PAD4 介導(dǎo)的瓜氨酸化組蛋白在中耳炎發(fā)病進(jìn)程中的機(jī)制研究

阿不拉江·托合提,程秀琴,古麗波斯坦·買買提艾力（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，新疆 烏魯木齊 830001）

中耳炎在全世界范圍內(nèi)被認(rèn)為是耳鼻咽喉科最常見的疾病之一，可分為急性中耳炎和慢性中耳炎[1]。其中慢性化膿性中耳炎（chronic suppurative otitis media，CSOM）作為慢性中耳炎的一種，其主要特征是持續(xù)性且嚴(yán)重的耳溢液，且病程通常在6 個(gè)月以上[2]，但是關(guān)于CSOM的發(fā)病機(jī)制仍缺乏進(jìn)一步的研究。

瓜氨酸化組蛋白3（citrullinated histone H3，CitH3）指肽鏈中的精氨酸殘基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸后的組蛋白，是一種表觀遺傳修飾后的產(chǎn)物，廣泛存在于免疫和炎癥相關(guān)的疾病中[3]。Makrygiannakis 等[4]通過免疫組織化學(xué)檢查了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肌炎、扁桃體炎和炎癥性腸病的活檢組織，發(fā)現(xiàn)炎癥組織中的瓜氨酸的蛋白水平顯著增加。Morita 等[5]在中耳炎患者的中耳液中檢測(cè)到了CitH3，并發(fā)現(xiàn)其與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，表明CitH3 可能參與了CSOM 的發(fā)生發(fā)展。肽精酰基精氨酸脫亞胺酶4(peptidyl arginine deimidase 4，PAD4)可將精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸，其主要定位于細(xì)胞核并靶向組蛋白H3、H2A 和H4，對(duì)其進(jìn)行瓜氨酸化[6]。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，PAD4 通過驅(qū)動(dòng)細(xì)胞因子失調(diào)，促進(jìn)炎癥發(fā)生，并增加瓜氨酸化自身抗原的產(chǎn)生，從而加快疾病的發(fā)展[7]。然而，PAD4 是否可通過介導(dǎo)CitH3的生成來參與中耳炎的發(fā)病進(jìn)程尚不清楚。

本研究通過檢測(cè)中耳炎患者耳組織中的PAD4 與CitH3 水平，并構(gòu)建CSOM 小鼠模型，初步評(píng)估PAD4、CitH3 與CSOM 的相關(guān)性，探索PAD4 是否通過介導(dǎo)CitH3 形成而影響CSOM 的發(fā)病進(jìn)程，以期為CSOM 的預(yù)防及治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

選取于我院耳鼻咽喉診療中心接受中耳手術(shù)治療的30 例CSOM 患者和30 例非中耳炎患者為研究對(duì)象。非中耳炎納入標(biāo)準(zhǔn)：耳硬化或聽骨鏈畸形需行聽骨鏈重建術(shù)；雙側(cè)重度感音神經(jīng)性耳聾進(jìn)行聽覺植入手術(shù)，主要行人工耳蝸植入術(shù)；無中耳炎史，且術(shù)前超薄顳骨斷層CT 掃描顯示中耳及乳突氣房無任何可疑感染病灶；術(shù)前耳內(nèi)鏡檢查鼓膜完整，無內(nèi)陷及鼓膜感染。CSOM 納入標(biāo)準(zhǔn)：有慢性持續(xù)間斷的流膿病史，伴或不伴聽力下降、耳鳴、眩暈等不適，并經(jīng)耳內(nèi)鏡檢查證實(shí)，出現(xiàn)復(fù)發(fā)性耳流膿性分泌物超過6 個(gè)月。將術(shù)中取材的中耳肉芽組織立即置于液氮冷凍，置于-80 ℃冰箱保存。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（KY20220429117），所有患者或家屬簽署研究知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性BALB/c 小鼠30 只（6～8 周齡，20～25 g）購自新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（新）2021-0001。所有小鼠于室溫、自然光暗周期的環(huán)境中飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間自由飲食、飲水。

