長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)通過(guò)上調(diào)CTRP9-AdipoR1-AMPKeNOS信號(hào)通路改善自發(fā)性高血壓大鼠心肌功能

張昆茹，杜 麗，胡 萌

目前，全球成人高血壓患者已增至約12.8 億（Greenhalgh et al.，2021）。高血壓狀態(tài)下動(dòng)脈血壓升高，心肌超負(fù)荷工作，心肌結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生變化，如不及時(shí)進(jìn)行干預(yù)，將會(huì)引起心律失常、心衰及心肌梗死等并發(fā)癥，甚至危及生命。高血壓性心臟病已成為當(dāng)今中國(guó)十大致死疾病之一（Zhang et al.， 2019）。探索改善高血壓狀態(tài)下的心肌功能和降低高血壓性心臟病的發(fā)病率及死亡率的有效方法是一項(xiàng)緊迫且艱巨的任務(wù)。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)與脂聯(lián)素（adiponectin，APN）高度同源的蛋白超家族C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白（C1q/TNF-related proteins，CTRPs）家族。其中，CTRP9 與APN 的同源性最高，在血清、脂肪和心肌組織中高表達(dá)。CTRP9 不僅可以調(diào)節(jié)代謝、改善胰島素敏感性，且對(duì)心臟和血管具有廣泛的保護(hù)作用（雷虹 等， 2015； Yang et al.，2016）。CTRP9 可通過(guò)改善內(nèi)皮依賴性舒張功能（楊瑞等， 2016）、抗氧化、抗血凝等作用保護(hù)血管內(nèi)皮；CTRP9 還可通過(guò)抗炎、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能及代謝紊亂等途徑減緩冠心?。╟oronary artery disease，CAD）的進(jìn)程（Zhang et al.，2020）。Fujita 等（2017）研究認(rèn)為，血漿中CTRP9 水平可以作為糖尿病腎臟血管損傷的生物學(xué)標(biāo)志（姚希 等，2020）。低水平血清CTRP9 不但與冠心病具有相關(guān)性（張正偉 等，2016），而且增加了心衰的發(fā)病率及死亡率（Gao et al.，2019）。

CTRP9 主要通過(guò)CTRP9-AdipoR1-AMPK 信號(hào)途徑發(fā)揮其心血管保護(hù)作用。CTRP9 激活該途徑可改善高脂飲食大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能（Zheng et al.， 2011），減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷（Sun et al.， 2017），CTRP9 誘導(dǎo)的低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺動(dòng)脈血管的舒張作用（楊瑞 等，2016）、CTRP9 減輕血管的炎癥反應(yīng)均與AMPK 活化有關(guān)（Jung et al.， 2016）。對(duì)心肌而言，CTRP9 可通過(guò)激活A(yù)MPK-eNOS 信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞的凋亡、保護(hù)缺血/再灌注心肌（Kambara et al.， 2012）。心肌CTRP9 的表達(dá)降低與糖尿病性缺血心肌損傷有關(guān)（Su et al.， 2013）。然而，在實(shí)驗(yàn)性壓力負(fù)荷增加的條件下，CTRP9 在心肌的表達(dá)增加與病理性的心肌肥大、心肌纖維化及心肌功能紊亂有關(guān)（Appari et al.， 2017）。而自發(fā)性高血壓狀態(tài)下，CTRP9 與心肌功能之間的關(guān)系尚不清楚。

體力活動(dòng)減少是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因子之一（姜迪 等， 2014），運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練不僅可以降低心血管疾病的危險(xiǎn)因子，還可改善心肌功能。內(nèi)源性心肌保護(hù)因子的分泌增加是運(yùn)動(dòng)發(fā)揮心肌保護(hù)作用的機(jī)制之一（Guo et al.，2020）。研究顯示，健康個(gè)體一次高強(qiáng)度的間歇運(yùn)動(dòng)就可以增加血清中CTRP9 的水平（Kon et al.， 2019）。高血壓狀態(tài)下，運(yùn)動(dòng)對(duì)血清及心肌CTRP9 的表達(dá)有何影響、其在運(yùn)動(dòng)改善高血壓心肌功能中的作用并不明確。據(jù)此，本研究旨在通過(guò)建立長(zhǎng)期游泳運(yùn)動(dòng)模型，明確CTRP9 在運(yùn)動(dòng)改善自發(fā)性高血壓大鼠心肌功能中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

