梨矮化砧木中矮1 號(hào)組培快繁技術(shù)研究

王藝衡，馮靜涵*，于春亮，李濤，李金斗，趙健霄，張海霞，3，張玉星，3，馬輝，3，許建鋒，3

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北保定 071051；2. 威縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北威縣 054700；3. 河北省梨技術(shù)創(chuàng)新中心，河北保定 071051)

矮化密植栽培具有早果豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)高效、省地易管等優(yōu)點(diǎn)，利用矮化砧木是實(shí)現(xiàn)梨矮化密植的重要途徑，但是國(guó)外選育的梨矮化砧木大都因其適應(yīng)性差而不宜在我國(guó)推廣應(yīng)用。 梨矮化砧木中矮1 號(hào)的代號(hào)為S2，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所在1980 年從‘錦香’梨(南果梨×巴梨) 的實(shí)生后代中選育而成，具有果實(shí)品質(zhì)優(yōu)良、樹(shù)冠矮化緊湊、豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、抗病性強(qiáng)(強(qiáng)抗腐爛病和枝干輪紋病)等特性，是我國(guó)北方梨園矮化密植的常用砧木[1－3]。

由于梨屬植物具有童期較長(zhǎng)、自交不親和、雜合程度高等特質(zhì)，其實(shí)生繁殖易造成果園整齊度差和苗木良莠不齊，這嚴(yán)重影響建園效果和優(yōu)良砧木在生產(chǎn)上的應(yīng)用推廣，所以無(wú)性系砧木成為現(xiàn)代果園生產(chǎn)的基礎(chǔ)，無(wú)性育苗成為現(xiàn)代果業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。 在無(wú)性繁殖中，嫁接、扦插等營(yíng)養(yǎng)繁殖存在成本高、速度慢、質(zhì)量差、品種混雜、病毒感染嚴(yán)重等諸多弊端[4，5]，最關(guān)鍵的是中矮1號(hào)極難扦插成活。 組培快繁與之相比則具有增殖系數(shù)高、病害率少、基因型一致、不受季節(jié)和環(huán)境影響、短期大規(guī)模生產(chǎn)等眾多優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用于植物的快速繁殖、品種改良、基因工程育種和種質(zhì)資源保存等方面，在梨無(wú)性系砧木生產(chǎn)和現(xiàn)代生物育種中具有重要作用[6－9]。 但目前，組培快繁技術(shù)仍存在增殖系數(shù)低、生根率低、重復(fù)性差等問(wèn)題。 所以本試驗(yàn)以梨矮化砧木中矮1 號(hào)為試材，研究篩選其適宜的外植體種類(lèi)及消毒方式、繼代和生根培養(yǎng)基及生根條件，以建立起一種增殖系數(shù)高、生根效果好的組培快繁技術(shù)，為建立高效、穩(wěn)定的組培快繁體系提供依據(jù)，為梨的轉(zhuǎn)基因研究和遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2021 年3 月于河北省邢臺(tái)市威縣香花營(yíng)種質(zhì)資源圃，剪取芽體飽滿但未萌發(fā)的一年生中矮1 號(hào)健壯枝條，置于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)梨中心溫室中進(jìn)行水培催芽，隔日換水以促進(jìn)萌發(fā)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 中矮1 號(hào)外植體種類(lèi)及消毒時(shí)間篩選將萌發(fā)后的芽體完整地取下(不破壞生長(zhǎng)點(diǎn))并作為外植體，將其分為莖段芽、混合芽、無(wú)花芽混合芽、葉芽四種(圖1A ～D)。 首先用洗潔精水清洗外植體2 min，然后將其置于燒杯中并用雙層紗布封口后用自來(lái)水沖洗30 min，最后在超凈工作臺(tái)中用75%酒精涮洗30 s→0.1%升汞涮洗(3、5、7)min→無(wú)菌水沖洗30 s→用濾紙吸干水分后接種于初代培養(yǎng)基(MS＋1.5 mg/L 6－BA＋0.1 mg/L NAA＋0.4 mg/L GA3＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂＋2 g/L PVA，pH＝6.0)中。 培養(yǎng)室條件:光照強(qiáng)度為4 000 lx，光照時(shí)間為16 h，溫度為24℃，下同。 30天時(shí)統(tǒng)計(jì)其成活率、污染率和褐變率。

