遠兵強,田春麗,胡瑩瑩
(河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院農(nóng)業(yè)工程學院,河南中牟 451450)
根際促生菌(PGPR)是植物根際重要的微生物組成部分,對植物的生長發(fā)育和病害防治具有深遠影響[1]。 大量研究表明,PGPR 具有固氮、溶磷、解鉀、嗜鹽、螯合鐵、分泌抗生素及促進激素合成等功能[2],近年來已越來越多地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,并有望在未來部分替代化肥和農(nóng)藥。 然而,在某些環(huán)境中,外源PGPR 進入土壤可能因為環(huán)境驟變以及與土著菌競爭等原因而無法存活[3]。因此,優(yōu)良的載體是保證PGPR 菌株田間施用效果的關(guān)鍵,合格的載體應(yīng)具備透氣性好、能提供基礎(chǔ)養(yǎng)分及免受土壤動物取食的特點[4]。
生物炭(BC)是植物殘體、城市垃圾及畜禽糞便等生物質(zhì)材料在限氧或無氧條件下,經(jīng)中低溫熱裂解得到的一類富碳產(chǎn)物[4,5]。 BC 具有良好的孔隙排列結(jié)構(gòu)、較大的比表面積、優(yōu)良的陽離子交換性能及較高的pH 值,已被證明可有效改善土壤理化性質(zhì)[6]。 此外,BC 在調(diào)節(jié)土壤微生物學特性方面亦發(fā)揮著重要作用。 前人研究表明,外源施用生物炭可導致土壤微生物群落發(fā)生顯著而快速的變化,影響土壤微生物的組成和相關(guān)種類的豐度[7]。 這表明生物炭有利于土壤中微生物的增殖,這些變化可能會驅(qū)動養(yǎng)分循環(huán),隨后直接或間接影響植物生長,然而目前關(guān)于生物炭與微生物組配施用的效果仍處于起步階段。
番茄(Solanum lycopersicumL.)是全球廣泛種植的蔬菜類型,是保障民生的重要食材。 一般而言,為提高番茄的水肥利用效率,通常將肥料采用水溶性灌根施入,且灌溉水源多為咸水,加上大棚中較高的溫度及二氧化碳濃度,易使棚中土壤鹽漬化[8]。 土壤鹽漬化產(chǎn)生的鹽脅迫可在細胞、組織和分子水平上影響番茄植株的代謝與發(fā)育,造成番茄大幅度減產(chǎn),已成為危及番茄種植效益的重要限制因素[9]。 鹽漬土的有效改良已成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)化發(fā)展亟待解決的問題。 目前鹽漬化土壤改良方法主要為施用有機肥,且主要關(guān)注土壤Na+含量和理化性質(zhì),較少關(guān)注土壤微生物的變化[10]。 基于此,本試驗研究生物炭、根際促生菌對番茄氮素利用效率、鹽漬化土壤改良效果及土壤微生物群落組成的影響,以期為生物炭和根際促生菌的可持續(xù)化生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。
試驗于2021 年4—6 月在河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學院蔬菜試驗大棚中進行。 供試番茄品種為鄭番1733,來自河南農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所。 將種子45℃水浴15 min 進行表面滅菌,蒸餾水浸泡2 h,之后采用蔬菜育苗盤培養(yǎng)至四葉期。
供試生物炭來自河南省生物炭工程技術(shù)研究中心。 采用玉米和小麥秸稈(W/W,1 ∶2)在低氧、440℃條件下連續(xù)炭化65 min 制得。 其基本性質(zhì):全碳含量49.82%、總氮2.13%、比表面積15.66 m2/g、容重0.26 g/cm3、pH 值8.36,主要官能團為羥基、烷烴和酰胺基。 PGPR 菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium),已證實該復合菌株可有效促進番茄植株生長[11],施用菌落數(shù)量約為2×108CFU/mL。 供試氮磷鉀肥分別為尿素(N 46%)、過磷酸鈣(P2O546%)和氯化鉀(K2O 60%),三者均為分析純,皆購自默克化學試劑公司。
供試土壤類型為黃褐土,耕層土壤理化性質(zhì):有機質(zhì)含量20.09 g/kg,全氮1.11 g/kg,堿解氮70.23 mg/kg,有效磷18.85 mg/kg,速效鉀127.36 mg/kg,鹽分1.38%,pH 值8.01。
試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計,共設(shè)置5 個處理,分別為不施肥處理(C0)、常規(guī)施肥處理(CK)、常規(guī)施肥+接種根際促生菌處理(PG)、常規(guī)施肥+生物炭處理(BC)、常規(guī)施肥+生物炭+接種根際促生菌處理(PGB),重復3 次。 小區(qū)面積20 m2(長5 m、寬4 m),小區(qū)間采用40 cm 寬淺溝分隔。
