金黃色葡萄球菌小菌落突變體誘導(dǎo)篩選及特性研究

周宇， 李佳玉， 王樂(lè)， 賈曉爽， 高思琦， 王瀟， 焦健*

（1.北京城市學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)部，北京 100094； 2.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315211）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種常見(jiàn)的人類(lèi)致病菌，約30%的人群是無(wú)癥狀攜帶者，60%是間歇性攜帶者[1]。作為一種重要的人畜致病菌，S. aureus在畜牧業(yè)中以引發(fā)奶牛乳房炎為主，其比例高達(dá)50%以上，產(chǎn)奶量下降20%左右，且治愈率較低，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前，主要依靠抗生素進(jìn)行針對(duì)性治療，但在治療過(guò)程中，存活下來(lái)的S. aureus會(huì)通過(guò)代謝途徑的改變，形成較難清除的小菌落突變體（small colony variants, SCVs），導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性愈發(fā)嚴(yán)重[3]。

SCVs在臨床S. aureus感染中發(fā)生率約為1%～30%[4]，可誘發(fā)人類(lèi)腹膜炎[5]和假體周?chē)P(guān)節(jié)感染[6]，甚至?xí)鹧?、骨骼、人工關(guān)節(jié)、大腦、皮膚、起搏器和囊性纖維化肺感染[7]。SCVs在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中可持續(xù)存在，誘發(fā)慢性牛乳房炎疾病，導(dǎo)致久病不愈[8]。目前，通常選擇利福平與1種或多種敏感的抗生素聯(lián)合用藥治療SCVs感染[9]，極大程度上加重了耐藥性菌株的出現(xiàn)，給醫(yī)療保健系統(tǒng)及畜牧業(yè)帶來(lái)巨大的負(fù)擔(dān)。此外，SCVs具有獨(dú)特的表型特征和致病特性，如生長(zhǎng)緩慢、毒力因子表達(dá)量降低、黏附因子表達(dá)量提高、類(lèi)胡蘿卜素色素流失、溶血活性降低和凝固酶活性降低等[10-11]，同時(shí)形成生物膜的能力、免疫耐受能力[5]及抗生素耐受能力[12]均增強(qiáng)，進(jìn)而使其在細(xì)胞內(nèi)存活，誘發(fā)持續(xù)性、復(fù)發(fā)性感染[13-14]。因此，對(duì)于防控此類(lèi)疾病蔓延、開(kāi)展SCVs致病機(jī)理研究及新型抗SCVs藥物研發(fā)工作，穩(wěn)定型SCVs的獲得顯得至關(guān)重要。

目前，獲得SCVs常用的方法有低水平抗菌劑誘導(dǎo)法、基因敲除法以及分離鑒定法。低水平抗菌劑誘導(dǎo)篩選法是利用S. aureus最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration, MIC， μg·mL-1）篩選具有SCVs特定性狀的突變體，如在培養(yǎng)基中添加2×MIC慶大霉素[3]、三氯生[15]、莫西沙星、克林霉素以及利福平等抗菌類(lèi)藥物對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行孵育，可篩選得到SCVs[16]。研究表明，利用低水平抗菌劑誘導(dǎo)技術(shù)，約5%～10%的菌體可轉(zhuǎn)化為SCVs，誘導(dǎo)篩選得到的SCVs穩(wěn)定性較高，不易恢復(fù)野生表型，并產(chǎn)生耐藥性[16]。研究者在利用基因敲除手段獲得SCVs相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)SCVs的形成與Agr及SigB調(diào)控系統(tǒng)中相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)[4,17-21]。對(duì)影響上述調(diào)控系統(tǒng)的agr基因敲除，可獲得穩(wěn)定的SCVs菌株[22]，為利用敲除或過(guò)表達(dá)手段對(duì)參與SCVs形成的相關(guān)基因編輯，獲得穩(wěn)定型SCVs提供更多思路。除此之外，利用選擇分離鑒定方法，在奶牛乳房炎的病變組織中分離鑒定并獲得SCVs，在SCVs感染患者的血液、尿液、痰、膿液、耳朵分泌物等樣本中也分離得到SCVs，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序鑒定[23]。