圖1 四種外植體和兩種幼化程度的苗

1.2.2 中矮1 號(hào)組培苗繼代培養(yǎng)基篩選 切取初代培養(yǎng)30 天時(shí)長(zhǎng)勢(shì)一致的1.5 cm 長(zhǎng)莖尖，分別接種于表1 正交設(shè)計(jì)的①～⑨號(hào)繼代培養(yǎng)基(MS＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂＋2 g/L PVA＋表1中的激素組合，pH ＝6.0)中。 每個(gè)處理接種20株，重復(fù)3 次，30 天時(shí)統(tǒng)計(jì)其增殖系數(shù)、芽長(zhǎng)、苗高、葉片數(shù)、節(jié)間數(shù)和節(jié)間長(zhǎng)度。

1.2.3 中矮1 號(hào)組培苗生根培養(yǎng)基篩選 生根培養(yǎng)采用兩步生根法，即第一步先切取繼代培養(yǎng)30 天時(shí)長(zhǎng)勢(shì)一致且健壯的3.5 cm 長(zhǎng)組培苗，分別接種于表2 正交設(shè)計(jì)的①～⑨號(hào)生根培養(yǎng)基(1/2 MS＋15 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂＋2 g/L PVA＋表2 中的生根調(diào)節(jié)物質(zhì)組合，pH＝6.0)中誘導(dǎo)7 天，其中前5 天進(jìn)行暗培養(yǎng)，后續(xù)轉(zhuǎn)為全光照培養(yǎng)；第二步將誘導(dǎo)后的組培苗轉(zhuǎn)接至不含激素的培養(yǎng)基(1/2MS＋15 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂＋2 g/L PVA，pH＝6.0)中培養(yǎng)33 天。 每個(gè)處理接種20 株，重復(fù)3 次，40 天時(shí)統(tǒng)計(jì)其生根率、根數(shù)、根長(zhǎng)和生根所需天數(shù)。

表2 生根培養(yǎng)基調(diào)節(jié)物質(zhì)L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(mg/L)

1.2.4 光照對(duì)中矮1 號(hào)組培苗生根的影響 將組培苗接種于⑨號(hào)生根培養(yǎng)基(1/2MS ＋15 g/L蔗糖＋7 g/L 瓊脂＋2 g/L PVA＋1.5 mg/L IBA＋0.8 mg/L IAA＋0.3 mg/L NAA，pH＝6.0)后，分別在強(qiáng)光(4 000 lx)、弱光(無(wú)燈管直照處)、微光(開(kāi)口箱子中)、黑暗(暗箱中)四種光照環(huán)境下培養(yǎng)5天，其它條件同上。 每個(gè)處理接種30 株，40 天時(shí)統(tǒng)計(jì)生根指標(biāo)。

1.2.5 組培苗幼化程度對(duì)中矮1 號(hào)組培苗生根的影響 分別將剛完成繼代培養(yǎng)的幼嫩苗(圖1E)和經(jīng)過(guò)一次生根培養(yǎng)但未生根的成熟苗(圖1F)接種于⑤號(hào)生根培養(yǎng)基(1/2MS ＋15 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂＋2 g/L PVA＋1.0 mg/L IBA＋0.4 mg/L IAA＋0.6 mg/L NAA，pH＝6.0)中，其它條件同上。 每個(gè)處理接種30 株，40 天時(shí)統(tǒng)計(jì)生根指標(biāo)。

1.2.6 一步生根法對(duì)中矮1 號(hào)組培苗生根的影響 選取30 株組培苗使用一步生根法來(lái)進(jìn)行生根培養(yǎng)，即全程在⑨號(hào)生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)(前5天為暗培養(yǎng))，期間不更換培養(yǎng)基，40 天時(shí)統(tǒng)計(jì)生根指標(biāo)。 以使用兩步生根法進(jìn)行生根培養(yǎng)的組培苗為對(duì)照，比較二者生根過(guò)程中的差異。

1.3 指標(biāo)計(jì)算及方法

褐化率(%)＝外植體褐化數(shù)/外植體接種數(shù)×100；污染率(%)＝外植體污染數(shù)/外植體接種數(shù)×100；成活率(%)＝外植體成活數(shù)/外植體接種數(shù)×100。

