宏基因組二代測序在兒童血液腫瘤合并感染中的應(yīng)用

鐘珊 楊明華

（中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院兒科/湖南省兒童腫瘤性疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，湖南長沙 410013）

近年來隨著分層化療、免疫治療、分子靶向治療、造血干細(xì)胞移植等技術(shù)的出現(xiàn)，兒童血液腫瘤疾病的生存率有了極大改善，但仍有部分患兒死于治療相關(guān)并發(fā)癥，其中半數(shù)以上與感染相關(guān)［1］。血液腫瘤患兒是感染性疾病的易感人群，易發(fā)生血液、肺部等多部位、多種病原體的混合感染［2］。微生物培養(yǎng)被認(rèn)為是病原體診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”［3］，但易受菌量、培養(yǎng)條件影響，陽性率低、耗時長，且不能檢測病毒類病原體。其他傳統(tǒng)檢測手段如抗原/抗體檢測和聚合酶鏈反應(yīng)檢測等，通常病原體檢測種類有限，不能滿足臨床需要。病原體診斷未明情況下經(jīng)驗性抗生素的應(yīng)用一定程度上助長了耐藥菌的產(chǎn)生［4］，由此帶來了住院時間延長、住院費用增加等一系列問題。

病原體的早期識別可指導(dǎo)臨床個性化用藥，及時有效的藥物調(diào)整對改善血液腫瘤合并感染患兒的預(yù)后有重要作用。近年來，一種新興的病原體檢測方法宏基因組二代測序（metagenomic nextgeneration sequencing，mNGS）逐漸發(fā)展起來，具有覆蓋面廣、通量高、檢測時間短、測序結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點，可以無偏移地檢測數(shù)十種臨床樣本中的所有潛在病原體，包括細(xì)菌、病毒和真菌［5］。mNGS的出現(xiàn)，彌補了傳統(tǒng)檢測手段的不足。2019年12 月一種不明原因的呼吸道疾病在我國武漢廣泛傳播，對公共衛(wèi)生健康構(gòu)成了重大威脅，通過mNGS 對感染患者的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）進行測序分析，最終明確病原體為新型冠狀病毒［6］。許苗苗等［7］報道了利用mNGS成功診斷1例艾滋病患者肺新生隱球菌合并卡氏肺孢菌感染的病例，體現(xiàn)了mNGS對臨床精準(zhǔn)治療的價值，展示出mNGS在診斷罕見、新類型病原體感染及混合感染方面的極大優(yōu)勢。mNGS在檢驗效能方面的巨大潛力，使其越來越廣泛的被應(yīng)用于血流感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、關(guān)節(jié)感染等器官系統(tǒng)的感染診斷中［8］。目前，有共識推薦mNGS應(yīng)用于免疫受損繼發(fā)感染者［9］，但針對此類兒童的相關(guān)研究不足。本研究通過比較分析mNGS與微生物培養(yǎng)結(jié)果，評估m(xù)NGS在血液腫瘤患兒感染性疾病病原體診斷中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2020年6月—2022年7月于中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院收治的因感染行微生物培養(yǎng)及mNGS的血液病或腫瘤患兒為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＜15歲；（2）骨髓穿刺、組織病理學(xué)檢查等實驗室檢查支持診斷的血液病或腫瘤性疾病，接受過藥物化療、免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素治療者；（3）具有發(fā)熱（體溫＞38℃）、畏寒、咳嗽、咳痰、嘔吐、抽搐、腹瀉等臨床表現(xiàn)，不能用非感染原因解釋的血常規(guī)、降鈣素原、C反應(yīng)蛋白等炎癥指標(biāo)明顯升高和/或影像學(xué)檢查證實存在感染者；（4）同時行微生物培養(yǎng)及mNGS 者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）最終臨床診斷為非感染性疾病者；（2）病歷資料不完整者；（3）標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果判定為污染者。本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：快I 22263），豁免知情同意。

