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    梨矮化砧木中矮1 號(hào)組培快繁技術(shù)研究

    2023-07-17 07:36:24王藝衡馮靜涵于春亮李濤李金斗趙健霄張海霞張玉星馬輝許建鋒
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2023年6期
    關(guān)鍵詞:根數(shù)培苗外植體

    王藝衡,馮靜涵*,于春亮,李濤,李金斗,趙健霄,張海霞,3,張玉星,3,馬輝,3,許建鋒,3

    (1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,河北保定 071051;2. 威縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,河北威縣 054700;3. 河北省梨技術(shù)創(chuàng)新中心,河北保定 071051)

    矮化密植栽培具有早果豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)高效、省地易管等優(yōu)點(diǎn),利用矮化砧木是實(shí)現(xiàn)梨矮化密植的重要途徑,但是國(guó)外選育的梨矮化砧木大都因其適應(yīng)性差而不宜在我國(guó)推廣應(yīng)用。 梨矮化砧木中矮1 號(hào)的代號(hào)為S2,由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所在1980 年從‘錦香’梨(南果梨×巴梨) 的實(shí)生后代中選育而成,具有果實(shí)品質(zhì)優(yōu)良、樹(shù)冠矮化緊湊、豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、抗病性強(qiáng)(強(qiáng)抗腐爛病和枝干輪紋病)等特性,是我國(guó)北方梨園矮化密植的常用砧木[1-3]。

    由于梨屬植物具有童期較長(zhǎng)、自交不親和、雜合程度高等特質(zhì),其實(shí)生繁殖易造成果園整齊度差和苗木良莠不齊,這嚴(yán)重影響建園效果和優(yōu)良砧木在生產(chǎn)上的應(yīng)用推廣,所以無(wú)性系砧木成為現(xiàn)代果園生產(chǎn)的基礎(chǔ),無(wú)性育苗成為現(xiàn)代果業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。 在無(wú)性繁殖中,嫁接、扦插等營(yíng)養(yǎng)繁殖存在成本高、速度慢、質(zhì)量差、品種混雜、病毒感染嚴(yán)重等諸多弊端[4,5],最關(guān)鍵的是中矮1號(hào)極難扦插成活。 組培快繁與之相比則具有增殖系數(shù)高、病害率少、基因型一致、不受季節(jié)和環(huán)境影響、短期大規(guī)模生產(chǎn)等眾多優(yōu)勢(shì),已被廣泛應(yīng)用于植物的快速繁殖、品種改良、基因工程育種和種質(zhì)資源保存等方面,在梨無(wú)性系砧木生產(chǎn)和現(xiàn)代生物育種中具有重要作用[6-9]。 但目前,組培快繁技術(shù)仍存在增殖系數(shù)低、生根率低、重復(fù)性差等問(wèn)題。 所以本試驗(yàn)以梨矮化砧木中矮1 號(hào)為試材,研究篩選其適宜的外植體種類(lèi)及消毒方式、繼代和生根培養(yǎng)基及生根條件,以建立起一種增殖系數(shù)高、生根效果好的組培快繁技術(shù),為建立高效、穩(wěn)定的組培快繁體系提供依據(jù),為梨的轉(zhuǎn)基因研究和遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    2021 年3 月于河北省邢臺(tái)市威縣香花營(yíng)種質(zhì)資源圃,剪取芽體飽滿但未萌發(fā)的一年生中矮1 號(hào)健壯枝條,置于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)梨中心溫室中進(jìn)行水培催芽,隔日換水以促進(jìn)萌發(fā)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 中矮1 號(hào)外植體種類(lèi)及消毒時(shí)間篩選將萌發(fā)后的芽體完整地取下(不破壞生長(zhǎng)點(diǎn))并作為外植體,將其分為莖段芽、混合芽、無(wú)花芽混合芽、葉芽四種(圖1A ~D)。 首先用洗潔精水清洗外植體2 min,然后將其置于燒杯中并用雙層紗布封口后用自來(lái)水沖洗30 min,最后在超凈工作臺(tái)中用75%酒精涮洗30 s→0.1%升汞涮洗(3、5、7)min→無(wú)菌水沖洗30 s→用濾紙吸干水分后接種于初代培養(yǎng)基(MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.4 mg/L GA3+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂+2 g/L PVA,pH=6.0)中。 培養(yǎng)室條件:光照強(qiáng)度為4 000 lx,光照時(shí)間為16 h,溫度為24℃,下同。 30天時(shí)統(tǒng)計(jì)其成活率、污染率和褐變率。

