凱氏定氮法測定花生中蛋白質(zhì)方法的優(yōu)化

杜 蒙，孫允超，李雯雯，王曉軍，賈瑞杰，程倩倩

（聊城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東聊城 252000）

花生中蛋白質(zhì)含量較為豐富，每百克含量大約為22 g?；ㄉ俏覈墒秤玫膬?yōu)質(zhì)植物蛋白，極易被人體吸收。目前，測定花生中蛋白質(zhì)含量的方法有很多，凱氏定氮法由Kieldahl于1883年首先提出，具有操作簡單、測定結(jié)果準(zhǔn)確、成本低廉[1-2]等優(yōu)勢，目前依然被廣泛使用。

凱氏定氮法的測定原理是花生中的蛋白質(zhì)在催化加熱消化條件下分解，產(chǎn)生的氨與硫酸生成硫酸銨。加入氫氧化鈉堿化蒸餾后使氨游離，用硼酸混合指示劑吸收后，以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液進(jìn)行滴定，根據(jù)滴定量計(jì)算氮的含量，再乘以相關(guān)食品的換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。本文主要對《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》（GB 5009.5—2016）第一法—?jiǎng)P氏定氮法測定花生蛋白質(zhì)含量時(shí)的操作步驟進(jìn)行單因素試驗(yàn)，探討各因素對花生蛋白質(zhì)含量測定值的影響，優(yōu)化花生蛋白質(zhì)測定的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生樣品（茌平基地采摘）；五水硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、碳酸鈉、硼酸、硫酸銨甲基紅、溴甲酚綠、95%乙醇，國藥集團(tuán)；濃硫酸（98%）、濃鹽酸，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。除硫酸銨試劑為優(yōu)級純外，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動凱氏定氮儀（濟(jì)南海能）；石墨消解儀（濟(jì)南海能）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特）；分析天平（中國梅特勒托利多）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

硼酸溶液（20 g·L-1）：稱取硼酸試劑20 g溶解于蒸餾水中后稀釋至1 000 mL。

氫氧化鈉溶液（400 g·L-1）：稱取氫氧化鈉試劑400 g溶于蒸餾水中，冷卻至室溫，稀釋至1 L。

0.1 mol·L-1的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液：準(zhǔn)確量取8.3 mL濃鹽酸于容量瓶中，用蒸餾水定容至1 L，用無水碳酸鈉標(biāo)定。用萬分之一天平稱取經(jīng)105 ℃烘3 h冷卻后的無水碳酸鈉0.2 g（精確至0.000 1 g），溶于100 mL水中，并加入20 mL硼酸混合指示劑，用鹽酸滴定，同時(shí)做空白，滴定后煮沸，變色后繼續(xù)滴定（約2～4滴），此滴定量為最終滴定結(jié)果，計(jì)算公式為

式中：C為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol·L-1；m為稱量無水碳酸鈉基準(zhǔn)試劑的質(zhì)量，g；V為滴定時(shí)消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；105.99為無水碳酸鈉的摩爾質(zhì)量。

甲基紅乙醇溶液（1 g·L-1）：稱取甲基紅試劑0.1 g，用95%乙醇稀釋至100 mL。

溴甲酚綠乙醇溶液（1 g·L-1）：稱取溴甲酚綠試劑0.1 g，用95%乙醇稀釋至100 mL。

混合指示劑：1份甲基紅乙醇溶液與5份溴甲酚綠乙醇溶液臨用時(shí)混合。取4 mL甲基紅乙醇溶液和20 mL溴甲酚綠乙醇溶液混合，取混合液20 mL加在2 L硼酸溶液中。

1.3.2 樣品處理

稱取打碎混勻的花生樣品0.3 g（精確至0.000 1 g）至250 mL消解管中，每個(gè)消解管中加入0.4 g硫酸銅、6 g硫酸鉀及10 mL硫酸于石墨消解儀進(jìn)行消解，消解完畢后，消解管中的液體呈綠色透明狀，取出冷卻，每批次需做空白試樣，于全自動凱氏定氮儀上測定。

堿管路試劑桶中裝氫氧化鈉溶液（400 g·L-1），酸管路試劑桶中裝硼酸混合指示劑溶液（20 g·L-1），水管路試劑桶中裝蒸餾水，滴定酸試劑瓶中裝鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液0.1 mol·L-1，儀器設(shè)定加堿量為40 mL，加水量20 mL，硼酸混合指示液20 mL，蒸餾時(shí)間5 min。蒸餾結(jié)束后，儀器使用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液0.1 mol·L-1進(jìn)行自動滴定，記錄滴定鹽酸用量。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

（1）消解溫度。稱取樣品并加入催化劑和10 mL濃硫酸后，當(dāng)消解溫度分別達(dá)到360 ℃、380 ℃、400 ℃、420 ℃、440 ℃、460 ℃后，再繼續(xù)消解1.5 h，消解完畢后，于全自動凱氏定氮儀上測定。

