甲哌鎓原藥及其制劑的高效液相親水色譜分析

王東連，張 杰，嚴(yán)艷倫，姜治國

(云南云大科技農(nóng)化有限公司，云南 昆明 650000)

甲哌鎓，ISO通用名稱：mepiquat chloride。其他中文名稱：助壯素、縮節(jié)胺、調(diào)節(jié)啶、甲哌啶、壯棉素、縮節(jié)靈?；瘜W(xué)名稱：N，N-二甲基哌啶鎓氯化物。分子式：C7H16NCl。相對分子質(zhì)量：149.66 (按2007年相對原子質(zhì)量計)。具有植物生長調(diào)節(jié)作用。22.5% 28-表蕓·甲哌鎓水劑是由甲哌鎓、28-表高蕓苔素內(nèi)酯復(fù)配而成的棉花株鈴調(diào)控劑。藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲哌鎓和28-表高蕓苔素內(nèi)酯復(fù)配后可顯著促進(jìn)根系生長，健株穩(wěn)長、塑造株型、改善葉片功能和群體結(jié)構(gòu)，最終達(dá)到優(yōu)化成鈴結(jié)構(gòu)、增加鈴數(shù)和鈴重的功效，對棉花增產(chǎn)有顯著的增效作用。本品用于調(diào)控棉花株型、防止蕾鈴脫落、提高產(chǎn)量，對于解決棉花生產(chǎn)中徒長和蕾鈴脫落的問題有廣闊的應(yīng)用前景。迄今為止，大多數(shù)文獻(xiàn)和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)所用的檢驗(yàn)方法大致為離子對色譜柱與電導(dǎo)檢測器結(jié)合、離子對試劑與反相色譜柱和紫外檢測器結(jié)合、電位滴定與紙層析結(jié)合、液質(zhì)聯(lián)用等?，F(xiàn)有檢測方法，大部分不能在色譜柱上很好的保留。電位滴定法又測定步驟多；花費(fèi)時間長；靈敏度低，對制劑產(chǎn)品的準(zhǔn)確性更差。經(jīng)查閱甲哌鎓化學(xué)結(jié)構(gòu)和相關(guān)性質(zhì)后，決定采用近幾年快速發(fā)展的親水色譜技術(shù)與VWD或DAD檢測器結(jié)合的方式進(jìn)行分離檢測。該色譜技術(shù)即使是強(qiáng)極性的化合物也能通過HILIC使用與反相HPLC相同的系統(tǒng)和溶劑實(shí)現(xiàn)分離，大大降低了極性分析的成本和工作量。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑和溶液 甲哌鎓標(biāo)準(zhǔn)品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%；22.5% 28-表蕓·甲哌鎓水劑：是由甲哌鎓、28-表高蕓苔素內(nèi)酯復(fù)配而成。乙腈：色譜純，飛世爾；乙酸銨：色譜純；試驗(yàn)用水：去離子水。

1.2 儀器 高效液相色譜儀(帶DAD檢測器)：安捷倫1260 II；色譜柱：默克ZIC?-HILIC，2.1×100 mm，3.5 μm；電子分析天平：梅特勒AB204-E；超聲波清洗機(jī)：新芝SB25-12DTD。

1.3 高效液相色譜操作條件 流動相：80%的乙腈+20%的25 mmol/L乙酸銨水溶液；流速：0.2 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣體積：2 μL；保留時間：約為4.18 min左右。

1.4 測定步驟

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取甲哌鎓標(biāo)準(zhǔn)樣品0.10 g(精確到0.000 2 g)，用80%的乙腈+20%的25 mmol/L乙酸銨水溶液溶解，并定容至25 mL容量瓶中。搖勻，超聲波脫氣15 min，過0.22 μm的尼龍膜至1.5 mL進(jìn)樣瓶中，備用。

1.4.2 原藥及制劑樣品溶液的配制

1.4.2.1 原藥測定溶液的配制 準(zhǔn)確稱取甲哌鎓原藥0.10 g(精確到0.000 2 g)，用80%的乙腈+20%的25 mmol/L乙酸銨水溶液溶解，并稀釋至25 mL容量瓶中，搖勻，超聲波脫氣15 min，過0.22 μm的尼龍膜至1.5 mL進(jìn)樣瓶中，備用。

1.4.2.2 水劑測定溶液的配制 用已測定甲哌鎓原藥按照工藝配方制成一個待測樣品，同時制備一個制劑空白。然后，準(zhǔn)確稱取含0.10 g甲哌鎓的水劑樣品(精確至0.000 2 g)于25 mL容量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲波脫氣，過濾備用。

1.4.3 測定 在上述色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后，先注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，計算各針峰面積，直至相鄰2針標(biāo)樣溶液峰面積變化<1.5%后，按照標(biāo)樣、試樣、試樣、標(biāo)樣的順序進(jìn)樣測定。

