小麥木瓜類半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21的克隆 及赤霉病菌誘導(dǎo)下的表達(dá)分析

蔣正寧,高致富,壽露露,江 偉,王 玲,陳甜甜,張 勇,高德榮

(江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)江中下游小麥生物與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇揚(yáng)州 225007)

小麥赤霉病主要是由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)引起的一種嚴(yán)重的小麥穗部病害,除造成產(chǎn)量降低外,在病原菌侵染過程中也會(huì)產(chǎn)生多種真菌毒素,嚴(yán)重危害人畜健康。小麥赤霉病抗性是由多基因控制的數(shù)量性狀[1],抗性機(jī)制較為復(fù)雜,至今尚未發(fā)現(xiàn)高抗赤霉病的品種。因此,挖掘抗赤霉病基因?qū)τ谂嘤剐云贩N具有重要意義。

木瓜類半胱氨酸蛋白酶(PLCPs)廣泛存在于多種植物中,參與種子萌發(fā)[2]、花藥發(fā)育[3]、衰老[4-5]以及逆境脅迫響應(yīng)[6-9]等多種生理過程,且在植物細(xì)胞程序性死亡(PCD)過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[10-11]。研究表明,PLCPs作為植物抗病反應(yīng)的關(guān)鍵酶,其缺失或突變會(huì)導(dǎo)致植物免疫系統(tǒng)受損,減弱寄主的抗病性[8]。如在煙草中沉默PLCPs家族基因NbCathB,能夠抑制ROS的積累和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力誘導(dǎo)的過敏性-程序性細(xì)胞死亡(HR-PCD)[11];擬南芥PLCPs家族基因xcp2突變會(huì)導(dǎo)致其更易受到茄科青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)的侵染[12]。擬南芥PLCPs家族重要成員RD21被認(rèn)為是細(xì)胞死亡的前體信號(hào)[13],敲除或者沉默RD21會(huì)導(dǎo)致擬南芥更易受到灰霉[14]、卵菌[15]和細(xì)菌[16]的侵染;同時(shí)擬南芥中RD21還負(fù)調(diào)控霉菌毒素FB1(伏馬菌素B1)誘導(dǎo)的PCD[17]。

本課題組前期通過RNA-seq數(shù)據(jù)分析,從抗赤霉病小麥品種(揚(yáng)麥17)和感赤霉病小麥品種(揚(yáng)麥15)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中篩選到一個(gè)差異表達(dá)基因(Traes_2DL_02G546600)。本研究基于該基因序列設(shè)計(jì)引物,從小麥中克隆獲得三個(gè)TaRD21基因(TaRD21-2A/2B/2D),然后對(duì)這三個(gè)基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并分析水楊酸(SA)、乙烯利(ETH)及赤霉病菌誘導(dǎo)下這三個(gè)基因的表達(dá)特性,以期為進(jìn)一步解析RD21基因在小麥中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥材料的感赤霉病品種揚(yáng)麥15和抗赤霉病品種揚(yáng)麥17,均由本實(shí)驗(yàn)室保存。所用赤霉病菌為強(qiáng)致病力菌株f0609,由江蘇省農(nóng)科院植保所陳懷谷研究員提供。

1.2 誘導(dǎo)處理及cDNA合成

將揚(yáng)麥15和揚(yáng)麥17分別種植于溫室花盆中,待出苗后在4 ℃人工氣候室中春化3周,然后轉(zhuǎn)移至溫室中,每天光照16 h,平均溫度28 ℃(晝)/16 ℃ (夜)。將預(yù)培養(yǎng)2～3 d的赤霉病菌接種于綠豆湯培養(yǎng)基中,25 ℃振蕩培養(yǎng)4～5 d,使其產(chǎn)生孢子。用4層無菌紗布過濾菌絲,收集孢子,然后用無菌水將孢子液濃度調(diào)至5×105～10×105個(gè)·mL-1。于開花期采用單花滴注接種法進(jìn)行接種,每小花接種孢子懸浮液10 μL,以無菌水處理為對(duì)照,并作標(biāo)記。接種后用透明塑料袋套袋保濕,在接種0、24、48和72 h后采集穎殼,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別取10穗。

待揚(yáng)麥17和揚(yáng)麥15生長(zhǎng)2周左右,用2 mmol·L-1水楊酸(SA)和200 μmol·L-1乙烯利(ETH)噴施小麥葉片。分別在噴施0、2、4、6、12和24 h后取樣,以噴施蒸餾水為對(duì)照。

以上所有處理的小麥樣品采集后迅速置于液氮中處理,-80℃冰箱保存。用Eastep○RSuper Total RNA Extraction Kit試劑盒(Promega,美國(guó))分別提取上述樣品的總RNA,用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒(Promega,美國(guó))合成 cDNA。所有處理均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 TaRD21基因的克隆