18 只4 周齡雄性Wistar-Kyoto（WKY）大鼠和20 只自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rat， SHR）購(gòu)于北京維通利華有限公司。WKY 大鼠隨機(jī)分為WKY 安靜組（WKY 組，n=9）和WKY 運(yùn)動(dòng)組（WE 組，n=9），SHR大鼠隨機(jī)分為SHR 安靜組（SHR 組，n=9）和SHR 運(yùn)動(dòng)組（SE 組，n=11）。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行9 周的無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)。第1 周時(shí)，第1 天游泳15 min，以后每天遞增15 min，直至游泳時(shí)間遞增至60 min。隨后每周運(yùn)動(dòng)6 天，每天進(jìn)行1 次60 min的游泳運(yùn)動(dòng)，持續(xù)8 周。最后1 次運(yùn)動(dòng)結(jié)束后24 h 進(jìn)行檢測(cè)，心動(dòng)超聲檢測(cè)心功能的變化，透射電鏡觀察大鼠心肌細(xì) 胞 的 結(jié) 構(gòu)，Western blot 檢 測(cè) 心 肌CTRP9、AdipoR1、AMPK、eNOS 的蛋白表達(dá)水平的變化，Elisa 試劑盒檢測(cè)血清中CTRP9 和心肌NO 的濃度。

1.3 心動(dòng)超聲檢查

用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于板上，采用 ⅤINNO 6ⅤET 小動(dòng)物超聲儀進(jìn)行心臟超聲檢查。大鼠胸前脫毛后涂抹超聲耦合劑，超聲探頭置于胸骨左側(cè)，與胸骨中線成10°～30°，顯示胸骨左室長(zhǎng)軸切面。在左室短軸切面，于左心室乳頭肌短軸切面使用解剖M 型超聲，取樣線穿過(guò)前間隔和后側(cè)壁。由二維圖像引導(dǎo)，取M 型曲線記錄左心室運(yùn)動(dòng)曲線并進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量左心室射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）、左心室短軸縮短率（fractional shortening，F(xiàn)S）、左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular internal diastolic dimension，LⅤIDd）和左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular internal dimension systole，LⅤIDs），以期評(píng)價(jià)心肌功能。

1.4 透射電鏡切片制備

取心肌組織，立即放入4%戊二醛中，5 min 后修塊并進(jìn)行定向切割，將樣品剪切成1 mm×1 mm×2 mm 小塊，再放入4%戊二醛中固定1～2 h，后用1%鋨酸后固定0.5～1.0 h；樣品經(jīng)丙酮系列脫水后，環(huán)氧樹(shù)脂包埋；超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛進(jìn)行雙染色后，采用日立HT 7700 型透射電鏡觀察。

1.5 Western blotting檢測(cè)

取大鼠心肌組織提取蛋白，BCA 法測(cè)蛋白濃度，根據(jù)蛋白定量結(jié)果調(diào)整上樣量。蛋白經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到PⅤDF 膜上，滴加50 g/L 脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST 洗膜后依次加入1∶1 000 兔抗大鼠CTRP9（Abcam）、AdipoR1（Abcam）、AMPK（Abcam）、eNOS 抗體（Abcam）4 ℃孵育過(guò)夜。次日洗膜后，加入1∶1 000 的HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 室溫孵育1 h。免疫印跡化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，AZURE C300 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

1.6 ELISA檢測(cè)

腹主動(dòng)脈取血，離心提取血清組織，CTRP9 試劑盒（Abcam）檢測(cè)血清CTRP9 的濃度。嚴(yán)格按照CTRP9 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