    圖1 四種外植體和兩種幼化程度的苗

    1.2.2 中矮1 號(hào)組培苗繼代培養(yǎng)基篩選 切取初代培養(yǎng)30 天時(shí)長(zhǎng)勢(shì)一致的1.5 cm 長(zhǎng)莖尖,分別接種于表1 正交設(shè)計(jì)的①~⑨號(hào)繼代培養(yǎng)基(MS+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂+2 g/L PVA+表1中的激素組合,pH =6.0)中。 每個(gè)處理接種20株,重復(fù)3 次,30 天時(shí)統(tǒng)計(jì)其增殖系數(shù)、芽長(zhǎng)、苗高、葉片數(shù)、節(jié)間數(shù)和節(jié)間長(zhǎng)度。

    1.2.3 中矮1 號(hào)組培苗生根培養(yǎng)基篩選 生根培養(yǎng)采用兩步生根法,即第一步先切取繼代培養(yǎng)30 天時(shí)長(zhǎng)勢(shì)一致且健壯的3.5 cm 長(zhǎng)組培苗,分別接種于表2 正交設(shè)計(jì)的①~⑨號(hào)生根培養(yǎng)基(1/2 MS+15 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂+2 g/L PVA+表2 中的生根調(diào)節(jié)物質(zhì)組合,pH=6.0)中誘導(dǎo)7 天,其中前5 天進(jìn)行暗培養(yǎng),后續(xù)轉(zhuǎn)為全光照培養(yǎng);第二步將誘導(dǎo)后的組培苗轉(zhuǎn)接至不含激素的培養(yǎng)基(1/2MS+15 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂+2 g/L PVA,pH=6.0)中培養(yǎng)33 天。 每個(gè)處理接種20 株,重復(fù)3 次,40 天時(shí)統(tǒng)計(jì)其生根率、根數(shù)、根長(zhǎng)和生根所需天數(shù)。

    表2 生根培養(yǎng)基調(diào)節(jié)物質(zhì)L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(mg/L)

    1.2.4 光照對(duì)中矮1 號(hào)組培苗生根的影響 將組培苗接種于⑨號(hào)生根培養(yǎng)基(1/2MS +15 g/L蔗糖+7 g/L 瓊脂+2 g/L PVA+1.5 mg/L IBA+0.8 mg/L IAA+0.3 mg/L NAA,pH=6.0)后,分別在強(qiáng)光(4 000 lx)、弱光(無(wú)燈管直照處)、微光(開(kāi)口箱子中)、黑暗(暗箱中)四種光照環(huán)境下培養(yǎng)5天,其它條件同上。 每個(gè)處理接種30 株,40 天時(shí)統(tǒng)計(jì)生根指標(biāo)。

    1.2.5 組培苗幼化程度對(duì)中矮1 號(hào)組培苗生根的影響 分別將剛完成繼代培養(yǎng)的幼嫩苗(圖1E)和經(jīng)過(guò)一次生根培養(yǎng)但未生根的成熟苗(圖1F)接種于⑤號(hào)生根培養(yǎng)基(1/2MS +15 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂+2 g/L PVA+1.0 mg/L IBA+0.4 mg/L IAA+0.6 mg/L NAA,pH=6.0)中,其它條件同上。 每個(gè)處理接種30 株,40 天時(shí)統(tǒng)計(jì)生根指標(biāo)。

    1.2.6 一步生根法對(duì)中矮1 號(hào)組培苗生根的影響 選取30 株組培苗使用一步生根法來(lái)進(jìn)行生根培養(yǎng),即全程在⑨號(hào)生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)(前5天為暗培養(yǎng)),期間不更換培養(yǎng)基,40 天時(shí)統(tǒng)計(jì)生根指標(biāo)。 以使用兩步生根法進(jìn)行生根培養(yǎng)的組培苗為對(duì)照,比較二者生根過(guò)程中的差異。