1.2 臨床資料收集

收集43 例患兒的年齡、性別、基礎(chǔ)疾病、主要臨床癥狀、實驗室指標(biāo)（白細(xì)胞計數(shù)、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原）、是否入住重癥監(jiān)護室、是否出現(xiàn)膿毒癥休克、住院時長、總體療效等臨床資料。

1.3 病原學(xué)檢測

收集所有患兒的外周血、BALF、腦脊液、骨髓、膿拭子標(biāo)本，同時送微生物培養(yǎng)及mNGS。部分患兒送檢了以下傳統(tǒng)病原體檢測：病原體抗體血清學(xué)檢測（肺炎支原體、肺炎衣原體、結(jié)核桿菌），鼻拭子呼吸道病毒7 種抗原測定（腺病毒、流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒1 型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒），外周血或尿液EB病毒、巨細(xì)胞病毒、多瘤病毒聚合酶鏈反應(yīng)檢測，外周血或BALF的β-D-葡聚糖試驗（G試驗），半乳甘露聚糖抗原試驗（GM試驗）。mNGS 樣本處理后使用DNA 提取試劑盒（德國Qiagen 公司/中國Magen 公司） 提取DNA。用QIAseq Ultralow Input Library Kit （Illumina） 或NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit（Illumina）構(gòu)建DNA文庫。純化后，使用Qubit（Thermo Fisher）和Agilent 2100 生物分析儀評估文庫質(zhì)量，然后在Nextseq 550 平臺（Illumina，美國）上進行測序。從原始數(shù)據(jù)中刪除短或低質(zhì)量的讀數(shù)，通過人類參考數(shù)據(jù)庫濾去人源性序列，并與美國國家生物技術(shù)信息中心微生物基因組數(shù)據(jù)庫（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes）對比，獲取所有可能病原體的種類及相對豐度信息。根據(jù)患兒的臨床表現(xiàn)、其他傳統(tǒng)病原體檢測結(jié)果及藥物治療反應(yīng)，綜合判斷mNGS 報告的病原微生物是否與臨床癥狀相關(guān)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析。偏態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（Q1，Q3）］表示。計數(shù)資料采用例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法或McNemar's檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患兒的臨床資料

共納入符合標(biāo)準(zhǔn)的患兒43 例，其中男性25例，女性18例，中位年齡7.0（3.8，12.1）歲。粒細(xì)胞缺乏患兒占56%（24/43）。急性淋巴細(xì)胞白血病24例；急性髓系白血病10例；噬血細(xì)胞綜合征3 例；再生障礙性貧血2 例；其他腫瘤4 例，其中淋巴瘤1例，顱內(nèi)腫瘤3例。所有患兒送檢前均有抗生素用藥史，其中7 d以上用藥史者占47%（20/43）。主要臨床癥狀為發(fā)熱（91%）、呼吸道癥狀（54%）、消化道癥狀（19%）、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀（7%）。實驗室檢查：白細(xì)胞計數(shù)為1.55（0.18，5.12）×109/L，C反應(yīng)蛋白為71.30（6.38，103.91）mg/L，降鈣素原為0.25（0.12，1.06）ng/mL。

2.2 mNGS與微生物培養(yǎng)法病原體檢出情況

43例患兒共送檢mNGS標(biāo)本54份，其中外周血34份，BALF 13份，腦脊液5份，膿拭子1份，骨髓1 份。54 份送檢標(biāo)本中mNGS 共檢出40 種病原體。mNGS在外周血中最常檢出的細(xì)菌、真菌分別為銅綠假單胞菌、熱帶念珠菌；在BALF中最常檢出的細(xì)菌、真菌為肺炎鏈球菌、耶氏肺孢子菌。見表1。微生物培養(yǎng)法在外周血中共檢出9種細(xì)菌和2種真菌，共17株；最常見的細(xì)菌和真菌分別為銅綠假單胞菌和熱帶念珠菌。在BALF中微生物培養(yǎng)共檢出4種病原體，共4株，均為細(xì)菌。見表2。