1.3 主要試劑

脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）購自上海生物制劑公司，烏拉坦購自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司，PAD4 抑制劑cl-amidine 購自美國MedChemExpress 公司，ELISA 檢測(cè)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，BCA 檢測(cè)試劑盒、TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green 試劑購自上海翌圣公司，qRT-PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成，PAD4 抗體、CitH3 抗體、p-P65、P65、GAPDH抗體購自英國Abcam公司，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體購自上海白鯊生物科技有限公司，RIPA組織細(xì)胞快速裂解液購自北京索萊寶科技有限公司，ECL試劑盒購自美國Millipore公司。

1.4 方法

1.4.1 CSOM小鼠模型的構(gòu)建與治療 隨機(jī)將30只小鼠分為對(duì)照組、模型組和給藥組，每組10 只。對(duì)照組不造模，模型組和給藥組采用鼓室內(nèi)少量多次注射LPS 制備CSOM小鼠模型：采用20%烏拉坦5 mL/kg進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉后，將15 μL的0.1 mg/mL LPS 經(jīng)小鼠右中耳鼓膜前下方注入鼓室；24 h 后再次進(jìn)行麻醉，注入15 μL的0.3 mg/mL LPS；24 h后注射15 μL的0.5 mg/mL LPS。小鼠正常喂養(yǎng)3 d 后，以耳內(nèi)鏡觀察鼓膜情況，鼓膜破裂并見積液征則表示造模成功。建模成功后，給藥組每日中耳注射5 mg/kg cl-amidine，模型組和對(duì)照組注射等量生理鹽水。

1.4.2 聽性腦干反應(yīng)測(cè)試 小鼠完全麻醉后，將電極置于兩耳間連線中點(diǎn)，參考電極插于給聲耳垂下，地線插于對(duì)側(cè)耳垂下，電極之間阻抗小于3kΩ。采用美國TDT公司TDTⅢ設(shè)備給聲并采集信號(hào)。刺激聲為click 聲，強(qiáng)度10～90 dBHL，衰減間隔10 dB，在接近閾值時(shí)，衰減間隔5 dBHL。以出現(xiàn)較為明確的Ⅲ波作為反應(yīng)測(cè)試的閾值。

1.4.3 Western blot檢測(cè)PAD4、CitH3、p-P65和P65蛋白表達(dá) 提取患者和小鼠中耳組織中的總蛋白，利用BCA 試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度。SDS-PAGE 分離蛋白，之后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，脫脂牛奶封閉1 h，分別加入兔抗鼠PAD4（1∶800）、p-P65（1∶1 000）、P65（1∶1 000）、CitH3（1∶200）和GAPDH (1∶5 000)，4 ℃孵育過夜，加入山羊抗兔二抗于37 ℃孵育1 h 后曝光顯影，并使用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.4.4 ELISA檢測(cè)血清中PAD4、CitH3、IL-6和TNF-α含量 血漿樣本制備：分別采集患者與小鼠的全血樣本，置于抗凝管中，隨后于4 ℃以3 000 r/min 離心10 min，取離心后的上清即為血漿樣品。根據(jù)試劑盒說明書，檢測(cè)患者與小鼠血清PAD4、CitH3、IL-6 和TNF-α含量。將標(biāo)準(zhǔn)品工作液和待測(cè)樣品加入樣品孔中，將覆膜覆在酶標(biāo)板上，輕輕晃動(dòng)混勻，37 ℃孵育20 min；棄去酶標(biāo)板中液體，洗滌液洗滌5次，每次30 s，拍干，除空白孔，每孔加入酶標(biāo)抗體，蓋上覆膜，37 ℃孵育30 min，棄去液體，洗滌液洗滌5 次，每次30 s，拍干；在樣品孔中加入顯色劑A、B，蓋上覆膜，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光孵育10 min；加入終止液終止反應(yīng)，立即用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長處吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)應(yīng)吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)樣品吸光度計(jì)算樣品相應(yīng)濃度。