目前，對(duì)S. aureus的SCVs獲得方法的研究較少，由于低水平抗生素誘導(dǎo)法獲得SCVs的方法較簡(jiǎn)單，且部分抗生素不僅對(duì)金黃色葡萄球菌殺傷能力有限，還能夠促進(jìn)SCVs的形成[24-25]，同時(shí)利用低水平抗生素篩選SCVs方法已有報(bào)道，為本研究提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，但其篩選得到的SCVs不穩(wěn)定[3]。因此，本試驗(yàn)將選擇利用低質(zhì)量濃度（1.25～5.00 μg·mL-1）慶大霉素二次誘導(dǎo)野生型S. aureusATCC 43300，旨在獲得更穩(wěn)定的SCVs，并對(duì)篩選得到的SCVs菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和穩(wěn)定性及部分特性研究，為探究高效、安全、低耐藥、新型針對(duì)SCVs藥物提供穩(wěn)定的受試菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究中使用的菌株為S. aureusATCC43300。

TSA與TSB培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）用于S. aureusATCC43300和SCVs生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min。

試驗(yàn)所用抗生素為慶大霉素（西典化學(xué)科技有限公司），用于對(duì)S. aureusATCC43300的誘導(dǎo)及SCVs培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 低質(zhì)量濃度慶大霉素誘導(dǎo)獲得SCVs方法 參照文獻(xiàn)[26]的方法，對(duì)S.aureusATCC43300的最小抑菌濃度（MIC）進(jìn)行測(cè)定。首先，挑取S. aureusATCC43300單菌落過(guò)夜活化培養(yǎng)，1%轉(zhuǎn)接于TSB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)4 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用TSB培養(yǎng)基將其稀釋至1×105CFU·mL-1，加入90 μL稀釋后的菌液于96孔無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。然后，利用二倍梯度稀釋法將慶大霉素梯度稀釋至不同質(zhì)量濃度（1 mg·mL-1和500.000、250.000、125.000、62.500、31.250、15.625 μg·mL-1），取10 μL不同質(zhì)量濃度的慶大霉素分別加入上述96孔培養(yǎng)板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)12 h，測(cè)定慶大霉素對(duì)S. aureusATCC43300的MIC。陰性對(duì)照組（PBS）和空白對(duì)照組（ddH2O）做相同處理，每組3個(gè)重復(fù)。同時(shí)從上述有抑菌效果的孔中取10 μL培養(yǎng)物涂布于TSA平板上，進(jìn)一步測(cè)定S. aureusATCC43300的最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC，μg·mL-1)。

本試驗(yàn)選用低質(zhì)量濃度（1.25～5.00 μg·mL-1）慶大霉素二次誘導(dǎo)法獲得SCVs。將活化后的S. aureusATCC43300菌液1%轉(zhuǎn)接于含1/2×MIC慶大霉素的TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r·min-1振蕩培養(yǎng)6 h，取1 mL菌液置于1.5 mL的離心管中，4000 r·min-1離心5 min，棄上清，用 0.3 mLTSB重懸并梯度稀釋涂布于TSA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～48 h。挑取8個(gè)較小的單菌落轉(zhuǎn)接于2×MIC慶大霉素（5 μg·mL-1） TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r·min-1誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h，10倍梯度稀釋并涂布于TSA平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，同時(shí)將S. aureusATCC43300接種于TSB培養(yǎng)基中作為對(duì)照。選取3個(gè)SCVs菌株于甘油管中保存菌株。測(cè)定慶大霉素對(duì)野生型及SCVs的MIC及MBC，方法同上。

