一例HP-PRRSV 與NADC30-like 毒株混合感染的實驗室診斷

王祝榮，熊連，文敏華

（1.湖南省長沙市雨花區(qū)農業(yè)農村局，湖南 長沙 410013；2.瀏陽市農業(yè)農村局，湖南 瀏陽 410300）

豬繁殖障礙綜合征病毒（PRRSV）感染可導致豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），該病又稱為豬藍耳病，該病的流行對全世界養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展造成巨大的威脅。PRRSV 感染主要導致高熱和呼吸困難（仔豬）、繁殖障礙（妊娠母豬）、呼吸道癥狀和生長遲緩（育肥豬）等。此外，該病可導致豬群免疫抑制，不但影響疫苗免疫效果，同時使豬群對其他病原更加易感，繼而導致更嚴重的臨床癥狀和病死率[1-2]。

2006 年，國內南方各省部分豬場相繼暴發(fā)豬高熱?。ò殡S高病死率），進一步分析發(fā)現(xiàn)其病原為PRRSV 變異株（HP-PRRSV），與2006 年之前流行的PRRSV 經典株相比，變異株Nsp2 基因存在特征性氨基酸序列缺失[3]。2013 年，國內部分豬場開始流行類NADC30 株，該毒株Nsp2 基因序列存在131 個不連續(xù)氨基酸缺失，且目前該毒株在我國廣泛流行[4]。2017 年，我國東北部分豬場開始流行類NADC34 株，該毒株Nsp2 基因存在100 個氨基酸缺失[5]。多種基因型PRRSV 在我國廣泛流行，導致部分豬場同時流行多種基因型PRRSV 十分常見，進而使得該病的防控與凈化更加困難。

2022 年10 月中旬，湖南長沙某規(guī)?；i場暴發(fā)疑似PRRS 疫情，經實驗室診斷確定該病由HP-PRRSV 和類NADC30 株混合感染引起，該診斷結果為豬場PRRS 的防治提供了科學依據(jù)。

1 發(fā)病豬場情況

湖南長沙某規(guī)?；i場存欄母豬千余頭，2022年10 月初，該場部分妊娠母豬出現(xiàn)疑似繁殖與呼吸綜合征，由于該場長期使用PRRSV 弱毒疫苗防控PRRS，豬場負責人認為妊娠母豬流產可能是豬群免疫弱毒疫苗所致。10 月中旬，該場仔豬和保育豬陸續(xù)開始發(fā)病，主要臨床癥狀包括高熱、咳嗽和呼吸困難等，病死率近40%。為確診病因，剖檢發(fā)病仔豬，采集部分臟器（肺臟、腎臟和淋巴結）和流產胎兒送至我處進行病原檢測。

2 實驗室診斷

2.1 細菌分離鑒定結果

超凈工作臺下，用滅菌手術刀切取少量肺臟、肺臟和淋巴結組織樣品于研缽內，加入少量滅菌生理鹽水后，研磨后用滅菌紗布過濾研磨液，將濾液置于潔凈離心管內。用滅菌接種環(huán)蘸取少量濾液,分別在普通固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和鮮血固體瓊脂培養(yǎng)基平板劃線，其后將平板倒扣在37℃恒溫箱內，16 h 后檢測兩種培養(yǎng)基表面是否存在疑似菌落。結果發(fā)現(xiàn)，兩種培養(yǎng)基表面均未出現(xiàn)疑似菌落，提示豬群發(fā)病并非細菌性病原感染引起。

2.2 病毒性病原檢測結果

為探究該場暴發(fā)疫病是否由病毒性病原感染引起，采用商業(yè)化核酸提取試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司產品）提取組織上清DNA 和RNA 基因組。應用商業(yè)化病原檢測試劑盒（湖南冠牧生物科技有限公司產品），采用qPCR 法分別檢測樣品DNA 基因組中是否存在豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、豬圓環(huán)病毒Ⅲ型和豬偽狂犬病毒核酸；采用RT-qPCR 法分別檢測樣品RNA 基因組中是否存在豬瘟病毒、豬細小病毒、不同基因型PRRSV（經典株、HP-PRRSV 和類NADC30 株）等常見RNA 病毒核酸。病原檢測步驟和結果判定標準均嚴格按照試劑盒說明書進行。最后結果顯示，病料樣品為HP-PRRSV 和類NADC30 株核酸陽性，其他病原核酸均為陰性。

