兒童Alport綜合征COL4A5基因型及臨床特點(diǎn)分析

黃唯 劉翠華 李紀(jì)同,2 劉玉潔 李玉柳 田明 曹廣海 張書鋒

（1.鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院腎臟風(fēng)濕科，河南鄭州 450018；2.河南省兒童遺傳代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450018）

Alport 綜合征（Alport syndrome，AS）是繼多囊性腎病后導(dǎo)致遺傳性進(jìn)行性腎功能衰竭最常見(jiàn)的原因之一［1］。AS 主要表現(xiàn)為持續(xù)性血尿和進(jìn)行性腎功能衰竭等，腎外特征主要包括感音神經(jīng)性耳聾及眼部病變等。AS 是由編碼腎小球基底膜Ⅳ型膠原α3、α4、α5 鏈的COL4A3、COL4A4和COL4A5基因突變引起的，導(dǎo)致腎小球基底膜結(jié)構(gòu)破壞［2］。在遺傳方式上，AS 包括X-連鎖Alport 綜合征（X-link Alport syndrome，XLAS）、常染色體隱性Alport 綜合征（autosomal recessive Alport syndrome，ARAS）和常染色體顯性Alport 綜合征（autosomal dominant Alport syndrome，ADAS）3 種。AS 患兒中，XLAS 約占85%，通常由COL4A5基因突變引起；而ARAS 和ADAS 分別約占14%和1%，是由COL4A3或COL4A4基因的純合突變或復(fù)合雜合突變引起。據(jù)報(bào)道，AS的患病率約為1/5 000［3］，兒童AS約有13%［4］。AS早期很難發(fā)現(xiàn)，腎活檢或者基因檢測(cè)是必要的。盡管有關(guān)AS 致病基因的基因型與臨床表型的研究已取得一定進(jìn)展，但隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，新的基因型不斷被發(fā)現(xiàn)，其基因型與表型的關(guān)系有待進(jìn)一步完善。本研究擬通過(guò)回顧性分析我中心近5年收治的19例XLAS患兒基因檢測(cè)結(jié)果及臨床資料，探討COL4A5基因型與臨床表型的特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2017年4月—2022年3月就診于鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院腎臟風(fēng)濕科、符合AS 診斷標(biāo)準(zhǔn)且資料完整的19 例患兒為研究對(duì)象。根據(jù)2018 年《Alport綜合征診斷和治療專家推薦意見(jiàn)》［5］，符合以下條件中（1）+（2）/（3）/（4）即可診斷：（1）主要表現(xiàn)為持續(xù)性的腎小球源性血尿或血尿伴有蛋白尿；（2）腎活檢組織學(xué)檢查中電鏡下可見(jiàn)腎小球基底膜彌漫性增厚或厚薄不一、致密層撕裂分層、籃網(wǎng)狀改變；（3）Ⅳ型膠原α鏈免疫熒光檢查提示α3、α4、α5鏈免疫熒光染色異?；蚱つw基底Ⅳ型膠原α5 鏈免疫熒光染色異常；（4）基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)COL4A5基因具有一個(gè)致病性突變。

1.2 資料收集

通過(guò)醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集患兒性別、起病年齡、臨床表現(xiàn)、家族史、尿常規(guī)、腎功能、聽(tīng)力、眼部檢查結(jié)果等臨床資料，收集患兒腎臟組織光鏡、免疫熒光和電鏡結(jié)果。

1.3 基因檢測(cè)

采集患兒及其家系成員的外周血標(biāo)本每人2 mL（乙二胺四乙酸抗凝血）送至第三方公司（智因東方北京全譜醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室、北京邁基諾基因科技股份有限公司），采用IDT 的xGen Exome Research Panel v2.0 進(jìn)行全外顯子組捕獲測(cè)序?；蛲蛔兎治鲆罁?jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）制定的測(cè)序變異解讀指南進(jìn)行致病性等級(jí)分類［6］。對(duì)候選致病基因進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)后，經(jīng)ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。

所有研究對(duì)象的監(jiān)護(hù)人均對(duì)本研究知情同意，并簽署書面知情同意書。本研究獲鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2023-K-042）。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

19例AS患兒中，男性12例（63%），女性7例（37%），男女比例為1.7∶1。起病年齡范圍1 歲1個(gè)月至11 歲8 個(gè)月，中位年齡為3.7 歲，≤3 歲者6例（32%），＞3 歲且＜6 歲者6 例（32%），≥6 歲者7例（37%）。19 例（100%）均以血尿?yàn)槭装l(fā)表現(xiàn)，11 例（58%）合并蛋白尿，2 例（11%）有聽(tīng)力損傷。19 例患兒中，17 例（89%） 家族史陽(yáng)性。見(jiàn)表1。

表1 19例AS患兒的臨床表現(xiàn)

