基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)推測當(dāng)歸肉蓯蓉配伍治療功能性便秘的作用機(jī)制

宋蕊蕊

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 洛陽 471003）

功能性便秘（Functional constipation，F(xiàn)C）是全球高發(fā)疾病，指腸道功能紊亂導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)大便干結(jié)、排便難、次數(shù)減少或排便不盡等癥狀，屬中醫(yī)學(xué)“便秘”、“陽結(jié)”或“陰結(jié)”范疇。西醫(yī)治療存在易復(fù)發(fā)，副作用大，長期療效一般等缺點(diǎn)。中醫(yī)治療功能性便秘歷史悠久，方法多樣，主張辨證施治，整體調(diào)節(jié)臟腑氣血陰陽，祛邪不傷正，標(biāo)本兼治[1]。當(dāng)歸與肉蓯蓉是治療功能性便秘常用方濟(jì)川煎的主要組成藥物，二者也是數(shù)據(jù)挖掘治療便秘常用方的經(jīng)典藥物組合前三名[2]。當(dāng)歸-肉蓯蓉藥對溫腎益精，潤腸通便，可用于老年人、久病體虛、婦人產(chǎn)后、溫病后期等功能性便秘患者，但其作用機(jī)制尚不明確。此外，F(xiàn)C發(fā)病原因復(fù)雜，與飲食、生活習(xí)慣、自主神經(jīng)功能異常、藥物或年齡等相關(guān)，給其作用機(jī)制探討帶來更大困難。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合藥物、成分、作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)信息，多角度、多方面探索藥物和疾病之間的分子關(guān)聯(lián)，從而更好的揭示藥物治療疾病的分子機(jī)制[3]。尤其是在中醫(yī)藥研究中，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中醫(yī)整體觀不謀而合，從而探討中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療疾病的方式。本文借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討當(dāng)歸肉蓯蓉對FC的治療作用及機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，并為后期試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 當(dāng)歸-肉蓯蓉化學(xué)成分、對應(yīng)靶點(diǎn)和功能性便秘疾病靶點(diǎn)的篩選

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫（https://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索當(dāng)歸和肉蓯蓉的化學(xué)成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-like properties，DL）≥0.05作為條件，篩選當(dāng)歸和肉蓯蓉的活性成分?；赥CMSP、STITCH（http://stitch.embl.de/）等數(shù)據(jù)庫收集當(dāng)歸-肉蓯蓉活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)，并于Uniport（https://www.uniprot.org /）數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換基因名，去重。

GeneCards數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards.org）檢索“functional constipation”，獲得FC疾病靶點(diǎn)。

1.2 藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和生物信息學(xué)分析

采用Cytoscape 3.7.0軟件進(jìn)行“當(dāng)歸-肉蓯蓉-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”的構(gòu)建，以度（degree）≥6為閾值篩選，得到“當(dāng)歸-肉蓯蓉-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”。DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行當(dāng)歸-肉蓯蓉成分靶點(diǎn)的基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。

1.3 藥物-活性成分-共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

收集當(dāng)歸、肉蓯蓉活性成分和FC疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)，稱共有靶點(diǎn)，Cytoscape 3.7.0軟件構(gòu)建“當(dāng)歸-肉蓯蓉-活性成分-FC共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”。

1.4 關(guān)鍵基因篩選和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

于STRING數(shù)據(jù)庫（https://string- db.org/）檢索共有靶點(diǎn)，收集蛋白互作信息，CytoNCA插件基于點(diǎn)度中心性（Degree Centrality，DC）、接近中心性（Closeness Centrality，CC）、中介中心性（Betweenness Centrality，BC）篩選關(guān)鍵基因，進(jìn)行關(guān)鍵基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（Protein-Protein Interaction Networks，PPI）構(gòu)建[4]。

1.5 當(dāng)歸-肉蓯蓉治療FC的關(guān)鍵基因生物信息學(xué)分析

DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行當(dāng)歸-肉蓯蓉治療FC的關(guān)鍵基因的GO功能和KEGG通路富集分析，GO功能富集分析以P＜0.01，count≥5為閾值，KEGG通路富集分析以P＜0.01且count≥10為閾值。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸-肉蓯蓉的活性成分收集

