鋁脅迫下不同小麥基因型根尖多胺含量變化與耐鋁性的關系

余 燕,周茂潤,董 嘉,丁茂文,岳文麗,周可金,孫成亮,林咸永

(1.安徽農業(yè)大學農學院,安徽合肥 230036;2.浙江大學環(huán)境與資源學院,浙江杭州 310058)

全球約30%的土地面積和50%的潛在可耕地是pH值低于5.5的酸性土壤,鋁毒是酸性土壤上作物生長最主要的限制因子[1-3]。鋁毒害后植物表現出的最典型癥狀是根系生長受阻,根尖是鋁毒害的原初位點[4]。鋁毒害會造成植物體一系列生理生化過程紊亂,如抑制養(yǎng)分吸收、干擾激素平衡和植物細胞信號轉導[5-7]。鋁脅迫會引起植物體內活性氧(reactive oxygen species,ROS)代謝失衡,對植物造成氧化損傷[7-9]。植物在鋁脅迫下可通過誘導有機酸分泌、提高根際pH值、改變細胞壁特性和質膜功能等機制抵御鋁的毒害[10-11],但目前關于在對鋁脅迫的適應過程中植物體內多胺、一氧化氮等信號分子的調控機制尚不清楚[12-15]。

多胺是植物體中重要的生理活性物質,可對逆境脅迫作出快速反應,進而啟動合成和分解過程,參與調節(jié)植物對逆境的適應性[16-18]。植物體內常見的多胺包括腐胺(putrescine,Put),亞精胺(spermidine,Spd)和精胺(spermine,Spm)[19-20]。外源添加適量多胺或者通過分子手段調控其代謝途徑可在一定程度上緩解植物逆境損傷[21-24]。關于多胺對植物鋁脅迫的響應也有一些研究報道。 研究發(fā)現,鋁脅迫可誘導水稻根系中Put大量積累,這可能是其抑制水稻根系伸長的原因[25]。而西洋梨[12]和紅蕓豆[26]中Spd或Put的積累有助于增強植株耐鋁性,但也有人認為Put與紅云衫細胞懸浮液的耐鋁性無關[27]。在番紅花中,外源Put、Spd和Spm處理均能顯著緩解鋁對植株根系伸長的毒害作用[28]。由此可見,鋁脅迫下植物體內多胺含量變化及其作用并不完全一致,在農作物上也多采用單一品種進行研究。本試驗以前期篩選的耐鋁性差異顯著的2個小麥基因型為研究材料,分析了鋁脅迫下小麥根尖多胺種類和含量的變化及其與鋁耐性的關系,以期進一步闡明小麥耐鋁性的生理生化機制。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)

本試驗以前期篩選的耐鋁性差異顯著的2個小麥基因型西矮麥1號(耐性)和揚麥5號(敏感)為研究材料[29]。種子消毒清洗后用去離子水浸種過夜,然后用濕潤的紗布包裹置于25 ℃培養(yǎng)箱中避光催芽過夜。將發(fā)芽的種子轉移到懸浮于0.5 mmol·L-1CaCl2(pH 4.3 ± 0.1)溶液的塑料筐上進行培養(yǎng)。營養(yǎng)液的pH用濃度為0.1 mol·L-1的HCl或NaOH進行調節(jié),且每天更換營養(yǎng)液?？刂婆囵B(yǎng)室的光照強度為300 μmol·m-2·s-1,光照和溫度設置為白天12 h/25 ℃和夜晚12 h/22 ℃,相對濕度為70%。3 d后選取長勢一致的小麥幼苗進行處理。試驗設置無鋁對照(CK)和30 μmol·L-1AlCl3處理(Al),在鋁脅迫不同時間取根尖進行測定。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 根系伸長量和鋁含量的測定