取大鼠心肌組織提取蛋白，NO 試劑盒（Abcam）檢測(cè)心肌NO 的濃度。嚴(yán)格按照NO 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以M±SD表示，采用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間數(shù)據(jù)比較采用ANOⅤA方差分析，若總體差異顯著，再以post-hoc 事后檢驗(yàn)分析相應(yīng)2 組間顯著性差別。以P＜0.05 為具有顯著性差異，P＜0.01 為具有極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，與WKY 組相比，SHR 組大鼠心肌肌原纖維排列紊亂，肌小節(jié)結(jié)構(gòu)破壞，Z 線斷裂，部分區(qū)域的肌絲溶解消失，線粒體形態(tài)異常，排布無(wú)規(guī)律，細(xì)胞核不完整；與SHR 組相比，SE 組大鼠心肌肌節(jié)明暗帶比較清晰，線粒體多數(shù)排列有序、緊湊，細(xì)胞核較完整，細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)明顯改善（圖1）。本研究表明，SHR 組大鼠心肌纖維超微結(jié)構(gòu)受損，運(yùn)動(dòng)對(duì)其有改善作用。

圖1 各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)比較（2 000×）Figure 1. Comparison of Myocardial Ultrastructure of Rats in Each Group （2 000×）

2.2 運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌功能的影響

心臟超聲結(jié)果顯示（圖2），與WKY 組比較，WE 組大鼠的EF、FS 及LⅤIDd 均升高，且具有顯著性差異（91.51±1.22 vs 85.50±1.09，P＜0.05；62.36±1.40 vs 52.68±2.07，P＜0.05；5.02±0.19 vs 3.73±0.09，P＜0.01）；SHR 組大鼠LⅤIDs明顯增加（2.17±0.03 vs 1.77±0.09，P＜0.05），EF、FS 均明顯下 降（78.97±1.03 vs 85.50±1.09，P＜0.05；42.75±1.12 vs 52.68±2.07，P＜0.05），說(shuō)明自發(fā)性高血壓大鼠心肌功能下降。與SHR 組大鼠相比，SE 組大鼠的心肌功能有所改善，表現(xiàn)為EF、FS、LⅤIDd 均有明顯上升（87.53±0.95 vs 78.97±1.03，P＜0.01；51.24±1.23 vs 42.75±1.12，P＜0.01；4.80±0.06 vs 3.67±0.15，P＜0.01）。本研究結(jié)果表明，有氧運(yùn)動(dòng)可明顯改善WKY 和SHR 大鼠的心肌功能。

圖2 各組大鼠心動(dòng)超聲結(jié)果比較Figure 2. Comparison of Echocardiography of Rats in Each Group

2.3 運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血清CTRP9水平的影響

同WKY 組相比，WE 組大鼠血清CTRP9 蛋白表達(dá)水平明顯增高（3.14±0.08 vs 2.83±0.10，P＜0.05；圖3），SHR組大鼠CTRP9 表達(dá)水平明顯降低（2.56±0.06 vs 2.83±0.10，P＜0.05；圖3）。同SHR 組相比，SE 組大鼠血清中CTRP9 蛋白水平明顯增加，且有極顯著性差異（3.15±0.08 vs 2.56±0.06，P＜0.01；圖3）。本研究結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)可以增加自發(fā)性高血壓大鼠血清中CTRP9的水平。

圖3 各組大鼠血清CTRP9的水平比較Figure 3. Comparison of CTRP9 Concentration in Serum of Rats in Each Group