前期利用RNA-seq數(shù)據(jù)分析了抗赤霉病小麥品種揚(yáng)麥17和感赤霉病小麥品種揚(yáng)麥15接種赤霉病菌后基因表達(dá)譜之間的差異,獲得1個(gè)注釋為RD21 Cysteine proteases的EST(Traes_2DL_02G546600),以此序列檢索小麥最新基因組數(shù)據(jù)庫WheatOmics 1.0(http://202.194.139.32),獲得基因CDS序列。根據(jù)CDS序列設(shè)計(jì)引物TaRD21-F/R(表1),以接菌72 h后的揚(yáng)麥17穎殼cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為20 μL,包括2×Phanta Max Master Mix 10 μL(諾唯贊,南京),模板cDNA 2 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL,ddH2O 7.0 μL。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,68 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離,然后進(jìn)行目的條帶回收和測(cè)序。

表1 本研究所用的引物

采用CTAB法提取揚(yáng)麥17的基因組DNA(gDNA),以此為模板,擴(kuò)增TaRD21基因的全長(zhǎng)片段。所用引物以及PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序同上。

1.4 TaRD21基因的染色體定位

根據(jù)三個(gè)TaRD21基因的gDNA序列,在序列差異較大的內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物clTaRD21-F/R(表1),利用整套小麥缺體-四體對(duì)TaRD21基因進(jìn)行染色體定位分析。

1.5 序列分析和同源性比對(duì)

用NCBI在線分析工具ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)基因的開放閱讀框;用SMART在線軟件(http://smart.embl-heidelberg.de)對(duì)編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析;用ProtParam在線軟件 (http://expasy.org/tools/protparam.htm1)分析編碼蛋白的理化性質(zhì);用SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_sopma.html)對(duì)編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè);用TMHMM軟件(https://cbs.dtu.dk/service.php/TMHMM-2.0)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析;用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì),用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 TaRD21基因的表達(dá)模式分析

根據(jù)TaRD21基因序列,設(shè)計(jì)特異的qRT-PCR引物qTaRD21-2A/2B/2D-F/R(表1),以SA和ETH處理的幼苗cDNA以及接種赤霉病菌的穎殼cDNA為模板,以無菌水處理為對(duì)照,利用BioRad CFX96TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)目的基因的表達(dá)模式。內(nèi)參基因?yàn)棣?Actin。按照SYBR Primix ExTaq試劑盒(TaKaRa,北京)說明書配制PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s,40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù), 每次處理有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用DPS7.05軟件進(jìn)行差異顯著性分析(LSD法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaRD21基因的克隆和蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

以TaRD21-F/R為引物,以接菌72 h后的小麥(揚(yáng)麥17)穎殼cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得一個(gè)大約1 400 bp的片段(圖1)。測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),共獲得三個(gè)長(zhǎng)度分別為1 419、1 410和1 428 bp的cDNA片段,分別編碼472、469和475個(gè)氨基酸。同時(shí)以TaRD21-F/R為引物,以揚(yáng)麥17的gDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得一個(gè)大約3 500 bp的片段(圖1),經(jīng)回收與測(cè)序,發(fā)現(xiàn)其包含三個(gè)不同長(zhǎng)度的TaRD21基因序列。

M: Trans2K DNA marker.

2.2 TaRD21基因的染色體定位

以clTaRD21-F/R為引物,以中國(guó)春第二同源群缺體-四體的gDNA為模板,進(jìn)行基因染色體定位分析。結(jié)果顯示,以N2A/T2B、N2A/T2D的gDNA為模板時(shí),擴(kuò)增結(jié)果缺少229 bp的片段;以N2B/T2A的gDNA為模板時(shí),擴(kuò)增結(jié)果缺少264 bp的片段;以N2D/T2A的gDNA為模板時(shí),擴(kuò)增結(jié)果缺少351 bp的片段。因此,將三個(gè)TaRD21基因定位在小麥第2同源群染色體上(圖2),并分別命名為TaRD21-2A、TaRD21-2B和TaRD21-2D。定位結(jié)果與小麥基因組數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)分析結(jié)果一致。

