子宮主動脈結(jié)扎大鼠缺氧缺血腦病模型的聲輻射力脈沖彈性成像結(jié)果與神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性研究

趙 晶，孫鳳蘭，王 紅，付曉慶，劉瑋瑋

（德州市婦幼保健院特檢科 山東 德州 253011）

新生兒缺氧缺血性腦?。╤ypoxie-ischemic encephalopathy，HIE）是指新生兒在圍產(chǎn)期因窒息導(dǎo)致的缺氧缺血性腦損傷，其極易引起新生兒出現(xiàn)各類腦損傷后遺癥，嚴(yán)重的可危及生命[1]。因此，對新生兒缺氧缺血性腦病的臨床早期診斷和及時干預(yù)治療尤為重要。普通的超聲檢測雖然已經(jīng)廣泛用于新生兒顱腦損傷的診斷，但因其技術(shù)局限性，導(dǎo)致靈敏度較低，需要極具經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師才能準(zhǔn)確判斷。有研究表明聲輻射力脈沖彈性成像技術(shù)（ARFI）在組織硬度檢測中具有較高的靈敏度，因此在顱腦損傷的早期精確診斷應(yīng)用中具有巨大潛力[2-3]。盡管如此，基于安全性考慮，當(dāng)前關(guān)于顱腦損傷的相關(guān)研究主要集中于各類動物模型[4-5]。因此，本研究首先通過孕鼠子宮體動脈結(jié)扎的方法構(gòu)建大鼠缺氧缺血性腦病模型，隨后分別利用多普勒超聲檢測模型鼠大腦的MCA血流參數(shù)和利用ARFI彈性成像技術(shù)檢測新生大鼠模型的腦組織硬度。兩種超聲檢測方法得到的數(shù)據(jù)分別與模型鼠腦組織的病理染色、神經(jīng)細(xì)胞凋亡統(tǒng)計以及凋亡相關(guān)蛋白的WB結(jié)果進(jìn)行比較，對ARFI彈性成像應(yīng)用于缺氧缺血性腦損傷檢測的可行性進(jìn)行深入研究，為今后該技術(shù)應(yīng)用于臨床提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供的30只孕晚期Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)對象。參考顏淑芹等[5]的造模方法，將所有實(shí)驗(yàn)對象無麻醉仰臥固定在手術(shù)臺上，手術(shù)暴露子宮后用止血鉗將雙側(cè)子宮角及子宮體動脈結(jié)扎。根據(jù)結(jié)扎時間不同分為對照組、10分鐘組、20分鐘組三組，每組10只。其中，對照組僅暴露子宮而不結(jié)扎，隨后縫合傷口，繼續(xù)飼養(yǎng)，自然分娩。模型組結(jié)扎完成后，剖宮產(chǎn)取出胎鼠，使其盡快恢復(fù)自主呼吸，交給代乳媽媽鼠喂養(yǎng)。動物實(shí)驗(yàn)獲得德州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批號YXLL-202004）。

1.2 方法

超聲檢查使用含內(nèi)置ARFI技術(shù)的Simens公司的ACUSON S2000彩色多普勒超聲診斷儀。探頭9L4，頻率（7 ～9）MHz。熒光顯微鏡使用日本奧林巴斯CKX53熒光顯微鏡。蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)使用美國伯樂公司的Mini-PROTEAN? Tetra電泳槽以及ChemiDoc化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)。

三個實(shí)驗(yàn)組存活的模型幼鼠分別于出生后6天、8天、10天、12天進(jìn)行超聲檢查。將幼鼠頭顱固定在檢查臺上，探頭置于其頭部頂骨中線，先應(yīng)用多普勒彩超和脈沖多普勒測定雙側(cè)大腦中的收縮期最大血流速度（Vs）、舒張期末最大血流速度（Vd）以及阻力指數(shù)（RI）。隨后使用ARFI彈性成像技術(shù)測量腦實(shí)質(zhì)的聲觸診量化（VTQ）值。所有測量值連續(xù)測定3次取平均值作為最終結(jié)果。

1.3 動物模型病理學(xué)檢測

在所有超聲檢查結(jié)束后，對每個實(shí)驗(yàn)組的所有模型幼鼠進(jìn)行病理檢測。具體方法：首先，將實(shí)驗(yàn)對象麻醉后固定于解剖臺上，用PBS生理鹽水進(jìn)行心臟和大腦灌注。隨后，取完整一側(cè)大腦經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋等處理。另一側(cè)完整大腦冷凍于超低溫冰箱用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。大腦組織蠟塊在石蠟切片機(jī)上切片5 μm后行蘇木素-伊紅染色（HE染色），封片后顯微鏡觀察。