1.4.5 qRT-PCR檢測(cè)耳組織中IL-6、TNF-α mRNA表達(dá) 采用TRIzol 提取各組細(xì)胞總RNA。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)總RNA的純度和含量。按照qRT-PCR試劑盒說明書依次進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性7 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 15 s，循環(huán)40 個(gè)周期。IL-6 引物序列：正向5'-CTGC AAGAGACTTCCATCCAG-3'，反向5'-AGTGGTATAGA CAGGTCTGTTGG-3'；TNF-α 引物序列：正向5'-CTGA ACTTCGGGGTGATCGG-3'，反向5'-GGCTTGTCACTC GAATTTTGAGA-3'；GAPDH 的引物序列：正向5'-AG GTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，反向5'-TGTAGACC ATGTAGTTGAGGTCA-3'。采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0 軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。使用Spearman法進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CSOM患者PAD4和CitH3表達(dá)上調(diào)

Western blot 結(jié)果顯示，與非中耳炎患者比較，CSOM 患者耳組織中PAD4、CitH3 蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。ELISA 結(jié)果顯示，與非中耳炎患者比較，CSOM 患者血清中PAD4、CitH3濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2a、b。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CSOM 患者血清中PAD4和CitH3濃度呈正相關(guān)（R=0.363 6，P=0.000 4），見圖2c。

圖1 非中耳炎患者和CSOM患者耳組織中PAD4、CitH3表達(dá)水平比較

圖2 非中耳炎患者和CSOM患者血清中PAD4和CitH3含量情況

2.2 抑制PAD4緩解CSOM小鼠癥狀

聽性腦干反應(yīng)測(cè)試結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組聽性腦干反應(yīng)閾值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組聽性腦干反應(yīng)閾值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 小鼠聽性腦干反應(yīng)閾值比較

2.3 抑制PAD4降低CitH3表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組耳組織中PAD4、CitH3 蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組耳組織中PAD4、CitH3 蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖4。ELISA 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組血清中PAD4、CitH3 濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組血清中PAD4、CitH3 濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

圖4 小鼠耳組織中PAD4、CitH3表達(dá)水平比較

圖5 小鼠血清中PAD4、CitH3含量比較

2.4 抑制PAD4減輕CSOM小鼠炎癥反應(yīng)

qRT-PCR 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組耳組織中IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組耳組織中IL-6、TNF-α mRNA 表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖6。ELISA 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組血清中IL-6、TNF-α 含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組血清中IL-6、TNF-α濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖7。

圖6 小鼠耳組織IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)比較

圖7 小鼠血清中IL-6、TNF-α含量比較

2.5 抑制PAD4拮抗CSOM小鼠NF-κB信號(hào)通路

Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組耳組織中p-P65/P65 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組耳組織中p-P65/P65蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖8。

圖8 小鼠耳組織中p-P65蛋白激活水平比較

3 討論

中耳炎的病程遷延，可引起注意力、認(rèn)知感及聽力下降，從而影響患者生活質(zhì)量，嚴(yán)重者會(huì)引起顱內(nèi)外并發(fā)癥甚至危及生命[8-9]。CSOM 患者鼓膜穿孔后，膿液一方面侵蝕聽骨鏈聽小骨，聽骨鏈骨質(zhì)破壞引起傳導(dǎo)性耳聾，另一方面膿液也會(huì)循內(nèi)耳圓窗破壞內(nèi)耳的微細(xì)結(jié)構(gòu)，造成感音神經(jīng)性聾[10]。目前關(guān)于CSOM的標(biāo)準(zhǔn)治療雖然已經(jīng)有了多種方案，但無論手術(shù)治療還是保守治療，約有41%患者經(jīng)過各種內(nèi)外科治療后耳溢液仍然持續(xù)存在,因此迫切需要發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物用于臨床療法的開發(fā)[11]。