常規(guī)施肥處理中,番茄移栽前條施尿素、過磷酸鈣和氯化鉀(N 225 kg/hm2,N ∶P2O5∶K2O =5 ∶4 ∶4);生物炭用量為3 000 kg/hm2,采用小型旋轉(zhuǎn)耕茬機以20 cm 深度翻耕施入并起壟。 番茄苗移栽為一穴兩株,穴距40 cm。 移栽后根際促生菌采用灌根施入,用量為50 mL/穴。 試驗過程中番茄按照常規(guī)灌溉、除草及病蟲害防治方法進行管理,培育75 d。
培養(yǎng)結(jié)束后,剪去番茄植株地上部,去除0~1 cm 表層土壤,采用小鐵鏟將根系完整挖出,去除距離根系較遠的外圍土壤,小心抖動根系表面土壤,無法抖落的土壤采用干凈刷子輕輕刷落[12]。將各處理土壤混合后分為三部分:一部分保存于-20℃用于土壤Illumina Hiseq 分析;一部分保存于-4℃用于土壤酶活分析;最后一部分采用自然風干研磨過篩用于土壤理化性質(zhì)分析。
1.4.1 土壤理化性質(zhì)測定 參照鮑士旦[13]的方法測定土壤各項指標。 采用pH 計測定土壤pH值(水∶土=2.5 ∶1),土壤總鹽度(TS)采用電導法測定,土壤容重(BD)采用環(huán)刀法測定,土壤有機質(zhì)含量(OM)采用K2Cr2O7氧化還原滴定法測定,總氮(TN)采用半微量凱氏定氮法測定,有效氮(AN)采用堿解擴散法測定,全磷(TP)、全鉀(TK)用NaOH 熔融后分別采用火焰光度法、鉬銻抗比色法測定,有效磷(AP) 采用0.5 mol/L NaHCO3浸提分光光度法測定,速效鉀(AK)采用NH4OAc浸提火焰光度法測定。
1.4.2 土壤酶活性測定 包括亞硝酸還原酶(NiR)、脲酶(UrE)、纖維素酶(CeL)及木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)活性,分別采用杭州銳創(chuàng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒G0310F、G0301F、G0308F 及G0331F 測定。
1.4.3 土壤微生物群落分析 (1)土壤基因組DNA 的提取:采用DNA 提取試劑盒(Omega Biotek, Norcross, GA, US)對土壤進行基因組DNA的提取。 通過在0.7%瓊脂糖凝膠上電泳并使用Nanodrop 2000 分光光度計(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE)評估DNA 濃度和質(zhì)量。 細菌擴增引物采用細菌16S rRNA V3—V4 區(qū)間:338F ( ACTCCTACGGGAGGCAGCAG ), 806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。 以土壤基因組DNA 為模板,通過兩輪PCR 擴增,具體反應(yīng)條件及反應(yīng)步驟參考Li 等[14]的方法。 兩輪擴增結(jié)束后采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增數(shù)量與質(zhì)量,采用QIAquick Gel Extraction 試劑盒(QIAGEN, Crawley, UK)純化。
(2)DNA 純化及Illumina-Mi Seq 測序:對于PCR 產(chǎn)物文庫和正常擴增片段在400 bp 以上PCR 產(chǎn)物,選用60%磁珠(VAHTSTMDNA Clean Beads)處理。 使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit (Illumina, USA)生成測序文庫,采用Illumina NovaSeq PE3000 對基因文庫進行高通量測序。
(3)Illumina-Mi Seq 測序數(shù)據(jù)的處理:采用FASTP 軟件對產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)進行雙端篩選,以去除錯誤堿基及低質(zhì)量序列(Phred >20),并以FASTQ 文件格式儲存,采用FLASH 對有效數(shù)據(jù)進行拼接。 借助SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫(http:/ /www.arb-silva.de/)基于Mothur 算法對相關(guān)代表性序列進行分類信息注釋,使用MUSCLE 對相似度為97%的操作分類單位(OTU)信息進行歸一化,利用RDP 對細菌Silva 數(shù)據(jù)庫(SSU132)比對進行物種分類注釋,以獲取每條序列從phylum 到genus 的分類信息[15]。 利用Mothur 軟件統(tǒng)計每個生物樣本的Chao1 和Shannon 多樣性指數(shù)。 借助R 語言計算并繪制未加權(quán)unifrac 距離的非度量多維縮放(NMDS)的多元統(tǒng)計。 利用高通量測序數(shù)據(jù)與土壤理化因子進行冗余分析(RDA)。 以上分析委托杭州銳創(chuàng)生物技術(shù)有限公司完成。