2.3 HP-PRRSV 和類NADC30 株Nsp2 基因RTPCR 擴增與序列分析

為分析該豬場流行HP-PRRSV 和類NADC30株遺傳變異情況，以商業(yè)化試劑盒將RNA 基因組逆轉錄為cDNA。設計并合成靶向擴增PRRSV Nsp2基因引物，采用RT-PCR 法擴增病料樣品cDNA 基因組PRRSV Nsp2 基因序列。反應體系（25.0 μL）包括2×PCR 預混液12.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、cDNA 模板2.0 μL 和無RNA 酶水9.5 μL；反應條件為94℃5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，共35 個循環(huán)；最后為72℃5 min。反應結束后將RT-PCR 產物進行瓊脂凝膠電泳。結果如圖1 所示，靶向HP-PRRSV Nsp2 基因序列RT-PCR 產物大小約750 bp，靶向類NADC30 株對應序列產物大小約為450 bp，且陰性和陽性對照均成立，提示我們成功擴增獲得該場HP-PRRSV 和類NADC30 流行株Nsp2 基因部分序列。其后，分別切取750 bp 和450 bp 處凝膠，凝膠回收獲得RT-PCR 產物基因組，將其送至生物公司測序。

圖1 臨床樣品PRRSV Nsp2 基因部分序列RT-PCR產物凝膠電泳結果

測序結果返回后，將測序結果與NCBI 參考序列進行核苷酸序列比對。結果發(fā)現(xiàn)，該場流行HP-PRRSV 株與NCBI 收錄的HP-PRRSV 弱毒疫苗株（HuN4-F112）同源性最高，流行的類NADC30株則與NCBI 收錄的已知NADC30 株同源性最高。以上結果再次確定該場疫情是由HP-PRRSV 和類NADC30 株混合感染所致。

3 討論

自2006 以來，HP-PPRSV 廣泛流行給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經濟損失，近年來PRRSV 其他基因亞型（如類NADC30 和類NADC34 株）的流行也引起了養(yǎng)豬業(yè)廣泛的關注。同一地區(qū)流行多種基因亞型PRRSV 株十分常見，如河北省同時流行類NADC34、類NADC30、HP-PRRSV 和PRRSV 經典株等亞型[6]，這導致同一豬場流行多種基因亞型PRRSV 株也時常發(fā)生[7]?？蓪е氯焉锬肛i繁殖障礙的病原種類繁多，傳統(tǒng)的臨床診斷無法對病原進行確診，甚至因誤診或漏診延誤疾病的治療，導致巨大的經濟損失。實驗室診斷技術（如細菌分離鑒定和PCR 法）可在短時間內確診致病原，甚至對部分病原可進行基因分型和遺傳進化分析，這有利于疾病的防控和疫苗選擇。

在本案例中，筆者采用實驗室相關技術對一例疑似PRRS 案例進行診斷，發(fā)現(xiàn)采集病料樣本為HP-PPRSV 和類NADC30 核酸陽性，其他病毒性病原和細菌性病原均為陰性，提示該場所發(fā)生疫情是由HP-PRRSV 和類NADC30 混合感染引起。值得注意的是，首先，豬場獸醫(yī)在初期已對發(fā)病豬群進行抗生素治療，盡管沒有檢測到細菌性病原，但不能確定該場未出現(xiàn)細菌性病原繼發(fā)感染；其次，該場處于PRRSV 不穩(wěn)定場，故而該場長期使用PRRSV 弱毒疫苗（HuN4-F112 株）防控PRRS，雖然病原檢測結果發(fā)現(xiàn)病料中存在HP-PRRSV 和類NADC30 核酸，尚不能判斷HP-PRRSV 是野毒還是疫苗毒株。

HP-PRRSV 和類NADC30 株ORF5 基因氨基酸序列大小基本一致，但類NADC30 株Nsp2 基因較HP-PRRSV 少131 個氨基酸，因此可采用RT-PCR 法擴增Nsp2 基因區(qū)分HP-PRRSV 和類NADC30 株[7]。在本文中，我們采用RT-PCR 擴增同一份病料HP-PRRSV 和類NADC30 株Nsp2 基因序列，發(fā)現(xiàn)HP-PRRSV 和類NADC30 株對應RT-PCR 產物大小分別約為750 bp 和450 bp，其后切膠回收后將產物分別測序與序列分析。發(fā)現(xiàn)該場檢測的HP-PRRSV 株Nsp2 基因序列與弱毒疫苗株（HuN4-F112 株）同源性最高，提示其可能為弱毒疫苗株。

近年來，類NADC30 株在國內流行情況逐漸嚴重，已有研究證實基于HP-PRRSV 研發(fā)的弱毒疫苗對類NADC30 防控能力有限，因此豬場應該謹慎選擇HP-PRRSV 弱毒疫苗用于類NADC30 株的防控。對于PRRSV（包括類NADC30 株）的防控應選擇提高豬場生物安全水平、后備母豬馴化和PRRSV 陽性豬群淘汰等策略[7]。

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