（2）濃硫酸用量。稱取樣品并加入催化劑后，分別加入5 mL、8 mL、10 mL、12 mL、15 mL濃硫酸，在消解溫度為420 ℃、消解時(shí)間為1.5 h的條件下，消解完畢后，于全自動凱氏定氮儀上測定。

（3）消解時(shí)間。稱取樣品并加入催化劑和10 mL濃硫酸后，當(dāng)消解溫度達(dá)到420 ℃后，繼續(xù)消解0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h，消解完畢后，于全自動凱氏定氮儀上測定。

1.3.4 空白試驗(yàn)

空白試驗(yàn)，除不稱取花生樣品，稱取0.5 g蔗糖外，其余測定步驟同樣品測定步驟。

1.3.5 回收試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取優(yōu)級純硫酸銨基準(zhǔn)試劑0.2 g（精確至0.000 1 g）于消解管中，無需消解，于全自動凱氏定氮儀上測定。

1.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取7份0.3 g（精確至0.000 1 g）的花生樣品，用本文優(yōu)化后的條件方法分別進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.7 花生中蛋白質(zhì)含量的計(jì)算

計(jì)算公式為

式中：X為試樣中蛋白質(zhì)的含量，g/100 g；V1為試液中消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；V2為空白樣品中消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL；C為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，mol·L-1；0.014為1.0 mL鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g；m為試樣的質(zhì)量，g；F為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，花生為5.46；100為換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消解溫度對花生蛋白質(zhì)含量的影響

由圖1可知，在消解時(shí)間為1.5 h、濃硫酸用量為10 mL的條件下，隨著消解溫度的升高，花生蛋白質(zhì)的含量呈先升高后降低的趨勢，消解溫度為420 ℃時(shí)，花生蛋白質(zhì)的含量明顯高于其余消解溫度時(shí)的含量，可能是由于消解溫度低時(shí)，樣品消解不完全；當(dāng)消解溫度過高時(shí)，含氮物質(zhì)以氣體形式損失，造成測定結(jié)果偏低[3]。因此，選擇420 ℃為最適溫度。

圖1 不同消解溫度對花生蛋白質(zhì)含量的影響

2.2 不同硫酸用量對花生蛋白質(zhì)的影響

由圖2可知，在消解溫度為420 ℃、消解時(shí)間為1.5 h的條件下，隨著濃硫酸用量的增加，花生蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)增加的趨勢，當(dāng)濃硫酸加入量在10 mL以上時(shí)，花生蛋白質(zhì)的含量基本穩(wěn)定。如果濃硫酸用量少，會導(dǎo)致花生樣品無法完全分解，測定結(jié)果可能偏低[4-5]；如果用量過多，會造成試劑浪費(fèi)并產(chǎn)生環(huán)境污染。因此，選擇10 mL為硫酸的最適用量。

圖2 不同硫酸用量對花生蛋白質(zhì)的影響

2.3 不同消解時(shí)間對花生蛋白質(zhì)的影響

由圖3可知，在消解溫度為420 ℃、濃硫酸用量為10 mL的條件下，消解時(shí)間為1.5 h時(shí)，花生蛋白質(zhì)的含量明顯高于消解時(shí)間為0.5 h時(shí)的含量，略高于消解2.0 h的花生蛋白質(zhì)含量。當(dāng)消解時(shí)間為2.5 h時(shí)，花生蛋白質(zhì)的含量下降。消解時(shí)間對花生蛋白質(zhì)含量的影響很大，如果消解時(shí)間太短，消解液體并不呈綠色透明狀，而是呈黑色；消解時(shí)間過長，會造成氮的流失，因此最適宜消解時(shí)間為1.5 h。

圖3 不同消解時(shí)間對花生蛋白質(zhì)的影響

2.4 空白試驗(yàn)、回收試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)的測定結(jié)果

由表1可知，7次測定空白試樣的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定用量均值為0.097 mL。由表2可知，用全自動凱氏定氮儀進(jìn)行準(zhǔn)確性試驗(yàn)，7次回收試驗(yàn)測得硫酸銨基準(zhǔn)試劑的含氮量均值為21.15 g/100 g，硫酸銨回收率為99.8%；由表3可知，利用本文優(yōu)化后的試驗(yàn)條件，進(jìn)行精密度試驗(yàn)，7次平行測定花生平均值為22.14 g/100 g，RSD為0.16%，以上試驗(yàn)結(jié)果表明本文優(yōu)化后的測定方法具有較高的準(zhǔn)確性和精密度。

表1 空白試樣試驗(yàn)結(jié)果

表2 準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本文利用凱氏定氮法測定花生蛋白質(zhì)含量，分析不同條件對花生蛋白質(zhì)含量的影響。結(jié)果顯示，優(yōu)化后的試驗(yàn)條件為稱樣量0.3 g（精確至0.000 1 g），硫酸用量為10 mL，消解溫度設(shè)定為420 ℃，消解時(shí)間為1.5 h。通過回收試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)等結(jié)果可以看出，該方法適合花生蛋白質(zhì)的含量測定，為高效、準(zhǔn)確測定花生蛋白質(zhì)的含量提供參考。