采用Microsoft Excel 2016 進行數(shù)據(jù)整理,采用SPSS 19.0 軟件進行單因素方差分析(ANOVA),采用鄧肯氏多重比較法進行差異顯著性檢驗(α =0.05),采用R 語言、Origin 2020 軟件進行繪圖。
由表1 可知,生物炭、根際促生菌處理(PG、BC、PGB)與常規(guī)施肥處理(CK)、不施肥處理(C0)在土壤總鹽度(TS)含量、pH 值、土壤容重(BD)、有機質(zhì)(OM)、全氮(TN)、速效鉀(AK)含量等共10 個土壤指標中均存在一定差異。 與C0相比,CK 處理提高OM、全量養(yǎng)分(TN、TP、TK)和速效養(yǎng)分(AN、AP、AK)含量,而BD、TS 和pH 值略微下降。 與CK 相比,生物炭與根際促生菌處理可增加土壤全量養(yǎng)分、速效養(yǎng)分、OM 含量,而降低TS、pH 及BD。 整體而言,各指標中多以PGB 處理存在極值。 以上結(jié)果表明,生物炭與根際促生菌配施對土壤理化性質(zhì)有顯著影響,是改善鹽漬化土壤性狀的有效措施。
表1 生物炭與根際促生菌對鹽漬化土壤理化性質(zhì)的影響
由圖1A 可知,土壤亞硝酸還原酶(NiR)活性各處理間均存在顯著差異,與C0 相比,各施肥處理顯著提高2.04~3.56 倍,且以PGB 處理NiR 活性最高,PG、BC 較PGB 分別顯著低16.92%、9.62%。各處理土壤脲酶(UrE)活性表現(xiàn)為C0 <CK<BC<PG<PGB,與PGB 處理相比,C0、CK、PG、BC 分別顯著降低71.54%、57.45%、32.39%、38.83%(圖1B)。 土壤纖維素酶(CeL)活性以C0最低,與CK 無顯著差異,兩者皆顯著低于生物炭與根際促生菌各處理,且以PGB 處理最大,較其他處理顯著降低20.88%~52.15%(圖1C)。 各處理土壤木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)活性表現(xiàn)為C0<CK<PG<BC<PGB,其中C0 與CK 無顯著差異,但均顯著低于生物炭與根際促生菌各處理;整體而言,以PGB 處理LiP 活性最高(圖1D)。
圖1 生物炭與根際促生菌對鹽漬化土壤酶活性的影響
Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)是微生物群落多樣性和豐富度的重要表征。 由圖2A 可知,各處理Chao1 指數(shù)表現(xiàn)為C0<CK<BC<PG<PGB;C0與CK 間無顯著差異,但皆顯著小于生物炭與根際促生菌各處理。 而從Shannon 指數(shù)看,各處理表現(xiàn)為C0<CK<PG<BC<PGB,但處理間無顯著差異(圖2B)。 這表明在鹽堿土中施用根際促生菌、生物炭均可對土壤微生物多樣性及豐富度具有積極作用,尤以兩者配施效果最好。
圖2 生物炭與根際促生菌對鹽漬化土壤微生物群落多樣性與豐富度的影響
細菌基因序列測序共獲取31 門575 屬。 圖3A 顯示了土壤樣品中豐度較高的前10 個優(yōu)勢門,可以看出以變形菌門(Proteobacteria)相對豐度最高,為33.32%~36.95%,之后依次是浮霉菌門(Planctomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、芽單胞菌門(Gematimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、 綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、硝化螺旋菌門(Patescibacteria)、厚壁菌門(Firmicutes),分別占總豐度的15.77%~19.97%、13.44%~14.12%、9.06%~11.13%、4.83% ~7.34%、4.02% ~5.56%、3.49%~4.51%、1.59%~3.69%、1.04%~1.63%、0.56%~1.64%;5 種處理間浮霉菌門、酸桿菌門和放線菌門的相對豐度存在明顯差異,即與C0、CK 處理相比,PG、BC 和PGB 處理明顯增加了三者的相對豐度,降低了芽單胞菌門、擬桿菌門、疣微菌門、厚壁菌門的相對豐度。
圖3 生物炭與根際促生菌對鹽漬化土壤微生物群落門水平(A)和屬水平(B)組成的影響