2.2 AS患兒基因診斷及遺傳學(xué)特點(diǎn)

19 例AS 患兒分別來(lái)自19 個(gè)家系。單純COL4A5基因突變15 例（79%），其中錯(cuò)義突變7種，大片段缺失突變3種，剪接突變2種，截?cái)嗤蛔? 種，移碼突變1 種，同義突變1 種，其中有10個(gè)新突變位點(diǎn)；COL4A5合并COL4A3或COL4A4基因突變4 例（例16、17、18、19）。通過(guò)Sanger測(cè)序家系驗(yàn)證，12種基因突變來(lái)自母親，6種基因突變來(lái)自父親，1 例為自發(fā)突變，4 例突變來(lái)源不詳。見(jiàn)表2。

表2 19例AS患兒的基因突變位點(diǎn)及致病性分析

2.3 腎臟病理結(jié)果

11 例患兒完成腎活檢。光鏡結(jié)果提示11 例（100%）均為腎小球輕微病變。電鏡結(jié)果顯示，6例（55%）可見(jiàn)基底膜致密層撕裂、分層改變；1例（9%） 為局部可疑撕裂、分層改變；4 例（36%）未見(jiàn)致密層撕裂、分層改變。11 例行腎活檢患兒中，10例行Ⅳ型膠原免疫熒光檢測(cè)，其中4例（40%）α3、α5均表達(dá)缺失；2例（20%）α3表達(dá)正常，α5 節(jié)段性陽(yáng)性；2 例（20%）α3、α5 節(jié)段性陽(yáng)性；1 例（10%）α3 表達(dá)正常，α5 表達(dá)缺失； 1 例（10%） α3、 α5 表達(dá)正常。 見(jiàn)表1、圖1。

圖1 部分患兒典型的腎臟病理圖 A～C圖為光鏡下結(jié)果，A、B圖均為過(guò)碘酸雪夫染色，圖中可見(jiàn)腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)輕微增生，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性；C 圖為蘇木精-伊紅染色，圖片未見(jiàn)異常。D～F 圖為Ⅳ型膠原免疫熒光染色，D、F圖可見(jiàn)α5鏈表達(dá)缺失；E圖可見(jiàn)α5鏈有腎小球基底膜及包曼氏囊節(jié)段性陽(yáng)性、腎小管基底膜表達(dá)缺失。G～I(xiàn)圖為電鏡下結(jié)果，G圖可見(jiàn)基底膜厚薄不一，厚度100～170 nm，基底膜致密物節(jié)段性撕裂、分層改變；H圖可見(jiàn)基底膜節(jié)段性變?。籌圖可見(jiàn)基底膜致密層撕裂、分層改變，空泡變性。上述圖片放大倍數(shù)均為400×。

2.4 COL4A5基因型與表型關(guān)聯(lián)性

3 例患兒存在COL4A5基因大片段缺失（例7，loss51-53；例9，loss2-37；例14，loss3-53），其中例7、例9起病即存在肉眼血尿和蛋白尿，例14起病僅有鏡下血尿，其父親及叔叔均為慢性腎臟病5期并伴有聽(tīng)力減退，基因檢測(cè)提示其父親與叔叔在COL4A5基因突變位點(diǎn)處存在與患兒相同的缺失。1 例（例15）表現(xiàn)為AS 合并IgA 血管炎腎炎，其臨床表現(xiàn)僅有鏡下血尿，結(jié)合腎臟病理及基因檢測(cè)結(jié)果明確診斷為COL4A5基因突變的AS。

2.5 隨訪

19例患兒中，12例失訪，7例不定期于我院復(fù)診。截至2023 年4 月14 日，中位隨訪時(shí)間26（范圍：16～69）個(gè)月，7 例患兒腎功能均正常，病情未進(jìn)展。

3 討論

AS 是一種預(yù)后較差的遺傳性腎臟疾病，由于病情進(jìn)展速度較快，早期診斷十分重要。據(jù)報(bào)道，皮膚基底膜Ⅳ型膠原α5 鏈免疫熒光染色、腎活檢電鏡檢查及基因檢測(cè)對(duì)AS的檢出率分別為77.8%、92.6%和96.6%［8］。因此，腎活檢及基因檢測(cè)對(duì)診斷該病是必要的。

本研究有11 例患兒行腎活檢，10 例患兒行Ⅳ型膠原免疫熒光染色，結(jié)果顯示Ⅳ型膠原染色診斷率為90%（9/10），電鏡下診斷率為55%（6/11），Ⅳ型膠原免疫熒光檢測(cè)診斷率較高，電鏡診斷率較低，可能與樣本量較少有關(guān)。研究證明基因檢測(cè)對(duì)診斷AS 至關(guān)重要［9］。本研究有1 例患兒（例13），家族史陽(yáng)性，臨床表現(xiàn)無(wú)特異性，腎活檢無(wú)AS 典型改變，但基因檢測(cè)結(jié)果提示為COL4A5基因突變的AS。另有1例患兒（例15），以反復(fù)出血性皮疹入院，臨床診斷IgA血管炎腎炎，因患兒合并孤立性血尿，行腎活檢提示未見(jiàn)典型基底膜致密層撕裂、分層改變，Ⅳ型膠原染色顯示α5 鏈表達(dá)缺失。追問(wèn)病史有血尿家族史，基因檢測(cè)出COL4A5基因突變c.3372A＞G(p.P1124=)，該變異為同義突變。以上結(jié)果提示基因檢測(cè)是十分必要的。