將3 d苗齡且長勢一致的小麥幼苗轉移在含0或30 μmol·L-1AlCl3的0.5 mmol·L-1CaCl2(pH 4.3 ± 0.1)溶液中處理3、6、12和24 h。用直尺分別量取鋁脅迫前后的小麥主根長度,各處理重復測定20株。根系伸長量即處理前后的根長度差。小麥根尖鋁含量依據Yu等[14]的方法測定,將處理后的小麥根尖0～10 mm部分(約0.15 g)用刀片迅速切下,用0.5 mmol·L-1CaCl2(pH 4.3 ± 0.1)溶液沖洗3次后放入含10 mL 2 mol·L-1HCl溶液的離心管中震蕩浸提24 h,然后用ICP-MS(Agilent 7500A,California,USA)測定。

1.2.3 根尖MDA含量和Evans Blue吸收量的測定

脂質過氧化程度通常以MDA含量為指標,細胞膜的完整性采用Evans blue吸收量的方法進行測定[31]。

1.2.4 組織染色和顯微觀察

1.2.5 多胺含量的測定

多胺采用高效液相色譜法進行測定[32-33]。小麥根尖用5%(w/v)預冷的高氯酸(perchloric acid,PCA)在冰上充分研磨成勻漿,冰浴浸提1 h后,12 000 g 4 ℃下離心20 min。沉淀用5% PCA進一步提取,離心,重復兩次,分別收集三次所得上清液和沉淀。

取混勻的上清液1 mL裝入安瓿瓶中,加入12 mol·L-1HCl封口,在110 ℃下酸解18 h。酸解后,在70 ℃下干燥后重溶于5% PCA中,然后取上清液加入1 mL 2 mol·L-1NaOH和10 μL苯甲酰氯原液進行衍生,渦旋20 s混勻,37 ℃反應25 min后加入2 mL飽和NaCl混勻中止反應,加入2 mL的乙醚萃取苯甲?；亩喟?離心后取1 mL乙醚相真空干燥,再次加入1 mL乙醚混勻干燥(重復2～3次),直到沒有明顯的苯甲酰氯氣味為止。最后,加入200 μL甲醇渦旋溶解。經0.22 μmol·L-1濾膜過濾后,放入棕色液相色譜瓶內用高效液相色譜儀(Agilent 1200,USA)檢測。進樣量為10 μL,色譜柱為Elipse XDB-C18反向色譜柱(4.6 mm × 150 mm 5 μm;Agilent,USA),柱溫30 ℃,流動相為65%的甲醇,流速0.6 mL·min-1。用紫外檢測器于254 nm處檢測。以Put、Spd、Spm(Sigma-Aldrich)樣品做標準曲線,檢測方法同樣品。沉淀用5% PCA反復洗滌(2～3次)除去殘留的可溶性多胺,然后裝入安瓿瓶中,加入12 mol·L-1HCl封口,110 ℃下酸解18 h。酸解后,過濾除去碳化物質,70 ℃下干燥后,重溶于5% PCA,然后按照上述方法進行衍生和測定。上清液和沉淀中含量相加即為多胺總量,單位為μmol·g-1FW。

1.3 數據分析與作圖

使用DPS 18.10數據處理系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析,處理間差異顯著性運用LSD法比較,采用OriginPro 2022作圖。

2 結果與分析

2.1 鋁脅迫對小麥根系伸長和根尖鋁積累量的影響

鋁脅迫6 h可顯著抑制兩個小麥基因型的根系伸長,且隨著鋁脅迫時間的延長,兩個基因型根系伸長的受抑程度均逐漸增大(圖1)。揚麥5號的根系伸長量始終低于西矮麥1號,且基因型之間的差異隨著鋁脅迫時間的延長而逐漸增大。鋁脅迫24 h后,揚麥5號和西矮麥1號的根系伸長量分別為對照的30.21%和47.15%。鋁脅迫下,揚麥5號根尖的鋁積累量及蘇木精染色深度均顯著高于西矮麥1號(圖2)。這表明鋁脅迫對小麥根系造成了毒害,且揚麥5號根系生長受抑制程度更嚴重。