增殖系數(shù)＝增殖芽總數(shù)/接種株數(shù)；平均株高＝苗干總高/接種株數(shù)；平均葉片數(shù)＝完全展開(kāi)的葉片總數(shù)/接種株數(shù)；平均芽長(zhǎng)＝增殖芽總長(zhǎng)/接種株數(shù)。

生根率(%)＝生根株數(shù)/接種株數(shù)×100；平均根數(shù)＝總根數(shù)/生根株數(shù)；平均根長(zhǎng)＝總根長(zhǎng)/總根數(shù)；平均生根天數(shù)＝(生根日期－接種日期)/生根株數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS Statistics 25 進(jìn)行方差分析，用Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，用Microsoft Excel 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 中矮1 號(hào)外植體種類(lèi)及消毒時(shí)間篩選結(jié)果

由表3 可以看出，0.1%升汞消毒3 min 時(shí)，葉芽成活率(91.7%)最高，其次為無(wú)花芽混合芽(44.4%)；消毒5 min 時(shí)，無(wú)花芽混合芽成活率(34.5%)高于葉芽(25.8%)；消毒7 min 時(shí)，只有無(wú)花芽混合芽成活，成活率為33.3%；三個(gè)消毒時(shí)段下莖段芽和混合芽均無(wú)成活株。除莖段芽，另外三種外植體的褐化率隨消毒時(shí)間延長(zhǎng)而升高。無(wú)花芽混合芽和葉芽的成活率隨消毒時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。

表3 不同消毒時(shí)間和外植體種類(lèi)對(duì)外植體引入的影響

綜上，葉芽和無(wú)花芽混合芽較適合作為中矮1 號(hào)的外植體，引外植體時(shí)的最佳升汞消毒時(shí)間為3 min，總消毒時(shí)間為4 min。

2.2 中矮1 號(hào)組培苗繼代培養(yǎng)基篩選結(jié)果

圖2 顯示，⑦號(hào)繼代培養(yǎng)基(MS＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂＋2 g/L PVA＋1.8 mg/L 6－BA＋0.1 mg/L NAA＋0.2 mg/L GA3，pH ＝6.0)組培苗的增殖系數(shù)(5.52)最高，顯著高于其它處理；⑥號(hào)培養(yǎng)基(MS＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂＋2 g/L PVA＋1.4 mg/L 6－BA＋0.2 mg/L IBA＋0.1 mg/L NAA，pH ＝6.0)組培苗的平均芽長(zhǎng)(1.15 cm)最長(zhǎng)，9 個(gè)處理間無(wú)顯著差異；⑦號(hào)培養(yǎng)基組培苗的平均苗高(4.14 cm)最高，與⑧號(hào)培養(yǎng)基(MS＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L瓊脂＋2 g/L PVA ＋1.8 mg/L 6－BA ＋0.1 mg/L IBA＋0.2 mg/L NAA，pH＝6.0)無(wú)顯著差異，顯著高于其它處理；⑦號(hào)培養(yǎng)基組培苗的平均葉數(shù)(20.28 片)最多，與⑧號(hào)、⑨號(hào)培養(yǎng)基(MS＋30 g/L蔗糖＋7 g/L 瓊脂＋2 g/L PVA＋1.8 mg/L 6－BA＋0.2 mg/L IBA＋0.1 mg/L GA3，pH ＝6.0)無(wú)顯著差異，顯著多于其它處理；⑦號(hào)培養(yǎng)基組培苗的平均節(jié)間數(shù)(4.89 節(jié))最多，與⑥號(hào)、⑨號(hào)培養(yǎng)基無(wú)顯著差異，顯著多于其它處理；⑤號(hào)培養(yǎng)基(MS＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂＋2 g/L PVA＋1.4 mg/L 6－BA＋0.1 mg/L IBA＋0.2 mg/L GA3，pH ＝6.0)組培苗的平均節(jié)間長(zhǎng)度(1.23 cm)最長(zhǎng)，9 個(gè)處理間無(wú)顯著差異。