2.4 運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK及eNOS表達(dá)的影響

與WKY 組相比，WE 組大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK、eNOS 蛋白表達(dá)均升高，且有顯著性差異（1.26±0.03 vs 1.18±0.03，P＜0.05；0.89±0.04 vs 0.83±0.03，P＜0.05；0.96±0.02 vs 0.89±0.03，P＜0.05；1.21±0.02 vs 1.13±0.02，P＜0.01；圖4）；SHR 組大鼠心肌4 種蛋白表達(dá)均呈明顯下降趨勢(shì)，且有顯著差異（1.18±0.03 vs 1.06±0.04，P＜0.05；0.78±0.05 vs 0.83±0.03，P＜0.05；0.76±0.04 vs 0.89±0.03，P＜0.01；1.07±0.01 vs 1.13±0.02，P＜0.05；圖4）。與SHR 組相比，SE 組大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK、eNOS 蛋白表達(dá)均明顯增加，且有顯著性差異（1.12±0.03 vs 1.06±0.04，P＜0.05；0.90±0.06 vs 0.78±0.05，P＜0.01；0.92±0.02 vs 0.76±0.04，P＜0.01；1.16±0.03 vs 1.07±0.01，P＜0.05；圖4）。本研究結(jié)果表明，有氧運(yùn)動(dòng)可明顯增加自發(fā)性高血壓大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK、eNOS 的表達(dá)水平，上調(diào)心肌CTRP9-AdipoR1-AMPK-eNOS 信號(hào)系統(tǒng)。

圖4 各組大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK、eNOS蛋白表達(dá)比較Figure 4. Comparison of Protein Expression of CTRP9， AdipoR1， AMPK， and eNOS in Myocardium of Rats in Each Group

2.5 運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌NO濃度的影響

為了進(jìn)一步探討運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠CTRP9-AdipoR1-AMPK-eNOS 信號(hào)系統(tǒng)的影響，對(duì)該信號(hào)系統(tǒng)的下游底物NO 濃度進(jìn)行檢測(cè)（圖5）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與WKY 組相比，WE 組大鼠心肌NO 濃度明顯增高，且有極顯著性差異（35.18±0.82 vs 32.11±0.44，P＜0.01）；SHR組大鼠心肌NO 水平明顯降低，且有顯著性差異（30.09±0.55 vs 32.11±0.44，P＜0.05）。同SHR 組相比，SE 組大鼠心肌NO 濃度明顯增高，有極顯著性差異（34.24±0.98 vs 30.09±0.55，P＜0.01）。本研究結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)可以增加自發(fā)性高血壓大鼠心肌NO 的濃度，與運(yùn)動(dòng)對(duì)心肌CTRP9-AdipoR1-AMPK-eNOS 的表達(dá)影響一致，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)可以上調(diào)自發(fā)性高血壓大鼠心肌CTRP9-AdipoR1-AMPK-eNOS信號(hào)系統(tǒng)，促進(jìn)NO 釋放，從而發(fā)揮對(duì)心肌的保護(hù)作用。

圖5 各組大鼠心肌NO濃度比較Figure 5. Comparison of NO Concentration in Myocardium of Rats in Each Group

3 討論

CTRP9 是一個(gè)具有廣泛心血管保護(hù)作用的細(xì)胞因子，在心肌和血清中高表達(dá)。血清CTRP9 水平降低可作為糖尿病、冠心病、冠心病合并糖尿病等疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（楊和運(yùn) 等，2020）。原發(fā)性高血壓隨著分級(jí)的提升，血清CTRP9 水平隨之降低（郭靚 等，2019；李麗賢 等，2019）。血清CTRP9 濃度降低與心衰的發(fā)病率及死亡率增高有關(guān)（Gao et al.，2019）。2 型糖尿病患者、2 型糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化患者血清CTRP9 的水平均降低，而且動(dòng)脈的順應(yīng)性較差（Asada et al.， 2016； Jung et al.， 2014）。高脂飲食大鼠同樣存在血清CTRP9 水平降低的現(xiàn)象。去除CTRP9 基因的小鼠在老年表現(xiàn)為肥胖合并胰島素抵抗，而CTRP9 轉(zhuǎn)基因小鼠飲食誘導(dǎo)的肥胖及代謝紊亂癥狀得到改善（Peterson et al.， 2013）。血清CTRP9 水平的降低與心血管的損傷及功能紊亂有關(guān)，CTRP9 水平增加可以改善代謝紊亂及胰島素抵抗，改善心血管功能。本研究發(fā)現(xiàn)，與WKY 組相比，SHR 組大鼠的心肌超微結(jié)構(gòu)破壞，心肌功能紊亂，血清CTRP9 水平降低；與SHR 組相比，SE 組大鼠心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)和心肌功能明顯改善，血清CTRP9 水平增加。據(jù)此，本研究推測(cè)，SHR 大鼠血清CTRP9 水平的降低可能與心肌結(jié)構(gòu)受損和心肌功能紊亂有關(guān)，運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR 大鼠心肌結(jié)構(gòu)和功能的改善作用可能與血清CTRP9 水平上調(diào)有關(guān)。