1.4.4 計算 將測得的2兩針試樣溶液以及試樣前后2針溶液中甲哌鎓的峰面積，分別進(jìn)行平均。甲哌鎓的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X1(%)按公式(1)進(jìn)行計算：

(1)

式中：

m1——標(biāo)準(zhǔn)品甲哌鎓的質(zhì)量，g；

m2——試樣的質(zhì)量，g；

P1——標(biāo)準(zhǔn)品甲哌鎓的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇 甲哌鎓屬于強(qiáng)極性化合物，在液相分離中使用反相柱或者陽離子柱，保留時間較短且易受到溶劑峰的干擾，很難達(dá)到分析定量的目的。其吸收最佳波長195 nm[1]，但195～220 nm處吸收較強(qiáng)。用安捷倫親水色譜柱發(fā)現(xiàn)波長增大靈敏度降低，柱壓變化較大，柱子耐用性明顯下降。且未得到高靈敏度，檢測波長選擇較低。后經(jīng)過調(diào)研，發(fā)現(xiàn)默克ZIC?-HILIC柱帶有PEEK內(nèi)襯[2]，能很好的降低極性化合物在柱子上的殘留。經(jīng)過多次試驗(yàn)，甲哌鎓在默克ZIC?-HILIC柱上不僅靈敏度高，而且在210 nm波長處也有很好的響應(yīng)及線性，同時也能排除低波長的溶劑效應(yīng)。所以將波長選擇為210 nm。親水色譜柱[2]，即使是強(qiáng)極性的化合物也能通過HILIC使用與反相HPLC相同的系統(tǒng)和溶劑實(shí)現(xiàn)分離，大大降低了極性分析的成本和工作量，且提高了分離度。此液相條件下分離，目標(biāo)物不受雜質(zhì)峰干擾。首先，用乙腈-水95+5→60+40做梯度看甲哌鎓在柱子上的保留情況。結(jié)果顯示保留較好。再次，用乙腈-水90+10和80+20兩個等度對目標(biāo)物進(jìn)行洗脫看保留時間。結(jié)果表明，當(dāng)80+20等度洗脫時能節(jié)約時間且與干擾峰很好地分離。第三，由于峰的對稱性較差，所以選擇加入緩沖鹽來改善峰型。首選甲酸銨與乙酸銨。本實(shí)驗(yàn)直接采用乙酸銨，在25 mmol/L濃度時能很好的得到保留和分離(圖1)。

圖1 甲哌鎓紫外光譜圖

2.2 分析方法線性相關(guān)性試驗(yàn) 標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣1～5 μL。在上述色譜條件下進(jìn)行測定，以進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)y，以峰面積為橫坐標(biāo)x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為y=0.002x-0.144 6，相關(guān)系數(shù)r=0.998 9[3]。甲哌鎓的線性相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)，線性關(guān)系(圖2)。

表1 線性相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 甲哌鎓線性關(guān)系圖

2.3 分析方法的精密度試驗(yàn) 在相同的色譜條件下，從同一產(chǎn)品中準(zhǔn)確稱取5個試樣，在上述色譜條件下進(jìn)行分析并求平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)，結(jié)果表明：甲哌鎓的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：0.209 6，變異系數(shù)為：0.89%(表2)。

表2 分析方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn) 試驗(yàn)采用產(chǎn)品空白制劑中添加已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的試樣5份，按照1.4進(jìn)行分析，結(jié)果表明：甲哌鎓的平均回收率為：99.8%(表3)。

表3 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 非分析物干擾的判定 在評價準(zhǔn)確度時，需要包含非分析物質(zhì)干擾試驗(yàn)，因?yàn)橹鷦┲械娜魏胃蓴_物質(zhì)都會導(dǎo)致分析方法出現(xiàn)偏差，分析時同時測定不帶助劑的原藥和空白樣品，證明其無干擾，并提交色譜圖。通過不加助劑的原藥色譜圖和空白樣品色譜圖判定，非分析物對有效成分不構(gòu)成干擾，相關(guān)非分析物質(zhì)干擾典型圖譜(圖3～7)。

圖3 溶劑空白

圖4 制劑空白

圖5 標(biāo)樣圖譜

圖6 甲哌鎓水劑圖譜

圖7 甲哌鎓原藥圖譜

3 結(jié)論

綜上所述，用本分析方法對甲哌鎓原藥及22.5% 28-表蕓·甲哌鎓水劑進(jìn)行測定分析，方法準(zhǔn)確度高，精密度高，分析方法簡便、快速，適用于甲哌鎓原藥及22.5% 28-表蕓·甲哌鎓水劑產(chǎn)品的質(zhì)量控制分析。