1.2.2 SCVs表型分析及生長(zhǎng)曲線測(cè)定方法 劃

線點(diǎn)板及生長(zhǎng)曲線測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[27]，將酵母培養(yǎng)的方法替換為S. aureusATCC43300及SCVs培養(yǎng)方法，且生長(zhǎng)曲線采樣時(shí)間稍作變化。具體方法如下：利用劃線培養(yǎng)法和稀釋點(diǎn)板法觀察SCVs表型。劃線培養(yǎng)法將S. aureusATCC43300和SCVs分別在TSA平板及含5 μg·mL-1慶大霉素的TSA平板上劃線培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。稀釋點(diǎn)板法將S. aureusATCC43300和SCVs過(guò)夜活化培養(yǎng)后分別10倍梯度稀釋至108、109和106、107。將上述稀釋后的菌液分別取5 μL于TSA培養(yǎng)基進(jìn)行點(diǎn)板。37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。為研究SCVs與野生型菌株生長(zhǎng)的快慢，對(duì)其生長(zhǎng)曲線進(jìn)行測(cè)定。分別將S. aureusATCC43300和SCVs菌液，1%轉(zhuǎn)接至50 mL的TSB培養(yǎng)基中，其中SCVs的TSB培養(yǎng)基中加入5 μg·mL-1慶大霉素，每組3個(gè)重復(fù)。每隔1 h取樣，在紫外分光光度計(jì)OD600處測(cè)量其光密度值，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 結(jié)晶紫染色法驗(yàn)證SCVs形成生物膜的能力 結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物膜的方法參照文獻(xiàn)[28]。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的S. aureusATCC43300和SCVs用TSB稀釋至OD600為3，每孔200 μL接種于96孔板中，6個(gè)重復(fù)，并以TSB培養(yǎng)基為空白對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h。將每孔的上清液用移液槍小心吸棄，PBS溶液將剩余菌液清洗3次，自然晾干后向每孔中加入100 μL的2.5%戊二醛固定，90 min后吸棄固定液，PBS清洗2次。再向每孔加入100 μL的0.1%結(jié)晶紫溶液染色15 min，用蒸餾水沖洗掉多余染液，置于室溫干燥。最后向每孔中加入200 μL的95%乙醇溶解30 min，用酶標(biāo)儀在OD570處測(cè)量吸光值。通過(guò)結(jié)晶紫染色法進(jìn)行鑒定，陰性對(duì)照的平均OD600定義為ODc，待測(cè)菌株OD與ODc比較，將菌株生物膜形成能力分為4類(lèi)：陰性（-），OD＜ODc；少量（1+），ODc＜OD≤2 ODc；中量（2+），2 ODc＜OD≤4 ODc；大量（3+），OD＞4 ODc。

1.2.4 恢復(fù)突變率測(cè)定方法 首先，挑取活化后的SCVs單菌落分別置于TSB培養(yǎng)基和含5 μg·mL-1慶大霉素的TSB培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，取菌液稀釋涂布于不含有慶大霉素的TSA平板中37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。觀察并記錄大小菌落個(gè)數(shù)，計(jì)算SCVs的恢復(fù)突變率[3]。然后，將第1代的SCVs經(jīng)20次傳代后，置于含5 μg·mL-1慶大霉素的TSB培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。培養(yǎng)后，取菌液稀釋涂布于不含慶大霉素的TSA平板中37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。觀察并記錄大小菌落個(gè)數(shù)，計(jì)算SCVs經(jīng)20次傳代培養(yǎng)后的恢復(fù)突變率。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 為探究SCVs對(duì)其他廣譜類(lèi)抗菌藥物的敏感性，對(duì)SCVs及野生型S. aureusATCC43300菌株進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定[29]。將活化后的野生型S. aureusATCC43300菌液與液體狀態(tài)下的TSA培養(yǎng)基混合，并將活化后的SCVs菌液與含有5 μg·mL-1慶大霉素的液體狀態(tài)的TSA培養(yǎng)基混合，均進(jìn)行倒平板，待凝固后分別將青霉素、氨芐西林、頭孢曲松、四環(huán)素、紅霉素、林可霉素、復(fù)方新諾明、氯霉素8種藥物的藥敏片按順序貼在含有野生型S. aureusATCC43300及SCVs的TSA平板上。37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，觀察并記錄透明圈大小。

1.2.6 凝血試驗(yàn) 為觀察其凝血快慢，分別取100 μL活化后的SCVs與野生型S. aureusATCC43300菌液于1.5 mL離心管中，向菌液中加入400 μL含檸檬酸鈉（3.2%）的人血，吹吸混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育，前4 h每30 min觀察1次，然后每隔2 h觀察1次，觀察并記錄凝塊時(shí)間[30]。

1.2.7 脅迫試驗(yàn) 為驗(yàn)證SCVs在極端情況下的存活率，分別對(duì)SCVs和S. aureusATCC43300進(jìn)行高滲透壓脅迫分析試驗(yàn)[31]。將S. aureusATCC43300與SCVs分別培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，分裝為500 μL·支-1，各分裝4支離心管，3000 r·min-1離心5 min，棄上清，將沉淀分別重懸于500 μL無(wú)菌25%、30%、35%及對(duì)照0.9%的NaCl溶液中，室溫靜置1 h，3000 r·min-1離心5 min，棄上清，并用500 μL無(wú)菌0.9% NaCl溶液重懸，進(jìn)行梯度稀釋涂平板，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。將上述計(jì)算得到的菌落數(shù)按照如下公式計(jì)算S. aureusATCC43300與SCVs的存活率。