共檢索到當(dāng)歸化學(xué)成分125個(gè)，肉蓯蓉化學(xué)成分75個(gè)。其中，OB≥30%和DL≥0.05的當(dāng)歸活性成分25個(gè)，肉蓯蓉13個(gè)。最終得到無重復(fù)且有相應(yīng)靶標(biāo)的活性成分39個(gè)，見表1。

表1 當(dāng)歸和肉蓯蓉的主要活性成分

2.2 藥物活性成分靶點(diǎn)和FC疾病靶點(diǎn)的收集

數(shù)據(jù)庫收集到當(dāng)歸活性成分相關(guān)靶點(diǎn)56個(gè)，肉蓯蓉活性成分相關(guān)靶點(diǎn)143個(gè)，交集靶點(diǎn)16個(gè)。FC疾病靶點(diǎn)5199個(gè)，其中，Relevance score≥3的靶點(diǎn)為2428個(gè)。當(dāng)歸、肉蓯蓉與FC三者交集靶點(diǎn)13個(gè)，當(dāng)歸-肉蓯蓉藥物靶點(diǎn)與FC疾病靶點(diǎn)交集靶點(diǎn)132個(gè)，見圖1。

圖1 藥物與疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 當(dāng)歸-肉蓯蓉的藥物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和生物信息學(xué)分析

“當(dāng)歸-肉蓯蓉-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”包含276個(gè)節(jié)點(diǎn)和330條邊。網(wǎng)絡(luò)中，當(dāng)歸-肉蓯蓉共有活性成分β-谷甾醇，肉蓯蓉活性成分槲皮素，當(dāng)歸活性成分豆甾醇、阿魏酸、菖蒲二烯等degree值高，提示這些成分可能為當(dāng)歸-肉蓯蓉配伍中的主要有效成分。

前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶（Prostaglandin G/H synthase and cyclooxygenase，PTGS2、PTGS1）、γ氨基丁酸A受體（Gamma-Aminobutyric Acid Type A Receptor Subunit Alpha1，GABRA1）、毒蕈堿型膽堿受體（Muscarinic Acetylcholine receptor，CHRM2、CHRM1、CHRM3）、去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體基因（Sodium-dependent noradrenaline transporter，SLC6A2）、細(xì)胞腫瘤抗原p53（Cellular tumor antigen p53，TP53）、半胱氨酸蛋白酶（Caspase，CASP）和分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）等靶點(diǎn)的degree值較高，提示這些靶點(diǎn)可能在當(dāng)歸-肉蓯蓉配伍中起主要作用，網(wǎng)絡(luò)中degree值排名前20的當(dāng)歸-肉蓯蓉相關(guān)成分和靶點(diǎn)見表2。對當(dāng)歸-肉蓯蓉的靶點(diǎn)富集分析結(jié)果顯示，藥對靶點(diǎn)的GO功能主要富集在細(xì)胞外空間、質(zhì)膜組成、核質(zhì)等細(xì)胞成分，酶結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性等分子功能，炎癥反應(yīng)、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、血管收縮的正向調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程，均與FC疾病機(jī)制相關(guān)，提示當(dāng)歸-肉蓯蓉藥對可用于FC等胃腸道疾病的治療，見圖2。

圖2 當(dāng)歸-肉蓯蓉藥物靶點(diǎn)GO功能富集結(jié)果

表2 當(dāng)歸-肉蓯蓉-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)重要節(jié)點(diǎn)

2.4 當(dāng)歸-肉蓯蓉治療FC的藥物-活性成分-共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵基因篩選

“當(dāng)歸-肉蓯蓉-活性成分-FC共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”共有146個(gè)節(jié)點(diǎn)和226條邊。β-谷甾醇、槲皮素、豆甾醇、阿魏酸等成分的degree值高。PTGS2、PTGS1、GABRA1、CHRM2、CHRM1、CHRM3和SLC6A2等靶點(diǎn)的degree值較高，提示這些靶點(diǎn)可能在當(dāng)歸-肉蓯蓉治療FC中起主要作用，見圖3。CytoNCA插件按DC≥44、CC≥48.415613、BC≥0.517432975為閾值篩選，最終得到關(guān)鍵基因74個(gè)，PPI網(wǎng)絡(luò)有節(jié)點(diǎn)74個(gè)，邊1334條。AKT蛋白激酶（Threonine-protein kinase，AKT1）、血管內(nèi)皮生長因子A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）、轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor Jun，JUN）、TP53、CASP和MAPK等節(jié)點(diǎn)degree值大，結(jié)合分?jǐn)?shù)高，在網(wǎng)絡(luò)最中心，預(yù)測為當(dāng)歸-肉蓯蓉治療FC的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)，見圖4。