圖2 不同增殖激素組合對(duì)組培苗繼代培養(yǎng)的影響

極差分析結(jié)果(表4)表明，四種激素中6－BA對(duì)繼代增殖的影響最大，主要影響增殖系數(shù)、苗高、葉片數(shù)和節(jié)間數(shù)；NAA 主要影響芽長(zhǎng)和節(jié)間長(zhǎng)度；GA3對(duì)芽長(zhǎng)、苗高和節(jié)間長(zhǎng)度也有一定影響。 方差分析篩選出的最佳繼代培養(yǎng)基激素組合為:1.8 mg/L 6－BA ＋0.1 mg/L NAA ＋0.2 mg/L GA3，再結(jié)合圖2 的單因素分析結(jié)果認(rèn)為，1.8 mg/L 6－BA＋0.1 mg/L NAA＋0.2 mg/L GA3為最佳繼代培養(yǎng)基激素組合。

表4 增殖激素正交試驗(yàn)的方差分析及極差分析

2.3 中矮1 號(hào)組培苗生根培養(yǎng)基篩選

圖3 顯示，⑤號(hào)生根培養(yǎng)基(1/2MS＋15 g/L蔗糖＋7 g/L 瓊脂＋2 g/L PVA＋1.0 mg/L IBA＋0.4 mg/L IAA＋0.6 mg/L NAA，pH ＝6.0)組培苗的生根率(72.22%)最高，顯著高于其它處理；⑨號(hào)培養(yǎng)基(1/2MS ＋15 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂＋2 g/L PVA＋1.5 mg/L IBA ＋0.8 mg/L IAA ＋0.3 mg/L NAA，pH＝6.0)組培苗的平均根數(shù)(5.36 條)最多，僅顯著多于②號(hào)培養(yǎng)基(1/2MS ＋15 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂＋2 g/L PVA＋0.5 mg/L IBA＋0.4 mg/L IAA ＋0.3 mg/L NAA ＋0.5 mg/L AC，pH ＝6.0)，與其余7 個(gè)處理無(wú)顯著差異；⑨號(hào)培養(yǎng)基組培苗的平均根長(zhǎng)(7.74 cm)最長(zhǎng)，與⑤號(hào)培養(yǎng)基無(wú)顯著差異，顯著高于其它處理；⑨號(hào)培養(yǎng)基生根所需天數(shù)(13.65 天)最少，與①號(hào)(1/2MS＋15 g/L蔗糖＋7 g/L 瓊脂＋2 g/L PVA ＋0.5 mg/L IBA，pH＝6.0)、③號(hào)(1/2MS＋15 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂＋2 g/L PVA＋0.5 mg/L IBA＋0.8 mg/L IAA＋0.6 mg/L NAA＋1.0 mg/L AC，pH＝6.0)、④號(hào)(1/2MS＋15 g/L蔗糖＋7 g/L 瓊脂＋2 g/L PVA＋1.0 mg/L IBA＋0.3 mg/L NAA＋1.0 mg/L AC，pH ＝6.0)、⑤號(hào)培養(yǎng)基無(wú)顯著差異，顯著少于其它處理。

圖3 不同生根調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對(duì)組培苗生根的影響

極差分析結(jié)果(表5)表明，四種生根調(diào)節(jié)物質(zhì)中AC 對(duì)組培苗生根的影響最大，為四項(xiàng)生根指標(biāo)的最主要影響因素，高濃度的AC 會(huì)影響組培苗的生長(zhǎng)狀態(tài)，可能造成組培苗葉片枯黃、頂梢發(fā)黑、基部不長(zhǎng)愈傷；IBA 主要影響生根率；IAA 主要影響根數(shù)和根長(zhǎng)；NAA 主要影響生根所需天數(shù)。 方差分析篩選出的最佳生根調(diào)節(jié)物質(zhì)組合為:1.0 mg/L IBA＋0.8 mg/L IAA＋0.6 mg/L NAA，結(jié)合圖3 的單因素分析結(jié)果認(rèn)為，1.0 mg/L IBA＋0.4 mg/L IAA＋0.6 mg/L NAA 為最佳生根調(diào)節(jié)物質(zhì)組合。