表1 mNGS病原體檢出情況 ［n（%）］

表2 微生物培養(yǎng)法病原體檢出情況 ［n（%）］

2.3 mNGS 與微生物培養(yǎng)法在不同類型標(biāo)本的檢出率

mNGS在外周血、BALF及其他標(biāo)本（腦脊液、膿拭子、骨髓）的病原體陽性檢出率分別為74%（25/34）、92%（12/13）、86%（6/7），不同標(biāo)本的檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.574）。血培養(yǎng)、BALF 培養(yǎng)及其他標(biāo)本（腦脊液、膿拭子、骨髓）培養(yǎng)的病原體陽性率分別為38%（13/34）、23%（3/13）、0（0/7），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.428）。mNGS的病原體總檢出率（80%，43/54）高于微生物培養(yǎng)法（30%，16/54），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。相同類型標(biāo)本中，mNGS 的檢出率均明顯高于微生物培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表3。54份標(biāo)本中，mNGS與微生物培養(yǎng)法均陽性者14份，其中5份（36%，5/14）兩種檢測方法檢出的病原體一致，且mNGS檢出更多的病原體；另外9 份（64%，9/14）兩種方法檢出的病原體完全不一致。見表4。

表3 mNGS與微生物培養(yǎng)法在不同類型標(biāo)本的檢出率比較 ［n（%）］

表4 mNGS及微生物培養(yǎng)法均陽性患兒病原體匹配情況 （n=14）

2.4 mNGS與微生物培養(yǎng)法對混合感染的檢出率

mNGS 檢出2 種或2 種以上的病原體感染者占48%（26/54），微生物培養(yǎng)法占9%（5/54），兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=19.95，P＜0.001）；mNGS 及微生物培養(yǎng)法檢出2 類或2 類以上的病原體感染的比例分別為33%（18/54）和2%（1/54），兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=18.45，P＜0.001）。見表5。

表5 mNGS與微生物培養(yǎng)法對混合感染檢出率比較［n（%）］

2.5 mNGS與微生物培養(yǎng)法對不同致病菌的檢出率

mNGS真菌檢出率高于微生物培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=13.30，P＜0.001）。微生物培養(yǎng)法與mNGS 對細(xì)菌的檢出率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.407，P=0.523）。見表6。

2.6 mNGS 及微生物培養(yǎng)法檢測的病原體感染類型

54 份標(biāo)本中mNGS 陽性43 份，分別為外周血25 份、BALF 12 份、腦脊液4 份、膿拭子1 份、骨髓1份。其中18份（42%，18/43）檢出2類或2類以上的病原體感染。mNGS最常檢出的感染類型為病毒感染（33%，14/43），其次為真菌合并病毒感染（19%，8/43）。見圖1。微生物培養(yǎng)法陽性標(biāo)本16份，分別為血培養(yǎng)13份、BALF培養(yǎng)3份，最常見檢出的感染類型為細(xì)菌感染（81%，13/16），其次是真菌感染（12%，2/16）。

圖1 mNGS檢出的病原體感染類型（n=43）

2.7 mNGS檢測與臨床治療

43 例患兒中，mNGS 陽性35 例（81%），陰性8例（19%）。mNGS陽性患兒中，17例（49%，17/35）根據(jù)結(jié)果調(diào)整治療，其中15例好轉(zhuǎn)出院，1例因腫瘤進展家屬放棄治療，1例因感染合并多器官功能衰竭死亡；另18 例mNGS 陽性患兒因當(dāng)前使用的藥物抗菌譜覆蓋了檢出的陽性病原體，故未調(diào)整治療，其中15例好轉(zhuǎn)出院，3例因重癥感染死亡。8 例mNGS 陰性患兒均未調(diào)整治療，其中3 例為粒細(xì)胞缺乏患兒且感染癥狀持續(xù)，5例其他檢測檢出病原體或者影像學(xué)明顯異常，最終均好轉(zhuǎn)出院。

