yàn)。

2 研究結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析乳腺癌中尿素循環(huán)關(guān)鍵分子的表達(dá)

氨基甲酰磷酸合成酶1(carbamoyl phosphate synthetase 1,CPS1)、ASS1、ASL和精氨酸酶(arginase,ARG1)等是催化尿素循環(huán)的代謝酶。主要表達(dá)于肝臟,其他組織中發(fā)生一定程度的特異性表達(dá)。其中CPS1和ASS1是尿素循環(huán)的關(guān)鍵限速酶,確保尿素循環(huán)得以順利進(jìn)行。通過(guò)分析1 212例TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)乳腺癌患者及90例GTEx正常乳腺組織mRNA數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),這4種酶在乳腺癌中的表達(dá)均下調(diào),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.000 1)(見(jiàn)圖1)。提示乳腺癌患者存在尿素循環(huán)障礙。

注:(a)～(d)結(jié)果表明,尿素循環(huán)分子CPS1、ASS1、ASL、ARG1在乳腺癌中的表達(dá)均下調(diào),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p< 0.000 1)。

2.2 尿素循環(huán)關(guān)鍵分子ASS1表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性

基于以上結(jié)果,進(jìn)一步分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中1 217例乳腺癌患者的生存時(shí)間發(fā)現(xiàn),尿素循環(huán)關(guān)鍵分子ASS1和CPS1低表達(dá)乳腺癌患者總體生存率均高于高表達(dá)患者,而ASL和ARG1高表達(dá)患者總體生存率高于低表達(dá)患者。通過(guò)Kaplan-Meier 分析并進(jìn)行 Log-rank 檢驗(yàn),說(shuō)明ASS1低表達(dá)對(duì)患者預(yù)后有顯著影響(p=0.003 1)〔見(jiàn)圖2(b)〕。而CPS1、ASL和ARG1表達(dá)水平對(duì)乳腺癌患者的預(yù)后無(wú)顯著影響(p=0.331 3,0.580 1,0.460 4)〔見(jiàn)圖2(a)、圖2(c)、圖2(d)〕。選擇與預(yù)后有關(guān)的ASS1基因進(jìn)行后續(xù)研究。

注:經(jīng) Kaplan-Meier 分析和 log-rank 檢驗(yàn)顯示,ASS1高表達(dá)組患者總體生存率均低于低表達(dá)組患者(p< 0.05)〔見(jiàn)圖2(b)〕。CPS1、ASL、ARG1表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后無(wú)關(guān)(p> 0.05)〔見(jiàn)圖2(a)、圖2(c)、圖2(d)〕。

2.3 免疫組化分析ASS1在乳腺癌組織及非腫瘤組織的表達(dá)

對(duì)乳腺癌組織芯片進(jìn)行ASS1免疫組化染色,定義ASS1陰性(-)以及弱陽(yáng)性(+)為ASS1低表達(dá)(ASS1-L),ASS1陽(yáng)性(++)及強(qiáng)陽(yáng)性(+++)為高表達(dá)(ASS1-H)。免疫組化染色顯示ASS1在正常乳腺組織中高表達(dá)〔見(jiàn)圖3(a)～(b)〕,而在腫瘤組織中呈現(xiàn)異質(zhì)性表達(dá)〔見(jiàn)圖3(c)～(f)〕。免疫組化結(jié)果顯示,97例乳腺癌組織中74例(76.29%)為ASS1-L,23例(23.71%)為ASS1-H,而在54例正常乳腺組織中47例(87.03%)為ASS1-H。與正常乳腺組織相比,ASS1在乳腺癌中的表達(dá)下降,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05,見(jiàn)表1)。

表1 ASS1在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達(dá)

圖3 ASS1在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達(dá)

2.4 ASS1評(píng)分與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

對(duì)乳腺癌患者臨床病理信息進(jìn)行Spearman秩相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),ASS1表達(dá)與患者分子分型、Ki-67顯著相關(guān)(p=0.000 5,0.021 5,見(jiàn)表1)。而與腫瘤直徑、雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)、人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體(human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(p=0.340 3,0.091 0,0.123 3,0.051 4,0.116 6,見(jiàn)表2)。其中Ki-67為細(xì)胞核內(nèi)分裂增殖相關(guān)蛋白,臨床上常作為腫瘤細(xì)胞增殖活性的可靠標(biāo)記,與患者預(yù)后有關(guān)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ASS1低表達(dá)與Ki-67呈正相關(guān),即ASS1低表達(dá)患者預(yù)后差。前期根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)Luminal A型:ER陽(yáng)性和(或)PR陽(yáng)性,HER-2陰性,Ki-67<14%。Luminal B型:ER陽(yáng)性和(或)PR陽(yáng)性,HER-2陰性,Ki-67≥14% 或者ER陽(yáng)性和(或)PR陽(yáng)性,HER-2陽(yáng)性。HER-2過(guò)表達(dá)型:ER陰性,PR陰性,HER-2陽(yáng)性。Basal-like型:ER陰性,PR陰性,HER-2陰性。對(duì)收集的臨床病人信息進(jìn)行整合發(fā)現(xiàn),ASS1低表達(dá)與分子分型顯著相關(guān),可以針對(duì)不同的分子分型采取精準(zhǔn)治療。