表5 生根調(diào)節(jié)物質(zhì)正交試驗(yàn)的方差分析及極差分析

2.4 光強(qiáng)對(duì)中矮1 號(hào)組培苗生根的影響

由圖4 可以看出，組培苗生根培養(yǎng)前期暗培養(yǎng)5 天的平均生根率(60.00%)最高，顯著高于其它處理，強(qiáng)光培養(yǎng)的生根率(6.67%)最低；微光培養(yǎng)組培苗的平均根數(shù)(4.40 條)最多，暗培養(yǎng)(3.67條)其次，4 個(gè)處理間無(wú)顯著差異；暗培養(yǎng)組培苗的平均根長(zhǎng)(5.55 cm)最長(zhǎng)，與微光和弱光培養(yǎng)無(wú)顯著差異，顯著長(zhǎng)于強(qiáng)光培養(yǎng)。 表明，4 個(gè)處理在各自光照強(qiáng)度下培養(yǎng)5 天，其愈傷生成速率隨光照強(qiáng)度的減弱而增加，暗培養(yǎng)下愈傷組織的生成量最多，強(qiáng)光培養(yǎng)則幾乎不產(chǎn)生愈傷。

圖4 不同光強(qiáng)對(duì)組培苗生根的影響

4 個(gè)處理生根培養(yǎng)40 天后，總體的生根效果隨光照的減弱而變好，強(qiáng)光培養(yǎng)組培苗的生根效果較差，根數(shù)少且短粗，暗培養(yǎng)的生根質(zhì)量較好，根數(shù)多且細(xì)長(zhǎng)。

綜上，生根培養(yǎng)前期暗培養(yǎng)5 天更有益于中矮1 號(hào)組培苗生根。

2.5 苗幼化程度對(duì)中矮1 號(hào)組培苗生根的影響

由表6 可以看出，幼嫩苗的生根率、平均根數(shù)、平均根長(zhǎng)都要高于成熟苗，生根速度也更快。幼嫩苗莖段基部的愈傷組織大小適中，根系細(xì)軟(圖5A)，而成熟苗的愈傷組織則較小，根系粗硬(圖5B)。 綜上，繼代培養(yǎng)40 天的幼嫩苗生根效果更好。

圖5 幼嫩苗(A)和成熟苗(B)的生根效果對(duì)比

表6 幼嫩苗和成熟苗的生根指標(biāo)對(duì)比

2.6 一步生根法對(duì)中矮1 號(hào)組培苗生根的影響

圖6 A 顯示，組培苗用一步生根法生根培養(yǎng)后的愈傷組織生成量極大，生長(zhǎng)狀態(tài)較差，出現(xiàn)苗細(xì)弱、葉焦邊、枯尖等現(xiàn)象，沒(méi)有出現(xiàn)生根苗。 兩步生根法的組培苗愈傷組織大小正常，苗健康粗壯，根系狀態(tài)較好(圖6B)。 所以?xún)刹缴ǜm合中矮1 號(hào)的生根培養(yǎng)。

圖6 一步生根苗(A)和兩步生根苗(B)的生根效果對(duì)比

3 討論與結(jié)論

外植體的高效引入是建立組培快繁技術(shù)的關(guān)鍵，外植體種類(lèi)和滅菌方法的選擇將直接影響其成活率。 本試驗(yàn)采用的外植體為早春時(shí)溫室中水培萌發(fā)的嫩梢，其本身攜帶的病菌、酚類(lèi)物質(zhì)較少，酶活性較弱，所以污染率、褐變率不高[6，10]。本試驗(yàn)用于篩選的四種外植體中，混合芽多在花芽和花穗處滋生真菌，莖段芽則在莖部滋生真菌，二者與葉芽、無(wú)花芽混合芽相比滅菌難度較大，滅菌時(shí)間難以把握。 如果滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，植物細(xì)胞會(huì)受到傷害，導(dǎo)致生長(zhǎng)點(diǎn)死亡，褐化率增高；滅菌時(shí)間太短，外源菌無(wú)法被完全消滅，導(dǎo)致污染率增高[4，7]。 因此合理的滅菌時(shí)間將直接關(guān)系到外植體的成活。