由圖3B 可知,在屬水平上,所有土壤樣品中排名前10 位的依次為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、小梨形菌屬(Pirellula)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、溶桿菌屬(Lysobacter)、Pir4_lineage、出芽菌屬(Gemmata)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophobacter)、Subgroup_10、SH-PL14,不同處理中該10 屬豐度總和為17.86%~22.23%。 與C0 相比,所有施肥處理均增加了小梨形菌屬(Pirellula)、SH-PL14、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophobacter)的相對豐度,而降低了假單胞菌屬(Pseudomonas)的相對豐度,但不同處理間上述屬總豐度均無明顯差異。
由圖4 可知,在代表門水平方面,厚壁菌門(Firmicutes)是各處理豐度最高的門,且在PGB根際土壤微生物群落中豐度最高,分別是C0、CK處理的2.51、1.37 倍。 各處理代表性序列的發(fā)育樹分支分析表明,厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)是各處理中最具代表性的門。 厚壁菌門(Firmicutes)中,C0、CK、PG、BC、PGB 處理的芽孢桿菌屬(Bacillus)相對豐度分別為0.045%、0.077%、0.181%、0.275%、0.382%,且PG、BC、PGB 處理均顯著大于C0、CK 處理。 變形菌門(Proteobacteria)中,C0、CK、PG、BC、PGB 處理的嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)相對豐度分別為0.021%、0.075%、0.164%、0.168%、0.195%,且PG、BC、PGB 處理均明顯大于C0、CK。 以上結(jié)果表明,根際促生菌、生物炭對細菌群落組成和豐度的影響存在一定差異,其中生物炭對細菌群落的影響大于根際促生菌,兩者組合施用對微生物群落組成的影響最大。
圖4 微生物群落門、屬水平代表性序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹
基于unifrac 距離的非度量多維尺度分析(NMDS)結(jié)果(圖5A)表明,C0、CK 分布于上半軸,PG 分布于右下軸,BC、PGB 分布于左下軸;C0、CK、PG、BC、PGB 處理間均無明顯交集、各自獨立,表明各處理間的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變異較大。
圖5 不同處理土壤微生物群落間的非度量多維尺度分析(A)和環(huán)境因子與群落結(jié)構(gòu)的冗余分析(B)
冗余分析(RDA)可用于分析環(huán)境因子與相關(guān)微生物群落間的相關(guān)性,箭頭所處的象限表示環(huán)境因子與排序軸間的正負相關(guān)性,箭頭與原點的連線長度代表著該環(huán)境因子與群落分布間相關(guān)程度的大小,連線越長,說明相關(guān)性越大,反之越小。 箭頭連線和排序軸的夾角代表著某個環(huán)境因子與排序軸相關(guān)性的大小,夾角越小,相關(guān)性越高,反之越低。 由圖5B 可知,RDA 的前兩個軸分別解釋了總變異的33.1%和22.0%。 C0、CK、PG、BC、PGB 處理各自分離,就C0、BC 處理而言,各土壤因子對其群落組成的影響較小。 就CK 而言,土壤脲酶(UrE)、木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)是影響其群落組成的主要因子,其中UrE 效應(yīng)最為顯著。 就PG 處理而言,土壤纖維素酶(CeL)、亞硝酸還原酶(NiR)是影響其群落組成的主要因子,尤其表現(xiàn)在CeL 因子。 就PGB 處理而言,土壤有機質(zhì)(OM)是顯著(P=0.00092)影響其群落組成的環(huán)境因子。
物理、生物技術(shù)措施是改良鹽漬土的重要手段。 現(xiàn)有的研究表明生物炭、根際促生菌(PGPR)均可影響土壤中鹽分的分布,改善土壤理化性質(zhì)、優(yōu)化土地利用和促進植物生長[7,11]。