圖柱上不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下圖同。

圖2 鋁脅迫下兩個不同基因型小麥根尖鋁積累情況

2.2 鋁脅迫對小麥根系氧化損傷和活性氧產生的影響

鋁脅迫24 h后揚麥5號和西矮麥1號根尖MDA含量分別較CK增加了147.20%和 67.12%(圖3A),Evans blue吸收量分別增加了226.96%和196.14%(圖3B)。Schiff’s reagent染色后,鋁脅迫24 h后兩個基因型小麥根尖染色程度均不同程度增加,說明鋁脅迫加劇了小麥根系膜脂過氧化,其中揚麥5號膜脂過氧化程度更嚴重(圖3C)。從Evans blue吸收的染色結果(圖3D)看,鋁脅迫24 h后揚麥5號根尖著色更深,進一步說明其Evans blue吸收量更大,細胞膜完整性的破壞程度更嚴重。

圖3 鋁脅迫對兩個小麥基因型根尖膜脂過氧化程度和細胞膜完整性的影響

圖4 鋁脅迫對兩個小麥基因型根尖活性氧產生的影響

2.3 鋁脅迫對小麥根系多胺含量的影響

在CK條件下,小麥根尖Put含量以及Spd含量較低且相對穩(wěn)定,而Spm未被檢測到(可能由于含量低于檢測限);在鋁脅迫下,2個基因型根尖Put總量隨鋁脅迫時間的延長均不同程度增加,而Spd總含量則呈降低趨勢(圖5)。鋁脅迫6 h時西矮麥1號的Put含量顯著增加,在脅迫12 h時達到峰值32.11 μmol·g-1FW,約為CK的2倍;揚麥5號的Put總量僅在脅迫12 h后比CK增加約26.92%。與Put含量表現相反,鋁脅迫后Spd含量隨鋁脅迫時間延長而逐漸下降,鋁脅迫24 h時揚麥5號和西矮麥5號分別較CK下降 46.24%和24.90%(圖5B)。這表明鋁脅迫誘導的多胺水平差異性變化可能是兩個小麥基因型耐鋁性不同的重要原因。

*和**分別表示在同一時間下Al脅迫處理與CK差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。

2.4 外源多胺及合成抑制劑對小麥根系伸長和氧化損傷的影響

不同濃度和不同種類的多胺對鋁誘導的小麥根系伸長的抑制作用效果不同(圖6)。其中,0.5～10 mmol·L-1Put處理均不同程度地緩解了鋁脅迫對小麥根系伸長的抑制;當Put濃度為2 mmol·L-1時,緩解效果最佳,揚麥5號和西矮麥1號的根系伸長量分別為CK的76.05%和85.00%,分別比鋁單獨處理高152.96%和89.23%,對揚麥5號根系伸長受抑的緩解程度更大。而Spd和Spm不僅無緩解效果,甚至較低的濃度就加劇鋁毒程度(圖6B和C)。

圖6 外源多胺處理對鋁脅迫下小麥幼苗根系伸長的影響

D-精氨酸(D-Arginine,D-Arg)是腐胺合成酶精氨酸脫羧酶(ADC)的競爭性抑制劑,可有效抑制植物體內多胺的合成。圖7結果顯示,CK條件下添加D-Arg對鋁毒害相關的各指標無顯著影響,但在鋁脅迫下添加D-Arg處理后揚麥5號和西矮麥1號根尖的MDA含量、Evans blue吸收量分別增加了48%、107%和43%、69%?？梢?抑制多胺合成加劇了鋁對小麥根系的毒害,且西矮麥1號的加劇幅度更大,反向證明了腐胺可能有增強植物耐鋁性的作用。

圖7 D-精氨酸(D-Arg)對鋁脅迫下小麥幼苗根尖MDA含量和Evans blue吸收量的影響

3 討 論

鋁毒是酸性土壤上限制作物生長最主要的障礙因子,植物根系伸長受抑是鋁毒害后早期最典型的癥狀[4,7,10]。鋁在植物體內的積累常會引起一系列生理生化變化,如活性氧大量積累、膜脂過氧化以及細胞膜完整性損傷程度增加等[8-9,31],同時會誘導植物對鋁毒脅迫的適應性機制,如分泌有機酸、多胺積累等[3,11-13]。本試驗結果表明,鋁脅迫下,西矮麥1號根系中Put含量迅速增加,Spd含量緩慢下降(圖5),同時活性氧積累量(圖4)、MDA含量和Evans blue吸收量較低(圖3),根尖鋁積累量(圖2)和根系伸長受抑程度(圖1)也較輕;而鋁敏感基因型揚麥5號根系Put含量增加較慢且幅度小,而Spd含量下降幅度較大,鋁毒害程度較重,表明鋁脅迫誘導的多胺水平變化與小麥耐鋁性密切有關。