3 討論

血液腫瘤患兒尤其在化療后常有不同程度的免疫抑制，感染為其常見并發(fā)癥，也是其不良預(yù)后的重要因素，早期、快速、準(zhǔn)確地識別病原體及有效的藥物治療對其意義重大。傳統(tǒng)病原學(xué)檢測在很多情況下不能明確病原體，目前已有應(yīng)用mNGS協(xié)助感染性疾病病原體診斷優(yōu)于微生物培養(yǎng)法的多項研究［10-11］。本研究旨在分析比較mNGS與微生物培養(yǎng)法的病原學(xué)特征、檢出率，探討mNGS在血液腫瘤患兒合并感染時對病原體診斷的應(yīng)用價值。

血液腫瘤患兒發(fā)生血流感染不少見，尤其是對于合并嚴(yán)重粒細(xì)胞缺乏患兒，其死亡風(fēng)險明顯增加［12］。過去認(rèn)為革蘭陽性菌為腫瘤患者血流感染的主要致病菌，近年來致病菌譜逐漸發(fā)生改變，革蘭陰性菌在該類患者血流感染中扮演著重要角色［4］。本研究中，mNGS在外周血最常檢出的細(xì)菌為革蘭陰性菌，銅綠假單胞菌最多見，最常見的真菌為熱帶念珠菌，與血培養(yǎng)的常見病原體一致。從側(cè)面說明了mNGS作為一種補充手段，可與微生物培養(yǎng)法相互驗證。一項納入144例血液腫瘤患者的病原學(xué)研究結(jié)果顯示，所有致病菌中革蘭陰性菌占45.8%，革蘭陽性菌占39.6%，真菌占14.6%，銅綠假單胞菌是最常見的革蘭陰性菌，其次是大腸桿菌，最常檢出的真菌是念珠菌屬，以熱帶念珠菌最多見［13］，本研究結(jié)果與之一致。本研究mNGS 在BALF 中檢出最常見的細(xì)菌、真菌、病毒分別為肺炎鏈球菌、耶氏肺孢子菌、巨細(xì)胞病毒及人類皰疹病毒1 型。這與Wang 等［14］應(yīng)用mNGS檢測55 例惡性血液病患兒的肺部感染性病原體研究結(jié)果一致。然而，遺憾的是本研究的BALF中未培養(yǎng)出真菌病原體，可能與送檢BALF 的病例數(shù)過少有關(guān)。在這類感染患兒未獲得病原學(xué)證據(jù)前，不同部位的病原譜特點給我們經(jīng)驗性抗感染治療方案的選擇提供了一個方向。

Ren 等［15］對193 例膿毒癥患者的研究結(jié)果顯示，mNGS 檢出率為84.6%，微生物培養(yǎng)法檢出率為30.5%。本研究mNGS 總檢出率為80%，微生物培養(yǎng)為30%，與上述研究結(jié)果［15］基本一致。微生物培養(yǎng)法的低檢出率可能與本研究納入的患兒送檢前均有抗生素用藥史有關(guān)，而mNGS檢測受抗生素影響小［16］。但在送檢mNGS 的外周血、BALF 等標(biāo)本間檢出率沒有顯著差異，在微生物培養(yǎng)標(biāo)本間亦如此，這與Miao等［16］的研究結(jié)果一致。本研究mNGS 及微生物培養(yǎng)法均陽性的14 份標(biāo)本中，有9 份（64%，9/14）檢出的病原體完全不一致，高于既往一項回顧性研究報道［15］。這可能與單中心數(shù)據(jù)量不足有關(guān)，同時單獨應(yīng)用mNGS檢測或者僅使用微生物培養(yǎng)法都可能會遺漏掉部分病原體，兩者聯(lián)用則可能獲得更高的檢測效能，為臨床治療提供更多有益的信息。