1.4 TUNEL組織細(xì)胞凋亡檢測

大腦組織石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后20 μg/mL的蛋白酶K室溫處理20 min，PBS漂洗三次徹底去除殘留的蛋白酶K。按照TUNEL試劑盒（碧云天）說明書的要求配制熒光標(biāo)記反應(yīng)液，37°避光孵育樣本60 min后洗去反應(yīng)液，DAPI復(fù)染后封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間采用方差分析（ANOVA），以秩和檢驗(yàn)分析非正態(tài)分布的資料。各指標(biāo)間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組模型在不同時間點(diǎn)檢測的Vs值

子宮動脈結(jié)扎20分鐘和10分鐘組出生的幼鼠模型大腦Vs值在各檢測時間點(diǎn)內(nèi)均低于對照組（P＜0.05），但隨著生長時間延長并未出現(xiàn)進(jìn)一步的降低。結(jié)扎20分鐘組與10分鐘組在各時間點(diǎn)的Vs值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 各實(shí)驗(yàn)組模型不同時間點(diǎn)大腦Vs值測量結(jié)果（，cm/s）

表1 各實(shí)驗(yàn)組模型不同時間點(diǎn)大腦Vs值測量結(jié)果（，cm/s）

注：①表示與對照組相比，P＜0.05；②表示與10分鐘組相比，P＞0.05。

組別6 d8 d 20分鐘組（n=5）6.86±0.62①②6.94±0.84①②10分鐘組（n=7）7.27±0.57①6.81±0.67①對照組（n=10）11.57±0.5511.14±0.89組別10 d12 d 20分鐘組（n=5）6.41±0.64①②6.41±0.47①②10分鐘組（n=7）6.91±0.76①6.64±0.94①對照組（n=10）11.24±0.5911.04±0.86

2.2 各實(shí)驗(yàn)組模型在不同時間點(diǎn)檢測的Vd值

子宮動脈結(jié)扎20分鐘組和10分鐘組中大腦Vd值在幼鼠出生后各時間點(diǎn)與對照組均無顯著差異；結(jié)扎20分鐘組與10分鐘組在各時間點(diǎn)的Vd值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 各實(shí)驗(yàn)組模型不同時間點(diǎn)大腦Vd值測量結(jié)果（，cm/s）

表2 各實(shí)驗(yàn)組模型不同時間點(diǎn)大腦Vd值測量結(jié)果（，cm/s）

組別6 d8 d 20分鐘組（n=5）4.95±0.4①②4.79±0.7①②10分鐘組（n=7）4.46±0.28①4.26±0.52①對照組（n=10）4.0±0.454.82±0.39

表2（續(xù)）

表2 各實(shí)驗(yàn)組模型不同時間點(diǎn)大腦Vd值測量結(jié)果（，cm/s）

注：①表示與對照組相比，P＞0.05；②表示與10分鐘組相比，P＞0.05。

組別10 d12 d 20分鐘組（n=5）4.92±0.47①②4.12±0.46①②10分鐘組（n=7）4.41±0.41①4.01±0.75①對照組（n=10）4.16±0.264.18±0.58

2.3 各實(shí)驗(yàn)組模型在不同時間點(diǎn)檢測的RI值

子宮動脈結(jié)扎20分鐘組和10分鐘組中模型幼鼠大腦RI值在出生后6～12天各時間點(diǎn)內(nèi)均低于對照組（P＜0.05），但數(shù)值并未隨著生長時間的延長而發(fā)生明顯變化。結(jié)扎20分鐘組與10分鐘組在各時間點(diǎn)的RI值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表3。

表3 各實(shí)驗(yàn)組模型不同時間點(diǎn)大腦RI值測量結(jié)果（）

表3 各實(shí)驗(yàn)組模型不同時間點(diǎn)大腦RI值測量結(jié)果（）

注：①表示與對照組相比，P＜0.05；②表示與10分鐘組相比，P＞0.05。

組別6 d8 d 20分鐘組（n=5）0.45±0.01①②0.39±0.02①②10分鐘組（n=7）0.42±0.02①0.45±0.04①對照組（n=10）0.57±0.030.59±0.03組別10 d12 d 20分鐘組（n=5）0.35±0.04①②0.42±0.03①②10分鐘組（n=7）0.42±0.03①0.47±0.01①對照組（n=10）0.55±0.030.57±0.03