研究表明,多胺對增強植物的抗逆性有重要的作用,并且植物體內多胺水平的變化對逆境脅迫非常敏感,抗性植物在脅迫下通常會積累較高含量的多胺[14,16,19,22]。例如,在鷹嘴豆和大豆中,水分脅迫誘導多胺含量顯著升高,其中Put升幅最大,植株表現出較高脅迫耐性;但多胺尤其Put含量下降時植株則表現出嚴重的脅迫損傷[34]。鹽脅迫可顯著誘導耐性品種Pokkali中Put尤其是結合態(tài)Put的積累,而敏感品種則下降,表明Put積累及其向結合態(tài)轉化有助于增強植物抗鹽性[35]。本研究中,鋁脅迫下不同耐鋁性小麥基因型根尖多胺水平及其變化有所不同。鋁脅迫下西矮麥1號根尖Put含量的增加幅度顯著大于揚麥5號;Spd含量減少,而西矮麥1號下降幅度卻明顯小于揚麥5號(圖5)。這表明Put含量增加可能有利于提高小麥幼苗對鋁脅迫的適應能力,而Spd含量下降則有可能降低耐鋁性。這與Wen等[12]和Wang等[26]研究得出Spd或Put積累有助于增加西洋梨和紅蕓豆的耐鋁性,以及Wang和Kao[25]研究得出Put大量積累是水稻鋁毒害重要原因的結論并不完全一致,其原因可能與植物種類、對鋁脅迫的耐受程度、脅迫程度與時間的不同有關。本研究采用耐鋁性差異顯著的兩個小麥基因型為材料,分析其在短期鋁脅迫下根系多胺含量的變化,更有利于闡明其與耐鋁性的關系。

植物體內多胺生物合成的中心產物是Put,主要來源于ADC和鳥氨酸脫羧酶(CDC)兩種途徑[36]。鳥氨酸脫羧酶途徑主要在植物的生長發(fā)育中起作用,而ADC則與植物對脅迫的響應有關[16,35]。例如,Do等[36]對21個水稻品種多胺合成相關基因表達分析發(fā)現,干旱脅迫誘導的多胺積累主要依賴于ADC途徑。鹽脅迫下植株中ADC活性受抑后,Put合成減少[37]。但也有研究認為,ADC和ODC兩種酶均受氧化脅迫[38]和鎘脅迫[22]誘導,這兩種酶雖然是兩個獨立代謝途徑的關鍵酶,但在某些脅迫條件下可協同調控植物體內多胺水平的變化。我們前期的試驗通過對多胺合成酶活性的測定發(fā)現,鋁脅迫下多胺的合成主要歸因于ADC活性的增加[14]。鋁脅迫下添加ADC抑制劑D-Arg處理顯著加劇了鋁導致的膜脂過氧化和膜透性增加,且對西矮麥1號的加劇程度更嚴重(圖7),進一步反向證明了Put積累在增強小麥耐鋁性中的作用。

4 結 論

鋁脅迫下小麥根尖多胺種類和含量的變化是調控小麥耐鋁性/鋁敏感性的重要因素。鋁誘導的西矮麥1號根尖Put含量大幅增加可能是其具有較強耐鋁性的主要原因,而揚麥5號在鋁脅迫下根尖Spd含量大幅下降可能是其對鋁較敏感的原因。但是關于多胺種類及含量變化是如何影響植物耐鋁性的尚不清楚,關于鋁脅迫下植物體內多胺調控植物耐鋁性的生理和分子機制有待進一步研究。