    1.3 指標(biāo)計(jì)算及方法

    褐化率(%)=外植體褐化數(shù)/外植體接種數(shù)×100;污染率(%)=外植體污染數(shù)/外植體接種數(shù)×100;成活率(%)=外植體成活數(shù)/外植體接種數(shù)×100。

    增殖系數(shù)=增殖芽總數(shù)/接種株數(shù);平均株高=苗干總高/接種株數(shù);平均葉片數(shù)=完全展開(kāi)的葉片總數(shù)/接種株數(shù);平均芽長(zhǎng)=增殖芽總長(zhǎng)/接種株數(shù)。

    生根率(%)=生根株數(shù)/接種株數(shù)×100;平均根數(shù)=總根數(shù)/生根株數(shù);平均根長(zhǎng)=總根長(zhǎng)/總根數(shù);平均生根天數(shù)=(生根日期-接種日期)/生根株數(shù)。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS Statistics 25 進(jìn)行方差分析,用Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較,用Microsoft Excel 制圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 中矮1 號(hào)外植體種類(lèi)及消毒時(shí)間篩選結(jié)果

    由表3 可以看出,0.1%升汞消毒3 min 時(shí),葉芽成活率(91.7%)最高,其次為無(wú)花芽混合芽(44.4%);消毒5 min 時(shí),無(wú)花芽混合芽成活率(34.5%)高于葉芽(25.8%);消毒7 min 時(shí),只有無(wú)花芽混合芽成活,成活率為33.3%;三個(gè)消毒時(shí)段下莖段芽和混合芽均無(wú)成活株。除莖段芽,另外三種外植體的褐化率隨消毒時(shí)間延長(zhǎng)而升高。無(wú)花芽混合芽和葉芽的成活率隨消毒時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。

    表3 不同消毒時(shí)間和外植體種類(lèi)對(duì)外植體引入的影響

    綜上,葉芽和無(wú)花芽混合芽較適合作為中矮1 號(hào)的外植體,引外植體時(shí)的最佳升汞消毒時(shí)間為3 min,總消毒時(shí)間為4 min。

    2.2 中矮1 號(hào)組培苗繼代培養(yǎng)基篩選結(jié)果

    圖2 顯示,⑦號(hào)繼代培養(yǎng)基(MS+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂+2 g/L PVA+1.8 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L GA3,pH =6.0)組培苗的增殖系數(shù)(5.52)最高,顯著高于其它處理;⑥號(hào)培養(yǎng)基(MS+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂+2 g/L PVA+1.4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA,pH =6.0)組培苗的平均芽長(zhǎng)(1.15 cm)最長(zhǎng),9 個(gè)處理間無(wú)顯著差異;⑦號(hào)培養(yǎng)基組培苗的平均苗高(4.14 cm)最高,與⑧號(hào)培養(yǎng)基(MS+30 g/L 蔗糖+7 g/L瓊脂+2 g/L PVA +1.8 mg/L 6-BA +0.1 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA,pH=6.0)無(wú)顯著差異,顯著高于其它處理;⑦號(hào)培養(yǎng)基組培苗的平均葉數(shù)(20.28 片)最多,與⑧號(hào)、⑨號(hào)培養(yǎng)基(MS+30 g/L蔗糖+7 g/L 瓊脂+2 g/L PVA+1.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+0.1 mg/L GA3,pH =6.0)無(wú)顯著差異,顯著多于其它處理;⑦號(hào)培養(yǎng)基組培苗的平均節(jié)間數(shù)(4.89 節(jié))最多,與⑥號(hào)、⑨號(hào)培養(yǎng)基無(wú)顯著差異,顯著多于其它處理;⑤號(hào)培養(yǎng)基(MS+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂+2 g/L PVA+1.4 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA+0.2 mg/L GA3,pH =6.0)組培苗的平均節(jié)間長(zhǎng)度(1.23 cm)最長(zhǎng),9 個(gè)處理間無(wú)顯著差異。