植物激素是促進(jìn)植物組織分化的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，不同的激素組合及濃度配比可能會(huì)刺激不同基因控制的酶類(lèi)，從而影響內(nèi)源激素的分布水平，進(jìn)而影響不定芽的增殖效果和植株的生長(zhǎng)狀態(tài)，因此篩選適宜的激素組合是建立組培快繁技術(shù)的關(guān)鍵[4，10，11]。 6－BA 可促使腋芽萌發(fā)和抑制頂端優(yōu)勢(shì)，對(duì)組培苗增殖的影響最大，但當(dāng)其濃度超過(guò)2.0 mg/L 時(shí)會(huì)加劇組培苗的玻璃化，抑制芽和莖的伸長(zhǎng)[1，12，13]；低濃度的GA3可促進(jìn)植物細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)，進(jìn)而影響組培苗的增殖數(shù)和苗高[14]；低濃度的NAA 能促進(jìn)莖干上腋芽的分生，且對(duì)苗高起一定的主導(dǎo)作用[15，16]。 本研究結(jié)果與以上論述相一致。 前人研究中，蔡猛[17]篩選的中矮1號(hào)繼代培養(yǎng)基(MS＋1.0 mg/L 6－BA ＋0.3 mg/L IBA＋30 g/L 蔗糖＋6 g/L 瓊脂)的增殖系數(shù)為3.38；及華等[18]篩選的繼代培養(yǎng)基(MS＋1.0 mg/L 6－BA＋0.2 mg/L IBA＋0.1 mg/L GA3＋20 g/L 蔗糖＋6.5 g/L 瓊脂)的增殖系數(shù)為3.4；羅婭等[19]篩選的繼代培養(yǎng)基(MS ＋3.0 mg/L BA ＋0.2 mg/L IBA＋2.0 mg/L GA3＋30 g/L 蔗糖＋6 g/L 瓊脂)的增殖系數(shù)為3.88。 本試驗(yàn)篩選出的繼代培養(yǎng)基的平均增殖系數(shù)為5.52，較前人研究結(jié)果有明顯提高，且組培苗繼代30 天的平均苗高可達(dá)4.14 cm。高壯苗可以更早地進(jìn)行后續(xù)的生根培養(yǎng)，從而加速育苗進(jìn)程。

生長(zhǎng)素的種類(lèi)及濃度是影響組培苗生根的關(guān)鍵因素[20]。 首先，對(duì)于生根困難的果樹(shù)材料，兩步生根法要好于一步生根法，其原因可能為根原基誘導(dǎo)、根和莖的生長(zhǎng)對(duì)生長(zhǎng)素的需求濃度不同，根原基的形成需要在高濃度生長(zhǎng)素下進(jìn)行誘導(dǎo)，而根的生長(zhǎng)發(fā)育階段，高濃度的生長(zhǎng)素反而會(huì)抑制幼根生長(zhǎng)[21－23]；一步生根法較省時(shí)省力，可降低移瓶過(guò)程中組培苗污染的可能性，但組培苗的莖段基部易生成大團(tuán)愈傷組織，不利于其誘導(dǎo)生根和移栽成活。 其次，組培苗在混合生長(zhǎng)素下培養(yǎng)其生根效果要好于單一生長(zhǎng)素:IBA 可以誘發(fā)根原基形成，促進(jìn)內(nèi)源激素IAA 的運(yùn)輸，可在輔酶作用下轉(zhuǎn)化成IAA 來(lái)發(fā)揮作用[7]；羅嘉亮等[8]認(rèn)為IBA 的生根誘導(dǎo)效果最佳，但李曉剛[12]和方明[9]等認(rèn)為IBA 對(duì)組培苗的生根無(wú)顯著性影響；IAA 是影響不定根形成的重要因子，但其易被氧化酶氧化，性質(zhì)不穩(wěn)定且作用持續(xù)的時(shí)間較短[8]；NAA 可以促進(jìn)組培苗儲(chǔ)存的淀粉水解為還原糖，有利于不定根的形成，但高濃度NAA 會(huì)使組培苗基部產(chǎn)生較大的愈傷，誘導(dǎo)出的根較粗短，不利于移栽成活[8，23，24]；活性炭(AC)可以吸附某些有害物質(zhì)，為組培苗提供暗環(huán)境，提高組培苗的可溶性蛋白和總糖含量，從而有利于根的誘導(dǎo)和根系生長(zhǎng)，但活性炭濃度太高時(shí)則可能減少愈傷組織的生成，吸附大部分的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)及對(duì)生根有利的物質(zhì)，從而抑制根的發(fā)生[24]。 欒曉龍等[25]在生根培養(yǎng)基中添加1.0 g/L AC，顯著提高山梨的生根率和生根條數(shù)；王宏偉等[15]研究表明豆梨組培苗的增殖系數(shù)和株高隨著活性炭濃度的提高而降低；劉翠瓊[26]試驗(yàn)表明0.5 g/L AC 可提高巴梨的生根率，1.0 g/L AC 則會(huì)起到抑制作用。本研究表明，AC 對(duì)組培苗生根的影響最大，0.5、1.0 g/L AC 均對(duì)中矮1 號(hào)的生根起明顯抑制作用；IBA 主要影響生根率；IAA 主要影響根數(shù)和根長(zhǎng)；NAA 主要影響生根所需天數(shù)。 前人研究中，蔡猛[17]篩選的中矮1 號(hào)生根培養(yǎng)基(1/2MS＋0.1 mg/L NAA＋30 g/L 蔗糖＋7 g/L 瓊脂)的生根率為50.1%，平均根數(shù)為2.99 條；羅婭等[19]篩選的培養(yǎng)基(1/2QL＋5.0 mg/L IBA＋5.0 g/L 蔗糖上暗培養(yǎng)10 d→1/2QL＋5.0 g/L 蔗糖＋0.5 g/L AC)為67%，平均根數(shù)為1.5 條；及華[27]篩選的培養(yǎng)基(ASH＋2.0 mg/L IBA＋20 g/L 蔗糖＋6.5 g/L 瓊脂上暗培養(yǎng)7 ～9 d→ASH＋蛭石＋20 g/L 蔗糖＋6.5 g/L 瓊脂)為70%，平均根數(shù)為3 條。 本試驗(yàn)優(yōu)選出的生根培養(yǎng)基其生根率為72.22%，平均根數(shù)為5.36 條，明顯多于前人研究中的誘導(dǎo)結(jié)果，生根效果較好。