圖3 當(dāng)歸-肉蓯蓉-活性成分-FC共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（節(jié)點(diǎn)大小與degree值成正比）

圖4 當(dāng)歸-肉蓯蓉治療FC的關(guān)鍵基因PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 當(dāng)歸-肉蓯蓉治療FC的關(guān)鍵基因的生物信息學(xué)分析

關(guān)鍵基因GO分析的結(jié)果可知，當(dāng)歸、肉蓯蓉配伍治療功能性便秘的機(jī)制多與缺氧的反應(yīng)、RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、類固醇激素受體活性等多個(gè)生物過程和分子功能有關(guān)，見圖5。KEGG 通路主要有TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、PI3KAkt 信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，見圖6。

圖5 GO功能富集分析

圖6 KEGG通路分析

3 討論

FC多與患者生活習(xí)慣、精神因素、腸道菌群失調(diào)、胃腸激素和神經(jīng)遞質(zhì)異常等有關(guān)，病程長且治療難度大[5]。西醫(yī)藥物治療存在療效欠佳，易引起復(fù)發(fā)，易形成依賴性等缺點(diǎn)[6]。中醫(yī)用以活血養(yǎng)血、滋陰補(bǔ)陽、疏肝健脾、潤腸通便的中藥，改善患者陰虛血虛、肝氣郁結(jié)、脾胃不和等狀態(tài)[7]。當(dāng)歸-肉蓯蓉為治療FC常見藥對，當(dāng)歸滋陰生血，補(bǔ)血活血，潤腸通便；肉蓯蓉補(bǔ)腎壯陽，滋陰養(yǎng)血，軟堅(jiān)通便。二者配伍，行中有補(bǔ)，補(bǔ)而不峻，起到調(diào)肝養(yǎng)血，潤腸通便的功效。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)進(jìn)行了當(dāng)歸-肉蓯蓉藥對配伍治療FC作用機(jī)制。的

最終收集到當(dāng)歸-肉蓯蓉藥對活性成分39個(gè)，成分相關(guān)靶點(diǎn)237個(gè)，F(xiàn)C疾病靶點(diǎn)2428個(gè)。其中，當(dāng)歸-肉蓯蓉藥對靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)132個(gè)，篩選到關(guān)鍵基因74個(gè)。β-谷甾醇、槲皮素、豆甾醇、阿魏酸等成分可能是藥對治療FC的活性成分，β-谷甾醇為當(dāng)歸-肉蓯蓉的共有活性成分，具有抗炎、抗氧化、抑菌等作用[8]。研究表明，β-谷甾醇和豆甾醇可改善小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎，保護(hù)大鼠胃和十二指腸，預(yù)防消化性潰瘍[9]。改善功能性便秘可通過減少炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)[10]。PTGS與胃腸道功能關(guān)系密切，是炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)[11]。PTGS2在慢性和急性炎癥反應(yīng)中明顯上調(diào)，可加重胃腸道毒性。在機(jī)械性腸梗阻模型中，表達(dá)上調(diào)甚至誘發(fā)結(jié)直腸癌發(fā)病[12]。AKT1依賴PI3K途徑激活，對PI3K-AKT 通路的激活，可影響腸道傳輸功能從而參與功能性便秘、慢性傳輸性便秘等多種便秘[13]。

TP53信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路已被報(bào)道與功能性便秘發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[14-15]。MAPK信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)水通道蛋白的表達(dá)，促進(jìn)水分運(yùn)輸，調(diào)節(jié)慢性傳輸型便秘大鼠結(jié)腸水代謝平衡[16]。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸-肉蓯蓉可能通過β-谷甾醇、豆甾醇、阿魏酸等關(guān)鍵活性成分，作用于PTGS2、AKT1、TP53、CASP和MAPK等核心靶點(diǎn)，參與TNF信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，發(fā)揮其多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療FC的作用，為深入研究其作用機(jī)制提供了理論依據(jù)和思路。