隨著基因檢測(cè)的普及，多基因遺傳模式開(kāi)始被發(fā)現(xiàn)，Mencarelli等［10］最先提出了雙基因遺傳的可能性。研究表明，COL4A5合并COL4A3或COL4A4的雙基因突變患兒臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度介于ARAS 與ADAS 之間。Choi 等［11］研究也提出，AS 可能由雙基因控制，但該研究并未證實(shí)臨床表型加重是兩種基因共同作用的結(jié)果或是兩種基因中的一種突變所致。Zhang 等［12］報(bào)道稱，COL4A5合并COL4A3或COL4A4基因突變的男性XLAS 患兒會(huì)有更嚴(yán)重的蛋白尿。胡寧寧等［13］研究發(fā)現(xiàn)COL4A5合并COL4A3或COL4A4雙基因突變女性XLAS患者發(fā)病年齡較早，且合并有不同程度的蛋白尿。此外，Savige 等［14］研究表明具有致病性COL4A3或COL4A4基因突變可能表現(xiàn)出比單個(gè)突變更嚴(yán)重的臨床表型。本研究中，4例患兒存在雙基因突變，其中3例為COL4A5合并COL4A4基因，1例為COL4A5合并COL4A3基因。研究發(fā)現(xiàn)，4例患兒中，2 例表現(xiàn)為肉眼血尿合并蛋白尿，1 例肉眼血尿及1例鏡下血尿。該4例患兒是由雙基因突變所致的AS，但由于觀察例數(shù)偏少，且未進(jìn)行生物學(xué)功能驗(yàn)證，還需進(jìn)一步研究。

有關(guān)男性XLAS患者基因型與表型相關(guān)性研究中，具有大片段缺失的突變比錯(cuò)義突變臨床表現(xiàn)更為嚴(yán)重［15-17］。本研究中，3例患兒存在大片段缺失，其中2 例男性患兒均有肉眼血尿合并蛋白尿，臨床表型較重。另1例（例14）為女性患兒，其父親與叔叔均被診斷為慢性腎臟病5期，并伴聽(tīng)力減退，而該患兒目前僅表現(xiàn)出鏡下血尿，可能是該患兒年齡較小，疾病進(jìn)展未達(dá)到肉眼血尿水平，需要進(jìn)一步隨訪。

Plant 等［18］曾報(bào)道1 例年輕女性雜合子，4 歲時(shí)即有血尿表現(xiàn)，腎活檢支持AS 診斷，其父親DNA 的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析顯示，擁有大致等量的正常和突變等位基因，但當(dāng)時(shí)父親表型正常，43 歲時(shí)才有腎功能衰竭表現(xiàn)。該研究指出不排除XY/XXY的體細(xì)胞嵌合體可能，且由于嵌合體的出現(xiàn)，導(dǎo)致其表型更類似于雜合子女性患者的表型，使得父親表型更輕微。本研究中的例3，臨床表現(xiàn)為鏡下血尿，基因突變來(lái)自母親，但其母親無(wú)臨床表現(xiàn)。我們推測(cè)，（1）X 染色體失活：Navarro-Cobos 等［19］研究表明，XX 雌性和XY 雄性之間的等效X 連鎖基因表達(dá)通常通過(guò)X 染色體失活來(lái)實(shí)現(xiàn)，但X 染色體的失活并不是100%，大約有15%的X連鎖基因在一定程度上出現(xiàn)基因逃逸，且這些逃逸的失活基因仍可有不同程度的表達(dá)。我們推測(cè)，該患兒母親體內(nèi)出現(xiàn)致病基因的失活，當(dāng)致病基因傳遞給該患兒后，失活的基因出現(xiàn)不同程度的表達(dá)，從而表現(xiàn)出母親表型正常，女兒患病。（2）嵌合體：嵌合體是一種由至少兩個(gè)具有不同基因型的細(xì)胞群組成的個(gè)體。當(dāng)攜帶者中存在足夠比例表達(dá)正常基因的細(xì)胞時(shí)，則臨床表現(xiàn)正常；若表達(dá)異?；虻募?xì)胞比例多于正常細(xì)胞，則出現(xiàn)相應(yīng)的臨床表現(xiàn)［20］。因此，該患兒體內(nèi)由于表達(dá)異常細(xì)胞的比例高于正常細(xì)胞，從而出現(xiàn)臨床表型。

綜上所述，本研究拓寬了已知的COL4A5基因突變譜及臨床表型，對(duì)AS 的診斷和遺傳咨詢、預(yù)后有一定的指導(dǎo)意義。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。