    圖2 不同增殖激素組合對(duì)組培苗繼代培養(yǎng)的影響

    極差分析結(jié)果(表4)表明,四種激素中6-BA對(duì)繼代增殖的影響最大,主要影響增殖系數(shù)、苗高、葉片數(shù)和節(jié)間數(shù);NAA 主要影響芽長(zhǎng)和節(jié)間長(zhǎng)度;GA3對(duì)芽長(zhǎng)、苗高和節(jié)間長(zhǎng)度也有一定影響。 方差分析篩選出的最佳繼代培養(yǎng)基激素組合為:1.8 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA +0.2 mg/L GA3,再結(jié)合圖2 的單因素分析結(jié)果認(rèn)為,1.8 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L GA3為最佳繼代培養(yǎng)基激素組合。

    表4 增殖激素正交試驗(yàn)的方差分析及極差分析

    2.3 中矮1 號(hào)組培苗生根培養(yǎng)基篩選

    圖3 顯示,⑤號(hào)生根培養(yǎng)基(1/2MS+15 g/L蔗糖+7 g/L 瓊脂+2 g/L PVA+1.0 mg/L IBA+0.4 mg/L IAA+0.6 mg/L NAA,pH =6.0)組培苗的生根率(72.22%)最高,顯著高于其它處理;⑨號(hào)培養(yǎng)基(1/2MS +15 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂+2 g/L PVA+1.5 mg/L IBA +0.8 mg/L IAA +0.3 mg/L NAA,pH=6.0)組培苗的平均根數(shù)(5.36 條)最多,僅顯著多于②號(hào)培養(yǎng)基(1/2MS +15 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂+2 g/L PVA+0.5 mg/L IBA+0.4 mg/L IAA +0.3 mg/L NAA +0.5 mg/L AC,pH =6.0),與其余7 個(gè)處理無(wú)顯著差異;⑨號(hào)培養(yǎng)基組培苗的平均根長(zhǎng)(7.74 cm)最長(zhǎng),與⑤號(hào)培養(yǎng)基無(wú)顯著差異,顯著高于其它處理;⑨號(hào)培養(yǎng)基生根所需天數(shù)(13.65 天)最少,與①號(hào)(1/2MS+15 g/L蔗糖+7 g/L 瓊脂+2 g/L PVA +0.5 mg/L IBA,pH=6.0)、③號(hào)(1/2MS+15 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂+2 g/L PVA+0.5 mg/L IBA+0.8 mg/L IAA+0.6 mg/L NAA+1.0 mg/L AC,pH=6.0)、④號(hào)(1/2MS+15 g/L蔗糖+7 g/L 瓊脂+2 g/L PVA+1.0 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA+1.0 mg/L AC,pH =6.0)、⑤號(hào)培養(yǎng)基無(wú)顯著差異,顯著少于其它處理。

    圖3 不同生根調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對(duì)組培苗生根的影響

    極差分析結(jié)果(表5)表明,四種生根調(diào)節(jié)物質(zhì)中AC 對(duì)組培苗生根的影響最大,為四項(xiàng)生根指標(biāo)的最主要影響因素,高濃度的AC 會(huì)影響組培苗的生長(zhǎng)狀態(tài),可能造成組培苗葉片枯黃、頂梢發(fā)黑、基部不長(zhǎng)愈傷;IBA 主要影響生根率;IAA 主要影響根數(shù)和根長(zhǎng);NAA 主要影響生根所需天數(shù)。 方差分析篩選出的最佳生根調(diào)節(jié)物質(zhì)組合為:1.0 mg/L IBA+0.8 mg/L IAA+0.6 mg/L NAA,結(jié)合圖3 的單因素分析結(jié)果認(rèn)為,1.0 mg/L IBA+0.4 mg/L IAA+0.6 mg/L NAA 為最佳生根調(diào)節(jié)物質(zhì)組合。