1.2.8 SCVs相關(guān)特性基因表達(dá) 挑取活化后的S. aureusATCC43300和SCVs單菌落于TSB及含5 μg·mL-1慶大霉素的TSB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，1%轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，并稀釋到1×108CFU·mL-1，按RNAprep Pure細(xì)菌總RNA提取試劑盒(DP430)說(shuō)明書(shū)提取RNA，再將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為熒光定量PCR的模板，按ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。以S. aureusATCC43300為對(duì)照與SCVs中Agr及SigB調(diào)控系統(tǒng)和毒力基因及生物膜相關(guān)基因表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比分析。引物如表1所示。

表1 Agr及SigB調(diào)控系統(tǒng)中相關(guān)基因的擴(kuò)增引物［32-37］Table 1 Amplification primers of Agr and SigB regulatory system genes［32-37］

2 結(jié)果與分析

2.1 低質(zhì)量濃度慶大霉素誘導(dǎo)獲得SCVs分析

利用低質(zhì)量濃度抗生素誘導(dǎo)法獲得SCVs，首先對(duì)S. aureusATCC43300的MIC進(jìn)行測(cè)定，由表2所示，慶大霉素對(duì)S. aureusATCC43300的MIC為2.5 μg·mL-1。

表2 MIC和MBC的測(cè)定Table 2 Determination of MIC and MBC

然后，在含1/2×MIC慶大霉素TSB培養(yǎng)基中對(duì)S. aureusATCC43300進(jìn)行誘導(dǎo)，篩選得到SCVs。在TSA平板上，未誘導(dǎo)的對(duì)照組菌落大小均勻、大而突起、不透明、圓形、表面光滑，與對(duì)照組相比，經(jīng)1/2×MIC慶大霉素誘導(dǎo)的S. aureusATCC43300，菌落生長(zhǎng)大小不均勻，出現(xiàn)明顯較小的菌落（圖1A）。選取8個(gè)較小的單菌落，轉(zhuǎn)接至含2×MIC慶大霉素TSB培養(yǎng)基再次誘導(dǎo)培養(yǎng)并涂布于TSA平板。與未誘導(dǎo)的S. aureusATCC43300相比，篩選到表型均一、較小且生長(zhǎng)緩慢的SCVs（圖1B），且慶大霉素對(duì)SCVs的MIC及MBC均是野生型的5倍（表2）。

圖1 低質(zhì)量濃度慶大霉素對(duì)SCVs的篩選Fig. 1 Screening of SCVs with gentamicin at low mass concentration

2.2 SCVs表型及生長(zhǎng)曲線測(cè)定分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證SCVs表型的穩(wěn)定性，通過(guò)劃線法和點(diǎn)板法在TSA和含5 μg·mL-1慶大霉素的TSA平板上觀察SCVs與S. aureusATCC43300的生長(zhǎng)情況（圖2），在TSA平板上，S. aureusATCC43300與SCVs均生長(zhǎng)，而在含5 μg·mL-1慶大霉素的TSA平板上，S. aureusATCC43300不生長(zhǎng)，SCVs可以正常生長(zhǎng)，且SCVs與S. aureusATCC43300相比菌落較小、細(xì)胞數(shù)較少，與圖1結(jié)果一致。

圖2 SCVs表型的鑒定Fig. 2 Identification of SCVs phenotypes

由于SCVs菌體比S. aureusATCC43300小，為進(jìn)一步驗(yàn)證SCVs生長(zhǎng)情況，對(duì)其生長(zhǎng)曲線進(jìn)行測(cè)定。由圖3可知，SCVs生長(zhǎng)速度較慢，需培養(yǎng)至7 h后才可達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌落數(shù)可達(dá)5×108CFU·mL-1，與S. aureusATCC43300培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)菌落數(shù)一致。

圖3 SCVs生長(zhǎng)曲線的測(cè)定Fig. 3 Determination of SCVs growth curve

2.3 結(jié)晶紫染色法驗(yàn)證SCVs形成生物膜的能力分析

利用結(jié)晶紫染色對(duì)SCVs和S. aureusATCC43300進(jìn)行產(chǎn)生物膜能力測(cè)定，結(jié)果如表3所示，SCVs產(chǎn)生物膜能力較強(qiáng)，在波長(zhǎng)570 nm處其產(chǎn)生物膜能力是S. aureusATCC43300的2倍以上。