土壤理化性質(zhì)如速效養(yǎng)分、有機質(zhì)(OM)含量以及pH 值等是反映土壤底物可用性及其相關(guān)健康狀況的重要表征[16]。 生物炭具有多孔結(jié)構(gòu)、較大的比表面積、優(yōu)良的陽離子交換性能及較高的pH 值,可降低土壤鹽分含量、提高土壤養(yǎng)分含量及持水能力[6,7]。 本研究中,生物炭處理后土壤鹽度顯著降低,全量養(yǎng)分(TN、TK、TP)、速效養(yǎng)分(AN、AK、AP)和有機質(zhì)(OM)含量明顯提高。這與前人的研究結(jié)論趨于一致,即生物炭可加速土壤養(yǎng)分周轉(zhuǎn)過程、增強微生物活性,從而降低土壤鹽分和提高土壤肥力[17]。 本研究結(jié)果還表明,根際促生菌處理亦可改善土壤理化性質(zhì),這可能是因為PGPR 可以激活土壤功能,加速土壤養(yǎng)分溶解,減少土壤水分蒸發(fā),保證土壤膨壓轉(zhuǎn)換,從而改善土壤理化性質(zhì)[18]。 前人研究表明,土壤鹽分增加會抑制土壤磷酸酶、脲酶及氧化酶等的活性[19]。 本研究結(jié)果表明,C0、CK 處理下的土壤亞硝酸還原酶(NiR)、纖維素酶(CeL)、脲酶(UrE)及木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)活性均較低,而在施用生物炭、PGPR 后這4 種酶活性顯著提高,尤其表現(xiàn)在二者組合施用處理(PGB)。 特別地,UrE是將亞硝酸鹽降解為NO 或NH3的重要催化酶,PGB 處理顯著提高氮循環(huán)中的關(guān)鍵酶(UrE)活性,這意味著土壤中的亞硝酸鹽代謝加快,從而可降低亞硝酸鹽積累對生物體的毒性作用[15]。
生物炭可通過自身的物理化學功能調(diào)節(jié)養(yǎng)分循環(huán),并影響土壤特性、植物生長和生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)性[20]。 PGPR 介導的微生物相互作用,從而對土壤肥力、健康狀況和植物生長發(fā)育產(chǎn)生積極影響[21]。 本研究結(jié)果表明,與不施肥(C0)或常規(guī)施肥處理(CK)相比,PG、BC 和PGB 處理均影響群落Alpha 指數(shù),其中多樣性指數(shù)顯著提高。 基于unifrac 距離的非度量多維尺度分析(NMDS)顯示,5 個處理各自獨立且完全分離。 這表明處理間的土壤微生物群落組成結(jié)構(gòu)不同。 前人研究表明,在生物炭與外源微生物配施中,生物炭扮演著載體的輔助角色,以保護PGPR 免受土壤噬菌體或動物的取食[4,22]。 然而本研究中,NMDS 分析表明PG、BC 完全分離,PG 與PGB 處理距離也較遠,這意味著生物炭發(fā)揮獨立作用,且生物炭和PGPR 對土壤微生物群落的影響機制不同。
在群落結(jié)構(gòu)中,變形菌門(Proteobacteria)是各處理占比豐度最高的優(yōu)勢門,其相對豐度占比33.32%~36.95%,該門包括一些固氮類細菌(如根瘤菌)[23]。 在屬水平上,鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)是相對豐度最高的優(yōu)勢屬,該屬包含許多功能豐富的新型微生物資源,是目前研究中被廣泛認可的可改善逆境環(huán)境的指示性菌群。 此外,Sphingomonas能在營養(yǎng)有限的環(huán)境中生存,表現(xiàn)出反硝化和非共生固氮的特點,因此可能參與氮循環(huán)[24]。 此外,Sphingomonas還可用于芳香族化合物的生物降解,在環(huán)境污染中發(fā)揮著重要作用[25],這可能是該菌能成為鹽漬土壤中優(yōu)勢菌的主要原因。 本研究發(fā)現(xiàn)BC 和PGB 處理顯著增加Sphingomonas的豐度,這可能是因為生物炭可以富集土壤中的固氮菌,進一步改善土壤營養(yǎng)和質(zhì)量,因此BC 和PGB 處理中TN 和AN 含量更高。
此外,微生物群落組成系統(tǒng)發(fā)育分析表明,嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)中,均以生物炭和根際促生菌處理(PG、BC、PGB)顯著大于CK、C0 處理。 嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)和芽孢桿菌屬(Bacillus)是土壤中重要的有益菌群,可分泌多種抗生素、催化酶和生物活性物質(zhì),對改善土壤養(yǎng)分周轉(zhuǎn)活力及降低土壤養(yǎng)分累積具有重要作用[14]。 以往的研究表明,pH 值、SOC、AP 和酶活性等環(huán)境因素決定生態(tài)系統(tǒng)中的土壤微生物群落[12,26]。 本研究RDA 分析表明,土壤酶活性對微生物群落組成具有重要影響,其中就PGB 處理而言,土壤有機質(zhì)(OM)是影響其群落組成的重要環(huán)境因子。 這給予我們啟示:施入一定量的有機肥可能對生物炭與根際促生菌效應(yīng)具有進一步的提升作用。