    表5 生根調(diào)節(jié)物質(zhì)正交試驗(yàn)的方差分析及極差分析

    2.4 光強(qiáng)對(duì)中矮1 號(hào)組培苗生根的影響

    由圖4 可以看出,組培苗生根培養(yǎng)前期暗培養(yǎng)5 天的平均生根率(60.00%)最高,顯著高于其它處理,強(qiáng)光培養(yǎng)的生根率(6.67%)最低;微光培養(yǎng)組培苗的平均根數(shù)(4.40 條)最多,暗培養(yǎng)(3.67條)其次,4 個(gè)處理間無(wú)顯著差異;暗培養(yǎng)組培苗的平均根長(zhǎng)(5.55 cm)最長(zhǎng),與微光和弱光培養(yǎng)無(wú)顯著差異,顯著長(zhǎng)于強(qiáng)光培養(yǎng)。 表明,4 個(gè)處理在各自光照強(qiáng)度下培養(yǎng)5 天,其愈傷生成速率隨光照強(qiáng)度的減弱而增加,暗培養(yǎng)下愈傷組織的生成量最多,強(qiáng)光培養(yǎng)則幾乎不產(chǎn)生愈傷。

    圖4 不同光強(qiáng)對(duì)組培苗生根的影響

    4 個(gè)處理生根培養(yǎng)40 天后,總體的生根效果隨光照的減弱而變好,強(qiáng)光培養(yǎng)組培苗的生根效果較差,根數(shù)少且短粗,暗培養(yǎng)的生根質(zhì)量較好,根數(shù)多且細(xì)長(zhǎng)。

    綜上,生根培養(yǎng)前期暗培養(yǎng)5 天更有益于中矮1 號(hào)組培苗生根。

    2.5 苗幼化程度對(duì)中矮1 號(hào)組培苗生根的影響

    由表6 可以看出,幼嫩苗的生根率、平均根數(shù)、平均根長(zhǎng)都要高于成熟苗,生根速度也更快。幼嫩苗莖段基部的愈傷組織大小適中,根系細(xì)軟(圖5A),而成熟苗的愈傷組織則較小,根系粗硬(圖5B)。 綜上,繼代培養(yǎng)40 天的幼嫩苗生根效果更好。

    圖5 幼嫩苗(A)和成熟苗(B)的生根效果對(duì)比

    表6 幼嫩苗和成熟苗的生根指標(biāo)對(duì)比

    2.6 一步生根法對(duì)中矮1 號(hào)組培苗生根的影響

    圖6 A 顯示,組培苗用一步生根法生根培養(yǎng)后的愈傷組織生成量極大,生長(zhǎng)狀態(tài)較差,出現(xiàn)苗細(xì)弱、葉焦邊、枯尖等現(xiàn)象,沒(méi)有出現(xiàn)生根苗。 兩步生根法的組培苗愈傷組織大小正常,苗健康粗壯,根系狀態(tài)較好(圖6B)。 所以?xún)刹缴ǜm合中矮1 號(hào)的生根培養(yǎng)。

    圖6 一步生根苗(A)和兩步生根苗(B)的生根效果對(duì)比

    3 討論與結(jié)論

    外植體的高效引入是建立組培快繁技術(shù)的關(guān)鍵,外植體種類(lèi)和滅菌方法的選擇將直接影響其成活率。 本試驗(yàn)采用的外植體為早春時(shí)溫室中水培萌發(fā)的嫩梢,其本身攜帶的病菌、酚類(lèi)物質(zhì)較少,酶活性較弱,所以污染率、褐變率不高[6,10]。本試驗(yàn)用于篩選的四種外植體中,混合芽多在花芽和花穗處滋生真菌,莖段芽則在莖部滋生真菌,二者與葉芽、無(wú)花芽混合芽相比滅菌難度較大,滅菌時(shí)間難以把握。 如果滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng),植物細(xì)胞會(huì)受到傷害,導(dǎo)致生長(zhǎng)點(diǎn)死亡,褐化率增高;滅菌時(shí)間太短,外源菌無(wú)法被完全消滅,導(dǎo)致污染率增高[4,7]。 因此合理的滅菌時(shí)間將直接關(guān)系到外植體的成活。