1:中國(guó)春;2:揚(yáng)麥15;3:揚(yáng)麥17;4:N2A/T2B;5:N2B/T2A;6:N2A/T2D;7:N2D/T2A。

2.3 TaRD21基因的生物信息學(xué)及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

用NCBI在線工具ORF Finder分析發(fā)現(xiàn),三個(gè)TaRD21基因均含有 5 個(gè)外顯子和4 個(gè)內(nèi)含子(圖3A)。用SMART軟件分析發(fā)現(xiàn),三個(gè)TaRD21蛋白均含有N端信號(hào)肽(signal peptide)、自抑制結(jié)構(gòu)域(auto-inhibitory domain)、蛋白酶結(jié)構(gòu)域(protease domain)和C端顆粒蛋白結(jié)構(gòu)域(granulin domain),其中C端顆粒蛋白結(jié)構(gòu)域大約包含60個(gè)氨基酸,含有14個(gè)保守的Cys結(jié)構(gòu)(Cx5Cx5CCCx7Cx4CCx6CCx5CCx6Cx6C)(圖3B和圖4),屬于典型的PLCPsRD21亞族。用ProtParam軟件分析發(fā)現(xiàn),三個(gè)TaRD21蛋白分子量在50.4～50.9 kD之間,等電點(diǎn)在5.41～5.71之間,表面帶負(fù)電荷的氨基酸均有57個(gè),表面帶正電荷的氨基酸有47～49個(gè),為脂溶性的疏水蛋白,均含有跨膜結(jié)構(gòu),其二級(jí)結(jié)構(gòu)均包含α螺旋、延伸鏈、β折疊和無規(guī)則卷曲在TaRD21-2A蛋白中占比為26.48%、4.87%、52.54%和16.10%;在TaRD21-2B蛋白中占比為23.88%、4.48%、53.73%和17.91%;在TaRD21-2D蛋白中占比為24.63%、5.26%、53.68%和16.42%。

A:TaRD21基因結(jié)構(gòu)示意圖;B:TaRD21蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。

下劃線分別代表TaRD21蛋白的4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域;綠色線為信號(hào)肽;粉色線為自抑制結(jié)構(gòu)域;藍(lán)色線為蛋白酶結(jié)構(gòu)域;紅色線為顆粒蛋白結(jié)構(gòu)域;黑色點(diǎn)為保守Cys。

2.4 TaRD21基因的同源性比對(duì)及進(jìn)化分析

利用DNAMAN軟件對(duì)三個(gè)TaRD21基因及TaRD21蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)三個(gè)基因的DNA序列相似性為89.3%;三個(gè)TaRD21蛋白的氨基酸序列相似性為95.6%,差異較大的區(qū)域?yàn)樾盘?hào)肽結(jié)構(gòu)域,而其他3個(gè)結(jié)構(gòu)域序列保守性較高(圖4)。為進(jìn)一步研究TaRD21基因在不同物種中的進(jìn)化情況,利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建小麥TaRD21蛋白與水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、大麥(Hordeumvulgare)、烏拉爾圖小麥(Triticumurartu)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)和菠蘿(Ananascomosus) RD21蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)小麥TaRD21蛋白與雙子葉植物擬南芥、菠蘿的RD21蛋白同源性較低,但與單子葉植物水稻、玉米、大麥和烏拉爾圖小麥的RD21蛋白同源性較高;TaRD21-2A蛋白與小麥A基因組起源物種烏拉爾圖小麥TuRD21A蛋白的同源性高于TaRD21-2B和TaRD21-2D蛋白(圖5)。

括號(hào)中為RD21蛋白的 GenBank 登錄號(hào),進(jìn)化樹分支上的數(shù)字為Bootstrap值。

2.5 TaRD21基因的表達(dá)模式分析

2.5.1TaRD21基因在不同激素脅迫下的表達(dá)模式

從圖6可以看出,抗赤霉病小麥品種揚(yáng)麥17和感赤霉病小麥品種揚(yáng)麥15中,三個(gè)TaRD21基因均受SA和ETH誘導(dǎo)表達(dá),且具有明顯差異。揚(yáng)麥17中TaRD21-2B和TaRD21-2D的表達(dá)量總體高于揚(yáng)麥15;而揚(yáng)表15中TaRD21-2A基因的表達(dá)量總體上高于揚(yáng)表17中該基因的表達(dá)量。在揚(yáng)表17中,TaRD21-2B和TaRD21-2D基因?qū)TH的響應(yīng)更為迅速,分別在誘導(dǎo)4和2 h后達(dá)到峰值;在揚(yáng)麥15中,TaRD21-2A基因?qū)A的響應(yīng)更為迅速,在誘導(dǎo)4 h后表達(dá)量達(dá)到峰值。表明TaRD21基因的表達(dá)受SA和ETH調(diào)控,但在抗、感赤霉病小麥品種中表現(xiàn)不同。