2.4 各實(shí)驗(yàn)組模型在不同時間點(diǎn)檢測的聲觸診量化（VTQ）值

子宮動脈結(jié)扎20分鐘組和10分鐘組中模型幼鼠大腦VTQ值在出生后6到12天各時間點(diǎn)內(nèi)均高于對照組（P＜0.05），但數(shù)值并未隨著生長時間的增加而發(fā)生明顯變化。結(jié)扎20分鐘組在各時間點(diǎn)的VTQ值均顯著高于10分鐘組（P＜0.05）。詳見表4。

表4 各實(shí)驗(yàn)組模型不同時間點(diǎn)大腦VTQ值測量結(jié)果（，m/s）

表4 各實(shí)驗(yàn)組模型不同時間點(diǎn)大腦VTQ值測量結(jié)果（，m/s）

注：①表示與對照組相比，P＜0.05；②表示與10分鐘組比較，P＜0.05。

組別6 d8 d 20分鐘組（n=5）1.86±0.17①②1.80±.0.11①②10分鐘組（n=7）1.34±0.07①1.39±0.10①對照組（n=10）0.83±0.090.86±0.09組別10 d12 d 20分鐘組（n=5）1.85±0.14①②1.85±0.18①②10分鐘組（n=7）144±0.13①1.43±0.11①對照組（n=10）0.96±0.070.86±0.07

2.5 各實(shí)驗(yàn)組模型大腦切片HE染色觀察結(jié)果

對照組中神經(jīng)細(xì)胞排列緊密、整齊，細(xì)胞形態(tài)正常。結(jié)扎10分鐘組和結(jié)扎20分鐘組中腦組織神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞間隙增大，出現(xiàn)很多大的空泡。結(jié)果詳見圖1。

圖1 三組模型腦組織HE染色結(jié)果

2.6 TUNEL染色觀察各實(shí)驗(yàn)組模型大腦中神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

結(jié)扎10分鐘組和結(jié)扎20分鐘組中神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目顯著少于對照組，而細(xì)胞凋亡率卻明顯高于對照組。結(jié)扎20分鐘組中的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目顯著少于結(jié)扎10分鐘組，細(xì)胞凋亡率顯著上升。模型組中的一些神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)較正常神經(jīng)細(xì)胞核發(fā)生變型。結(jié)果詳見圖2、表5。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組腦組織TUNEL染色結(jié)果

表5 各實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計結(jié)果（）

表5 各實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計結(jié)果（）

注：①表示與對照組相比，P＜0.05；②表示與10分鐘組相比，P＜0.05。

組別單視野細(xì)胞數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)凋亡率/%結(jié)扎10分鐘組95.28±7.16①45.43±4.37①45.61±4.54①結(jié)扎20分鐘組88.4±4.88①54.7±6.01①61.89±6.03①②對照組102.6±8.043.6±1.353.47±1.18

2.7 計算各參數(shù)之間的相關(guān)性系數(shù)

結(jié)果顯示只有VTQ值和細(xì)胞凋亡率成高相關(guān)性且有顯著差異（r=0.9974，P=0.046）。見表6。

表6 動物模型大腦血流動力學(xué)參數(shù)、VTQ值與細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性

3 討論

新生兒大腦組織對能量和氧氣的需求非常旺盛，一旦發(fā)生缺氧缺血會極大影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能，造成腦損傷[1]。因此對新生兒缺氧缺血性腦病的早期診斷和治療至關(guān)重要。目前對HIE的臨床診斷主要依賴于影像學(xué)檢查，其包括磁共振成像（MRI）和超聲檢查[6-8]。MRI是鑒別HIE特異性和敏感性最高的檢查方式[9]。然而，不能進(jìn)行床旁操作，費(fèi)用昂貴且通常需要鎮(zhèn)靜麻醉限制了其在新生兒顱腦損傷檢查中的應(yīng)用。因此，越來越多的臨床醫(yī)生開始首選超聲這種可以在床邊進(jìn)行的低成本、無輻射損害的檢查方式來診斷新生兒腦損傷[10]。彩色多普勒超聲可以測量出新生兒顱腦中的血流動力學(xué)參數(shù)，而這些參數(shù)的改變與HIE的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[11-12]。隨著超聲技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，超聲檢查的敏感度也在逐步提高，其中超聲彈性成像技術(shù)就是一種很有潛力并且非常適合檢測腦損傷的超聲成像技術(shù)[2-3]。