    植物激素是促進(jìn)植物組織分化的重要調(diào)節(jié)物質(zhì),不同的激素組合及濃度配比可能會(huì)刺激不同基因控制的酶類(lèi),從而影響內(nèi)源激素的分布水平,進(jìn)而影響不定芽的增殖效果和植株的生長(zhǎng)狀態(tài),因此篩選適宜的激素組合是建立組培快繁技術(shù)的關(guān)鍵[4,10,11]。 6-BA 可促使腋芽萌發(fā)和抑制頂端優(yōu)勢(shì),對(duì)組培苗增殖的影響最大,但當(dāng)其濃度超過(guò)2.0 mg/L 時(shí)會(huì)加劇組培苗的玻璃化,抑制芽和莖的伸長(zhǎng)[1,12,13];低濃度的GA3可促進(jìn)植物細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng),進(jìn)而影響組培苗的增殖數(shù)和苗高[14];低濃度的NAA 能促進(jìn)莖干上腋芽的分生,且對(duì)苗高起一定的主導(dǎo)作用[15,16]。 本研究結(jié)果與以上論述相一致。 前人研究中,蔡猛[17]篩選的中矮1號(hào)繼代培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L 6-BA +0.3 mg/L IBA+30 g/L 蔗糖+6 g/L 瓊脂)的增殖系數(shù)為3.38;及華等[18]篩選的繼代培養(yǎng)基(MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+0.1 mg/L GA3+20 g/L 蔗糖+6.5 g/L 瓊脂)的增殖系數(shù)為3.4;羅婭等[19]篩選的繼代培養(yǎng)基(MS +3.0 mg/L BA +0.2 mg/L IBA+2.0 mg/L GA3+30 g/L 蔗糖+6 g/L 瓊脂)的增殖系數(shù)為3.88。 本試驗(yàn)篩選出的繼代培養(yǎng)基的平均增殖系數(shù)為5.52,較前人研究結(jié)果有明顯提高,且組培苗繼代30 天的平均苗高可達(dá)4.14 cm。高壯苗可以更早地進(jìn)行后續(xù)的生根培養(yǎng),從而加速育苗進(jìn)程。

    生長(zhǎng)素的種類(lèi)及濃度是影響組培苗生根的關(guān)鍵因素[20]。 首先,對(duì)于生根困難的果樹(shù)材料,兩步生根法要好于一步生根法,其原因可能為根原基誘導(dǎo)、根和莖的生長(zhǎng)對(duì)生長(zhǎng)素的需求濃度不同,根原基的形成需要在高濃度生長(zhǎng)素下進(jìn)行誘導(dǎo),而根的生長(zhǎng)發(fā)育階段,高濃度的生長(zhǎng)素反而會(huì)抑制幼根生長(zhǎng)[21-23];一步生根法較省時(shí)省力,可降低移瓶過(guò)程中組培苗污染的可能性,但組培苗的莖段基部易生成大團(tuán)愈傷組織,不利于其誘導(dǎo)生根和移栽成活。 其次,組培苗在混合生長(zhǎng)素下培養(yǎng)其生根效果要好于單一生長(zhǎng)素:IBA 可以誘發(fā)根原基形成,促進(jìn)內(nèi)源激素IAA 的運(yùn)輸,可在輔酶作用下轉(zhuǎn)化成IAA 來(lái)發(fā)揮作用[7];羅嘉亮等[8]認(rèn)為IBA 的生根誘導(dǎo)效果最佳,但李曉剛[12]和方明[9]等認(rèn)為IBA 對(duì)組培苗的生根無(wú)顯著性影響;IAA 是影響不定根形成的重要因子,但其易被氧化酶氧化,性質(zhì)不穩(wěn)定且作用持續(xù)的時(shí)間較短[8];NAA 可以促進(jìn)組培苗儲(chǔ)存的淀粉水解為還原糖,有利于不定根的形成,但高濃度NAA 會(huì)使組培苗基部產(chǎn)生較大的愈傷,誘導(dǎo)出的根較粗短,不利于移栽成活[8,23,24];活性炭(AC)可以吸附某些有害物質(zhì),為組培苗提供暗環(huán)境,提高組培苗的可溶性蛋白和總糖含量,從而有利于根的誘導(dǎo)和根系生長(zhǎng),但活性炭濃度太高時(shí)則可能減少愈傷組織的生成,吸附大部分的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)及對(duì)生根有利的物質(zhì),從而抑制根的發(fā)生[24]。 欒曉龍等[25]在生根培養(yǎng)基中添加1.0 g/L AC,顯著提高山梨的生根率和生根條數(shù);王宏偉等[15]研究表明豆梨組培苗的增殖系數(shù)和株高隨著活性炭濃度的提高而降低;劉翠瓊[26]試驗(yàn)表明0.5 g/L AC 可提高巴梨的生根率,1.0 g/L AC 則會(huì)起到抑制作用。本研究表明,AC 對(duì)組培苗生根的影響最大,0.5、1.0 g/L AC 均對(duì)中矮1 號(hào)的生根起明顯抑制作用;IBA 主要影響生根率;IAA 主要影響根數(shù)和根長(zhǎng);NAA 主要影響生根所需天數(shù)。 前人研究中,蔡猛[17]篩選的中矮1 號(hào)生根培養(yǎng)基(1/2MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂)的生根率為50.1%,平均根數(shù)為2.99 條;羅婭等[19]篩選的培養(yǎng)基(1/2QL+5.0 mg/L IBA+5.0 g/L 蔗糖上暗培養(yǎng)10 d→1/2QL+5.0 g/L 蔗糖+0.5 g/L AC)為67%,平均根數(shù)為1.5 條;及華[27]篩選的培養(yǎng)基(ASH+2.0 mg/L IBA+20 g/L 蔗糖+6.5 g/L 瓊脂上暗培養(yǎng)7 ~9 d→ASH+蛭石+20 g/L 蔗糖+6.5 g/L 瓊脂)為70%,平均根數(shù)為3 條。 本試驗(yàn)優(yōu)選出的生根培養(yǎng)基其生根率為72.22%,平均根數(shù)為5.36 條,明顯多于前人研究中的誘導(dǎo)結(jié)果,生根效果較好。