暗培養(yǎng)時(shí)間、光強(qiáng)、苗的幼化程度等也是影響組培苗生根的重要因素。 暗培養(yǎng)時(shí)間受組培苗生長(zhǎng)狀態(tài)、繼代次數(shù)和培養(yǎng)環(huán)境等因素影響，合適的時(shí)間有助于組培苗根的形成，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易造成組培苗細(xì)弱、葉焦邊、枯尖等現(xiàn)象[23，26]。 培養(yǎng)時(shí)的光強(qiáng)不同，生根效果也有很大差異。 本試驗(yàn)中，光強(qiáng)越弱，生根越早，根系質(zhì)量越好。 分析其原因可能是，暗環(huán)境更有利于根原基的誘導(dǎo)，更早的形成愈傷組織。 本研究認(rèn)為，中矮1 號(hào)組培苗的生根能力還與其幼化程度有關(guān)，與成熟組織相比，幼齡組織和過(guò)渡態(tài)組織具有更強(qiáng)的再生能力，因?yàn)槠浼?xì)胞具有強(qiáng)大的分裂能力，這是根原基形成的前提條件[27]。

綜之，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)梨矮化砧木中矮1 號(hào)組培快繁影響因素的研究而建立的離體快繁技術(shù)為:以中矮1 號(hào)一年生枝條水培萌發(fā)的葉芽或無(wú)花芽混合芽為外植體，采取75%酒精30 s→0.1%升汞3 min→無(wú)菌水30 s 的消毒方式進(jìn)行滅菌，然后接種于啟動(dòng)培養(yǎng)基(MS ＋30 g/L 蔗糖＋1.5 mg/L 6－BA＋0.1 mg/L NAA＋0.4 mg/L GA3＋7 g/L瓊脂，pH ＝6.0)上；30 天時(shí)轉(zhuǎn)接入繼代培養(yǎng)基(MS＋30 g/L 蔗糖＋1.8 mg/L 6－BA ＋0.1 mg/L NAA＋0.2 mg/L GA3＋7 g/L 瓊脂，pH ＝6.0)上增殖培養(yǎng)，增殖系數(shù)可達(dá)5.52；30 天時(shí)轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基(1/2 MS＋15 g/L 蔗糖＋1.0 mg/L IBA＋0.4 mg/L IAA＋0.6 mg/L NAA＋7 g/L 瓊脂，pH ＝6.0)上培養(yǎng)7 天(前5 天為暗培養(yǎng))，再轉(zhuǎn)入無(wú)激素培養(yǎng)基中，最終生根率可達(dá)72.22%。