彈性成像是一種用來確定組織硬度的方法，相較于傳統(tǒng)的灰度超聲，其產(chǎn)生定量或半定量的測量組織形態(tài)，可以顯著提高診斷和預(yù)后的敏感性。彈性成像還可以用來檢測那些僅通過MRI或普通超聲無法定量地觀察這些病變的進(jìn)展和演變，深化人們對新生兒腦損傷的認(rèn)識[13]。ARFI彈性成像是一種新興的彈性成像技術(shù)，其包括聲觸診成像（virtual touch tissue imaging，VTI）和聲觸診組織定量（virtual touch tissue quantification，VTQ），并已經(jīng)應(yīng)用于顱腦超聲檢查[14]。盡管如此，國內(nèi)關(guān)于ARFI彈性成像技術(shù)應(yīng)用于新生兒腦損傷檢查的研究較少。因此，本研究利用彩色多普勒超聲技術(shù)結(jié)合ARFI彈性成像檢測缺氧缺血性腦損傷動物模型中測量值的變化，以期有新的發(fā)現(xiàn)。

制作大鼠缺氧缺血性腦損傷模型技術(shù)已經(jīng)得到多方面的研究，其中應(yīng)用較多的方法是將出生一周的幼鼠通過手術(shù)結(jié)扎一側(cè)頸總動脈后低氧處理而成[15]。然而，人類缺氧缺血性腦病的發(fā)生是妊娠期間或分娩過程中缺氧導(dǎo)致的。為了更接近于真實(shí)的情況，本實(shí)驗(yàn)采用了結(jié)扎孕晚期大鼠雙側(cè)子宮動脈的方法制作動物模型。為了保證模型組新生乳鼠成活率，將模型組分為結(jié)扎時間10分鐘組和20分鐘組，分別進(jìn)行觀察和研究。通過不斷摸索，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了子宮動脈結(jié)扎誘發(fā)的新生缺氧缺血大鼠模型，并在適當(dāng)?shù)臅r間點(diǎn)進(jìn)行了顱腦超聲評價以及病理檢測、Tunel細(xì)胞凋亡檢測等。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，子宮動脈結(jié)扎20分鐘和10分鐘組的新生大鼠，在各檢測時間點(diǎn)其大腦血流動力學(xué)參數(shù)Vd值變化不明顯，而Vs和RI值較對照組均發(fā)生顯著變化。盡管如此，結(jié)扎20分鐘組和10分鐘組之間的Vs和RI值在各時間點(diǎn)均未檢測到明顯差異，這說明缺氧缺血性腦損傷形成后很難自行修復(fù)。利用ARFI技術(shù)檢測的腦實(shí)質(zhì)VTQ值隨著子宮動脈結(jié)扎時間的延長而顯著提高，而且兩個不同時間組之間也存在明顯差異。HE染色結(jié)果表明，子宮動脈結(jié)扎后，新生大鼠腦組織中神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞間出現(xiàn)很多空泡。而TUNEL染色也從單個細(xì)胞層面揭示了對照組、結(jié)扎10分鐘、結(jié)扎20分鐘組之間，活的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量遞減而細(xì)胞凋亡率遞增。王超等[16]的研究也得到了類似的結(jié)果。那么，大腦血流動力學(xué)參數(shù)和VTQ值分別與神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平的相關(guān)性如何呢？通過計算發(fā)現(xiàn)，ARFI彈性成像的VTQ值與細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性比彩色多普勒超聲檢測血流參數(shù)更強(qiáng)，且具有顯著相關(guān)性。這也說明ARFI彈性成像更能反映模型鼠大腦的缺氧缺血性腦損傷的真實(shí)情況，靈敏度更高。因此，ARFI彈性成像檢測新生大鼠腦組織彈性變化值對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的早期診斷和損傷程度分級的評價可能具有重要的參考價值。盡管如此，由于本項(xiàng)目得到的動物模型數(shù)量還不夠多，導(dǎo)致最終得到的數(shù)據(jù)還不夠完善，這也是今后的研究需要改進(jìn)的地方。

綜上所述，該項(xiàng)研究結(jié)果為今后ARFI彈性成像技術(shù)能在新生兒顱腦損傷臨床診斷領(lǐng)域的安全、廣泛應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。