    暗培養(yǎng)時(shí)間、光強(qiáng)、苗的幼化程度等也是影響組培苗生根的重要因素。 暗培養(yǎng)時(shí)間受組培苗生長(zhǎng)狀態(tài)、繼代次數(shù)和培養(yǎng)環(huán)境等因素影響,合適的時(shí)間有助于組培苗根的形成,但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易造成組培苗細(xì)弱、葉焦邊、枯尖等現(xiàn)象[23,26]。 培養(yǎng)時(shí)的光強(qiáng)不同,生根效果也有很大差異。 本試驗(yàn)中,光強(qiáng)越弱,生根越早,根系質(zhì)量越好。 分析其原因可能是,暗環(huán)境更有利于根原基的誘導(dǎo),更早的形成愈傷組織。 本研究認(rèn)為,中矮1 號(hào)組培苗的生根能力還與其幼化程度有關(guān),與成熟組織相比,幼齡組織和過(guò)渡態(tài)組織具有更強(qiáng)的再生能力,因?yàn)槠浼?xì)胞具有強(qiáng)大的分裂能力,這是根原基形成的前提條件[27]。

    綜之,本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)梨矮化砧木中矮1 號(hào)組培快繁影響因素的研究而建立的離體快繁技術(shù)為:以中矮1 號(hào)一年生枝條水培萌發(fā)的葉芽或無(wú)花芽混合芽為外植體,采取75%酒精30 s→0.1%升汞3 min→無(wú)菌水30 s 的消毒方式進(jìn)行滅菌,然后接種于啟動(dòng)培養(yǎng)基(MS +30 g/L 蔗糖+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.4 mg/L GA3+7 g/L瓊脂,pH =6.0)上;30 天時(shí)轉(zhuǎn)接入繼代培養(yǎng)基(MS+30 g/L 蔗糖+1.8 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L GA3+7 g/L 瓊脂,pH =6.0)上增殖培養(yǎng),增殖系數(shù)可達(dá)5.52;30 天時(shí)轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基(1/2 MS+15 g/L 蔗糖+1.0 mg/L IBA+0.4 mg/L IAA+0.6 mg/L NAA+7 g/L 瓊脂,pH =6.0)上培養(yǎng)7 天(前5 天為暗培養(yǎng)),再轉(zhuǎn)入無(wú)激素培養(yǎng)基中,最終生根率可達(dá)72.22%。

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