CitH3 與多種炎癥疾病的形成有關(guān)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[12]。PAD4作為脒基轉(zhuǎn)移酶超家族的成員，可以催化組蛋白H3 的精氨酸殘基瓜氨酸化[13]。有研究表明，CitH3是一種常見的炎癥疾病標(biāo)志物，細(xì)胞外CitH3 表現(xiàn)出高毒性，引起組織損傷，可能導(dǎo)致多器官衰竭并最終導(dǎo)致患者死亡。本研究結(jié)果顯示，CSOM 患者的中耳液和血清中PAD4 和CitH3 含量增加，且二者表達(dá)呈正相關(guān)，表明PAD4 和CitH3 參與了CSOM 的發(fā)展，并提示PAD4 可能介導(dǎo)CitH3的形成。

有研究發(fā)現(xiàn)，引發(fā)CSOM 的致病菌主要是革蘭氏陰性菌[14]，其產(chǎn)物L(fēng)PS 可加劇CSOM 的發(fā)病與病程進(jìn)展。80%的中耳滲液中可發(fā)現(xiàn)LPS[15]。cl-amidine是一種PAD4 抑制劑，可以抑制PAD4 的酶活性，降低細(xì)胞中CitH3 水平[16]。本研究通過少量多次向小鼠鼓室內(nèi)注射LPS 構(gòu)建CSOM 模型，然后通過中耳注射5 mg/kg cl-amidine 抑制PAD4 酶活性，結(jié)果表明，cl-amidine 治療可以緩解CSOM 小鼠癥狀，恢復(fù)聽力，并降低中耳組織和血清中CitH3 的水平，表明PAD4 可以通過促進(jìn)CitH3形成而加重CSOM的發(fā)展。

CSOM 的病因較多，其發(fā)病率可能受傳染性病原體變異、宿主解剖結(jié)構(gòu)和免疫狀態(tài)的影響[17]。在分子水平上，CSOM 是由促炎轉(zhuǎn)錄因子激活、炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生和釋放，黏液分泌增加、黏膜增生、白細(xì)胞浸潤中耳腔等一系列復(fù)雜的生理過程驅(qū)動(dòng)[18]。研究報(bào)道，NF-κB可通過刺激因子（病毒、腫瘤壞死因子、B細(xì)胞活化因子、淋巴毒素等）的活化誘導(dǎo)多種基因的表達(dá)，產(chǎn)生IL-6、TNF-α等多種細(xì)胞因子，參與炎癥反應(yīng)[19]。IL-6、TNF-α 作為促炎細(xì)胞因子，均參與了細(xì)菌性和非細(xì)菌性急性中耳炎的持續(xù)炎癥過程[20]。Zhao 等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，抑制PAD4可通過調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞核p65定位來保護(hù)LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷。而本研究結(jié)果顯示，使用cl-amidine 抑制PAD4 后，p-P65 蛋白表達(dá)受到抑制，cl-amidine 治療可以降低CSOM 小鼠耳組織與血清中的IL-6、TNF-α 水平，緩解炎癥反應(yīng)。因此，PAD4 介導(dǎo)CitH3 生成可能通過活化NF-κB 信號(hào)通路，增加炎癥信號(hào)因子來加重CSOM 進(jìn)程，但具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，CSOM 患者血清中PAD4 與CitH3 含量增加，且呈正相關(guān)，PAD4 通過介導(dǎo)CitH3 形成加重了CSOM，抑制PAD4 酶活性可顯著降低CitH3 的表達(dá)水平，并通過抑制NF-κB 信號(hào)通路抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。以上結(jié)果初步明確了PAD4 介導(dǎo)CitH3 形成在CSOM 中的作用，可為進(jìn)一步探索CSOM 的治療提供新的思路。