既往報道血液腫瘤患兒免疫力低，15%左右的感染為混合感染［2］。本研究結(jié)果顯示mNGS 對2種或2種以上病原體感染的檢出率高于微生物培養(yǎng)法，mNGS 對2 類或2 類以上病原體感染的檢出率亦高于微生物培養(yǎng)法。這與既往研究結(jié)果一致［17］。本研究結(jié)果顯示mNGS對真菌的檢出率優(yōu)于微生物培養(yǎng)，這與Tao 等［18］的研究結(jié)果一致。侵襲性真菌病常見于危重癥患兒及免疫抑制患兒，病死率高，因預(yù)防性抗真菌藥物的使用，常規(guī)微生物培養(yǎng)多呈現(xiàn)假陰性結(jié)果。本研究有1例急性淋巴細(xì)胞白血病患兒在誘導(dǎo)化療第5天開始出現(xiàn)咳嗽，第11天出現(xiàn)反復(fù)高熱，BALF 培養(yǎng)結(jié)果為陰性，但mNGS檢出煙曲霉、耶氏肺孢子菌，結(jié)合患兒肺部影像學(xué)、GM 試驗結(jié)果，最終確診為侵襲性真菌病，在靜脈滴注卡泊芬凈的基礎(chǔ)上加用復(fù)方磺胺甲噁唑口服及兩性霉素B霧化，經(jīng)調(diào)整治療后患兒臨床癥狀漸好轉(zhuǎn)，復(fù)查影像學(xué)實變影改善，這得益于mNGS快速準(zhǔn)確的檢測結(jié)果為臨床診斷及治療提供了依據(jù)。然而mNGS在檢出細(xì)菌方面未表現(xiàn)出優(yōu)勢。

本研究中mNGS 檢出感染類型主要為病毒感染，其次是真菌合并病毒感染、細(xì)菌感染。本研究納入患兒半數(shù)以上為粒細(xì)胞缺乏患兒，目前國內(nèi)外均推薦對于嚴(yán)重粒細(xì)胞缺乏及預(yù)計粒細(xì)胞缺乏時間長者經(jīng)驗性使用氟喹諾酮類、唑類藥物治療［19-20］，故多數(shù)患兒在感染癥狀出現(xiàn)之前，就已啟動感染預(yù)防措施。

本研究mNGS 檢測陽性的患兒中只有17 例（49%）調(diào)整治療，最終僅15例患兒根據(jù)結(jié)果調(diào)整治療并獲益，這低于既往研究報道［10］，另外少數(shù)患兒檢測結(jié)果陰性，均未調(diào)整治療，但患兒最終均好轉(zhuǎn)。未檢出病原體情況下多數(shù)可排除感染，但需除外某些病原體含量少、核酸提取困難的病原體［5，9］，mNGS指導(dǎo)臨床需結(jié)合患兒的臨床癥狀、實驗室結(jié)果及影像學(xué)檢查等綜合考慮，才能作出最佳的臨床決策。

然而，本研究也存在局限性：首先，本研究為單中心回顧性研究，病例數(shù)有限，結(jié)果可能存在一定偏倚，未來期待更大樣本量的多中心研究；其次，目前業(yè)內(nèi)對mNGS 結(jié)果解釋尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，本研究對mNGS 的結(jié)果判讀上可能存在一定主觀性。

總的來說，mNGS對比微生物培養(yǎng)法在一些方面仍具有一定優(yōu)勢，如更高的檢出率，識別混合感染等，可作為微生物培養(yǎng)法的補充，協(xié)助臨床診斷，改善患兒預(yù)后，對于常規(guī)抗感染無效的血液腫瘤患兒及疑難病例建議盡早行mNGS檢測。