表2 ASS1表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.5 ASS1表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

總體生存率和無(wú)進(jìn)展生存期是乳腺癌患者的預(yù)后指標(biāo),研究中免疫組化染色的97例乳腺癌患者中ASS1低表達(dá)的患者74例,截至隨訪結(jié)束生存60例(81.08%),ASS1高表達(dá)的23例患者中生存20例(86.96%),即ASS1低表達(dá)患者總體生存率低。ASS1低表達(dá)的73例患者中生存62例(84.9%),ASS1高表達(dá)的24例患者中生存20例(83.3%),即ASS1低表達(dá)患者的無(wú)進(jìn)展生存率較高表達(dá)組高。但是通過(guò)Kaplan-Meier 生存分析發(fā)現(xiàn),ASS1表達(dá)水平和患者總體生存率(p> 0.05)〔見(jiàn)圖4(a)〕、無(wú)進(jìn)展生存期無(wú)相關(guān)性(p> 0.05)〔見(jiàn)圖4(b)〕。

注:(a)ASS1低表達(dá)組患者總體生存率較高表達(dá)組低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p>0.05;(b)ASS1低表達(dá)組患者無(wú)進(jìn)展生存率較高表達(dá)組低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p> 0.05。

3 分析及結(jié)論

全球乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),位居女性惡性腫瘤之首[10]。目前,手術(shù)結(jié)合放化療是治療乳腺癌的主要手段,但其高度異質(zhì)性、高復(fù)發(fā)率、耐藥性使治療效果不可觀[4, 11-12]。因此,探討乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的分子機(jī)制,尋找潛在的特異性分子生物靶點(diǎn)對(duì)于乳腺癌診斷治療有著極其重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn),ASS1低表達(dá)與骨肉瘤患者術(shù)后轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后顯著相關(guān)[13]。此外,ASS1低表達(dá)與黏液纖維肉瘤的分級(jí)和分期密切相關(guān),并且可以獨(dú)立預(yù)測(cè)腫瘤的無(wú)轉(zhuǎn)移生存期和疾病特異性生存期[14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析TCGA以及GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn),乳腺癌中ASS1、CPS1、ASL和ARG1表達(dá)均顯著下調(diào),提示乳腺癌存在尿素循環(huán)障礙。其中,ASS1下降與乳腺癌患者預(yù)后顯著相關(guān)(p=0.003 1),與低表達(dá)組相比,ASS1高表達(dá)組預(yù)后較差?；谝陨戏治?本研究制作了乳腺癌以及乳腺腺病組織芯片,進(jìn)行免疫組化染色,發(fā)現(xiàn)ASS1在乳腺癌患者中的表達(dá)顯著下調(diào),且ASS1低表達(dá)與乳腺癌預(yù)后以及無(wú)病生存期具有一定相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)病例主要處于乳腺癌早期,各分子分型病人所占比重不同,同時(shí)存活率較高,故總體生存率以及無(wú)進(jìn)展生存期差異不顯著。進(jìn)一步分析臨床病理特征發(fā)現(xiàn),ASS1表達(dá)與Ki-67以及乳腺分子分型顯著相關(guān),而與腫瘤T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR、HER-2等無(wú)關(guān)。本研究為單中心小樣本研究,所得結(jié)果可能存在偏倚,后期還需繼續(xù)擴(kuò)大臨床樣本量對(duì)研究結(jié)果進(jìn)一步補(bǔ)充說(shuō)明,以便得出更為可靠的結(jié)果,用于臨床診斷及參考。

尿素循環(huán)缺陷也是乳腺癌治療的潛在代謝靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn),ASS1在一些乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)低或者缺失,這意味著乳腺癌細(xì)胞自身不能通過(guò)尿素循環(huán)合成內(nèi)源性精氨酸[15],所以癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖所需的精氨酸必須從循環(huán)血液中獲得,導(dǎo)致產(chǎn)生精氨酸依賴(lài)[16]。若血清中精氨酸含量降低,則乳腺癌細(xì)胞會(huì)因?yàn)槿狈I(yíng)養(yǎng)而死亡[17]。聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞胺酶(ADI-PEG20)促進(jìn)精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣习彼?從而降低血液中的精氨酸含量,有望用于ASS1低表達(dá)乳腺癌患者的治療。此外,mTOR抑制劑通過(guò)抑制CAD(carbamoyl-phosphate synthetase 2, aspartate transcarbamylase, and dihydroorotase)的磷酸化,與ASS1競(jìng)爭(zhēng)底物天冬氨酸,從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制精氨酸生成,也可以抑制ASS1低表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)[18]。因此,ASS1的表達(dá)水平對(duì)于乳腺癌具有重要的生物學(xué)意義,可成為治療乳腺癌值得關(guān)注的新靶點(diǎn)。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)ASS1在乳腺癌中呈現(xiàn)異質(zhì)性,但總體表達(dá)水平低于正常乳腺組織,并且ASS1低表達(dá)與乳腺癌Ki-67、患者預(yù)后及分子分型等存在顯著相關(guān)性。因此,ASS1在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,有望作為乳腺癌診斷及治療的重要靶標(biāo)。