表3 結(jié)晶紫法鑒定形成生物膜能力Table 3 Identification of biofilm forming ability of crystal violet staining

2.4 SCVs恢復(fù)突變率分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證SCVs的穩(wěn)定性，對(duì)SCVs恢復(fù)突變率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。將SCVs在含5 μg·mL-1慶大霉素的TSB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)轉(zhuǎn)接至TSA平板培養(yǎng)，其恢復(fù)突變率為0%；而SCVs在無(wú)抗性的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至TSA平板上過(guò)夜培養(yǎng)，菌株發(fā)生了恢復(fù)突變，其恢復(fù)突變率為30%。經(jīng)過(guò)20次傳代后，SCVs在無(wú)抗性的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至TSA平板過(guò)夜培養(yǎng)，其恢復(fù)突變率為0%。

2.5 藥敏試驗(yàn)分析

培養(yǎng)12 h后，SCVs抑菌圈不明顯，但仍可測(cè)量出此時(shí)抑菌圈大小，野生型S. aureusATCC43300抑菌圈清晰可見(jiàn)。培養(yǎng)24 h后，SCVs與野生型S. aureusATCC43300抑菌圈均清晰可見(jiàn)，且經(jīng)測(cè)量發(fā)現(xiàn)SCVs抑菌圈直徑與12 h時(shí)相同。SCVs及野生型S. aureusATCC43300藥敏試驗(yàn)結(jié)果(表4)顯示，SCVs對(duì)紅霉素不敏感，對(duì)頭孢曲松輕微敏感。

表4 小菌落突變體與野生型S. aureus ATCC43300藥敏試驗(yàn)Table 4 SCVs and S. aureus ATCC43300 drug susceptibility test

2.6 凝血試驗(yàn)分析

在3.2%檸檬酸鈉抗凝的血漿樣品中，野生型S. aureusATCC43300形成凝塊的時(shí)間是SCVs的5.5倍，其中，S. aureusATCC43300和SCVs形成凝塊的時(shí)間分別為4和22 h。

2.7 脅迫試驗(yàn)分析

SCVs和野生型S. aureusATCC43300在高滲透壓脅迫下的存活率如表5所示，在25% NaCl溶液脅迫下，S. aureusATCC43300和SCVs的存活率分別為58%和57%；30% NaCl溶液脅迫下，S. aureusATCC43300和SCVs的存活率分別為11%和38%；35% NaCl溶液脅迫下，S. aureusATCC43300和SCVs的存活率分別為10%和31%。鹽脅迫試驗(yàn)表明，隨NaCl含量的升高，S. aureusATCC43300與SCVs存活率均降低，但在30%和35%的NaCl溶液中SCVs的存活率明顯高于S. aureusATCC43300。

表5 高滲透壓下野生型S. aureus ATCC43300與SCVs的存活率Table 5 Survival rate of S. aureus ATCC43300 and SCVs under high osmotic pressure（%）

2.8 SCVs相關(guān)特性基因表達(dá)分析

利用熒光定量PCR方法，對(duì)SCVs及野生型S. aureusATCC43300菌株中Agr及SigB調(diào)控系統(tǒng)和毒力基因及生物膜相關(guān)基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在形成SCVs后，Agr調(diào)控系統(tǒng)中相關(guān)基因呈下調(diào)趨勢(shì)（圖4A），其中agrA、agrC、RNAIII轉(zhuǎn)錄水平分別下調(diào)至野生型S. aureusATCC43300的39%、27%和26%，agrB和agrD轉(zhuǎn)錄水平分別下調(diào)至0.04%和0.02%；而SigB調(diào)控系統(tǒng)中相關(guān)基因（sigB、rsbV、rsbU、rsbW）上調(diào)0.6～1.2倍（圖4B）；圖4C結(jié)果顯示，除sarA外，形成生物膜基因呈上調(diào)趨勢(shì)，其中clfA表達(dá)量上調(diào)27.7倍，sarA下調(diào)至39%，relQ、relP、rsh、luxS、ccp、icaD、eno基因表達(dá)量是野生型菌株的1.0～5.4倍，上述結(jié)果表明所篩選的SCVs為胸苷突變體；同時(shí)，SCVs毒力水平下降（圖4D），其中，毒力基因spa下調(diào)至0.4%，pvl及hla表達(dá)量分別下調(diào)至35.0%和2.8%。