圖柱上不同字母表示在0.05水平差異顯著。下同。

2.5.2TaRD21基因在赤霉病菌誘導(dǎo)下的表達(dá)模式

從圖7可以看出,接種赤霉病菌后,揚(yáng)麥17和揚(yáng)麥15中三個(gè)TaRD21基因均上調(diào)表達(dá),其中揚(yáng)麥17中TaRD21-2B和TaRD21-2D基因?qū)Τ嗝共【憫?yīng)迅速,均在接種12 h后表達(dá)量達(dá)到峰值,顯著高于揚(yáng)麥15中這兩個(gè)基因的表達(dá)量;而TaRD21-2A基因的表達(dá)量在接種48 h后才達(dá)到峰值,對(duì)赤霉病菌的響應(yīng)表現(xiàn)比較遲緩。在揚(yáng)麥15中,TaRD21-2A基因的表達(dá)量在接種后逐漸升高,并在接種24 h后達(dá)到峰值,此后表達(dá)量雖然有所下降,但仍維持較高水平,并顯著高于對(duì)照(接種0 h)處理;TaRD21-2B和TaRD21-2D基因的表達(dá)量在接種12 h后無顯著變化,在接種24～72 h后均顯著高于對(duì)照(接種0 h)處理。

圖7 赤霉病菌誘導(dǎo)下TaRD21基因在不同抗性小麥品種中的表達(dá)模式

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn),3個(gè)TaRD21基因都存在信號(hào)肽、自抑制區(qū)、蛋白酶和顆粒蛋白結(jié)構(gòu)域,具有典型的PLCPs家族特征。通過進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),3個(gè)TaRD21基因與禾本科植物RD21基因聚在一個(gè)大分支上,且與烏拉爾圖小麥、大麥RD21基因親緣關(guān)系最為接近,說明禾本科植物的RD21基因進(jìn)化相對(duì)保守。TaRD21-2A與小麥A基因組祖先物種烏拉爾圖小麥的RD21基因序列同源性更高,進(jìn)一步表明RD21基因在小麥進(jìn)化過程中非常保守。

植物內(nèi)源蛋白酶PLCPs在植物免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,編碼PLCPs的基因缺失會(huì)削弱植物的免疫反應(yīng)[8]。如:擬南芥缺失突變體rd21在接種灰霉菌(Botrytiscinerea)后更易感病[14];擬南芥缺失突變體rd19在接種茄科青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)后抗病性喪失[18];煙草中RD21同源基因C14沉默后,煙草對(duì)致病疫霉(Phytophtthorainfestans)的抗病性減弱[16]。另外,PLCPs也是依賴水楊酸(SA)的防御信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)控因子。Ziemann等[19]研究表明,PLCPs是SA調(diào)控植物免疫信號(hào)通路中的一個(gè)重要組分,發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。一般認(rèn)為,SA介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得抗性(SAR)反應(yīng)主要對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌起作用,而JA、乙烯(ET)介導(dǎo)的抗病信號(hào)途徑對(duì)抵抗死體營(yíng)養(yǎng)型真菌的侵染起重要作用[20]。引發(fā)小麥赤霉病的禾谷鐮刀菌是一種半活體營(yíng)養(yǎng)型真菌,因而小麥赤霉病抗病機(jī)制較為復(fù)雜。本研究通過qRT-PCR技術(shù)分析了SA、ETH處理及接種赤霉病菌條件下3個(gè)小麥TaRD21基因的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)SA和ETH均能顯著誘導(dǎo)TaRD21基因上調(diào)表達(dá),但在抗、感赤霉病小麥品種中,3個(gè)基因的表達(dá)模式有差異。在抗病品種中,TaRD21-2B和TaRD21-2D基因?qū)TH的響應(yīng)更迅速,同時(shí)也受赤霉病菌誘導(dǎo)表達(dá),推測(cè)這兩個(gè)基因可能參與ETH介導(dǎo)的赤霉病抗性反應(yīng);而在感病品種中,TaRD21-2A基因?qū)A及赤霉病菌的響應(yīng)更為快速,推測(cè)TaRD21-2A可能與感病性相關(guān),即在小麥與赤霉病菌互作中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。已有研究表明,RD21基因與細(xì)胞死亡的前體信號(hào)相關(guān),而引發(fā)細(xì)胞死亡是促進(jìn)死體營(yíng)養(yǎng)型真菌迅速侵染的重要途徑。擬南芥通過RD21負(fù)調(diào)控霉菌毒素FB1,提高了擬南芥對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)型串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)的抗性[13],表明RD21是擬南芥死體營(yíng)養(yǎng)型串珠鐮刀菌的隱性感病基因。TaRD21-2A基因在小麥與赤霉病菌互作中是否行使類似的功能,有待通過基因編輯敲除該基因,深入研究該基因的功能。