本研究顯示，8周的有氧運(yùn)動(dòng)可明顯增加SHR大鼠血清及心肌CTRP9這一內(nèi)源性心肌保護(hù)因子的水平。本研究推測(cè)，血清中CTRP9 的增加可能與運(yùn)動(dòng)引起的心肌CTRP9 的增加有關(guān)。Kon 等（2019）研究發(fā)現(xiàn)，一次大強(qiáng)度的間歇運(yùn)動(dòng)可增加健康個(gè)體血清中CTRP9 的水平，改善胰島素的敏感性，這與本研究結(jié)果一致。Choi 等（2013）研究顯示，3 個(gè)月的有氧及阻力訓(xùn)練可以增加血漿中CTRP5 的水平，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)對(duì)血清中CTRP 家族分子的影響與運(yùn)動(dòng)方案有關(guān)。

CTRP9 可通過(guò)激活A(yù)dipoR1-AMPK 信號(hào)途徑發(fā)揮對(duì)心血管的保護(hù)作用。本研究中，自發(fā)性高血壓大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK 的蛋白表達(dá)明顯下降，CTRP9-AdipoR1-AMPK 信號(hào)系統(tǒng)下調(diào)，CTRP9 對(duì)心肌的保護(hù)作用減弱，心肌功能下降；而經(jīng)過(guò)8 周有氧運(yùn)動(dòng)后，自發(fā)性高血壓大鼠心肌CTRP9、AdipoR1、AMPK 的表達(dá)明顯提高，CTRP9-AdipoR1-AMPK 信號(hào)系統(tǒng)上調(diào)，CTRP9 的心肌保護(hù)作用增加，心肌功能明顯改善。本研究結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠的心肌保護(hù)作用與心肌CTRP9-AdipoR1-AMPK 信號(hào)系統(tǒng)的上調(diào)有關(guān)。

eNOS 作為CTRP9-AdipoR1-AMPK 信號(hào)途徑的下游底物之一被激活后，促使NO 的生成，發(fā)揮對(duì)心血管的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性高血壓大鼠心肌eNOS 和NO 的水平明顯下降，而運(yùn)動(dòng)可顯著提高心肌eNOS 和NO的水平。本研究結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)激活CTRP9-AdipoR1-AMPK-eNOS 通路增加NO 的水平，發(fā)揮對(duì)心肌的保護(hù)作用。此外，CTRP9 還可激活A(yù)dipoR1-AMPKNFκB 途徑，增強(qiáng)免疫功能、減輕心梗大鼠心肌損傷（Liu et al.， 2019），而CTRP9 抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用與CTRP9激活A(yù)dipoR1-AMPK 途徑抑制mTOR 的磷酸化有關(guān)（Huang et al.， 2019）。下游底物NFκB、mTOR 與CTRP9 對(duì)高血壓大鼠心肌的保護(hù)作用是否有關(guān)及其確切機(jī)制，還有待深入探究。

4 結(jié)論

1）自發(fā)性高血壓大鼠心肌結(jié)構(gòu)受損及心肌功能下降與心肌CTRP9 水平下降有關(guān)。

2）長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)可通過(guò)促進(jìn)心肌CTRP9 的表達(dá)，上調(diào)CTRP9-AdipoR1-AMPK-eNOS 信號(hào)通路改善自發(fā)性高血壓大鼠的心肌功能。