圖4 SCVs特性基因相對(duì)表達(dá)Fig. 4 Relative expression of characteristic genes in SCVs

3 討論

S.aureus是引起醫(yī)療和畜牧業(yè)獲得性感染的主要致病菌之一，在營(yíng)養(yǎng)缺失、活性氧、低pH及抗菌藥物作用等應(yīng)激環(huán)境下可形成SCVs[38]。通常，抗生素可有效殺死SCVs，但持續(xù)用藥會(huì)降低膜電位，從而限制氨基糖苷（如慶大霉素）的攝取，誘發(fā)慢性、持續(xù)性和復(fù)發(fā)性感染，并加重細(xì)菌耐藥性，為根治此類(lèi)疾病帶來(lái)困難[39-40]?，F(xiàn)有的篩選方法具有篩選時(shí)間長(zhǎng)、表型不穩(wěn)定、恢復(fù)突變率高、基因敲除困難等弊端，給SCVs致病機(jī)制的研究及抗SCVs藥物的研發(fā)帶來(lái)難題。因此，穩(wěn)定型SCVs方法的建立，為探究高效、安全、低耐藥、新型針對(duì)金黃色葡萄球菌SCVs藥物提供穩(wěn)定的生物學(xué)材料。

SCVs的形成均受Agr及SigB調(diào)控途徑影響[38]，Agr及SigB調(diào)控系統(tǒng)分別在SCVs定植階段、入侵階段及應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，同時(shí)提高其黏附及產(chǎn)生物膜能力，降低毒力基因表達(dá)，保持其定植狀態(tài)，形成穩(wěn)定型SCVs。本試驗(yàn)利用熒光定量PCR方法證實(shí)，SCVs中agrA和agrC轉(zhuǎn)錄水平分別下調(diào)至野生型S. aureusATCC43300的39%和27%，agrB和agrD轉(zhuǎn)錄水平分別下調(diào)至0.04%和0.02%，Agr調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)基因呈下調(diào)趨勢(shì)致使下游RNAIII表達(dá)量下降至26%，達(dá)到其穩(wěn)定定植的目的。而SigB作為革蘭氏陽(yáng)性菌的主要壓力應(yīng)答因子，在應(yīng)激狀態(tài)下感知環(huán)境變化，調(diào)節(jié)菌體基因表達(dá)，抑制毒力基因表達(dá)，誘發(fā)表型轉(zhuǎn)換，形成SCVs[18-20]。本試驗(yàn)結(jié)果再次驗(yàn)證，SigB調(diào)控系統(tǒng)中相關(guān)基因（sigB、rsbV、rsbU、rsbW）上調(diào)（0.6～1.2倍），可有效下調(diào)免疫原性毒力因子，抑制毒力基因spa、pvl及hla的表達(dá)。同時(shí)，產(chǎn)生物膜能力的提高對(duì)SCVs復(fù)發(fā)性感染密切相關(guān)，通過(guò)上調(diào)ica相關(guān)因子可增加產(chǎn)膜能力，與本結(jié)果一致[41]。因此，利用低水平慶大霉素誘導(dǎo)法篩選得到的SCVs，具有菌落較小、生長(zhǎng)緩慢、產(chǎn)生物膜能力增強(qiáng)、毒力因子下調(diào)、Agr調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)因子下調(diào)、SigB調(diào)控系統(tǒng)中基因上調(diào)、除sarA外形成生物膜基因呈上調(diào)趨勢(shì)、表型穩(wěn)定的特性，上述結(jié)果與已有結(jié)果一致[42-43]。

同時(shí)，由sarA下調(diào)推測(cè)所篩選的SCVs為胸苷突變體[25]，或僅通過(guò)調(diào)控途徑降低致病菌毒力，使其達(dá)到長(zhǎng)期定植的目的。S. aureus對(duì)慶大霉素的攝取取決于膜電位，當(dāng)電子傳遞鏈中的電子流受損時(shí)，膜電位會(huì)大大降低，限制了質(zhì)子在細(xì)胞膜上梯度的建立，這不僅導(dǎo)致氨基糖苷類(lèi)物質(zhì)的攝取減少，還出現(xiàn)無(wú)法利用大多數(shù)糖類(lèi)和乳酸的現(xiàn)象，最終導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)變慢，出現(xiàn)小菌落，逃避宿主免疫反應(yīng)[44]。然而，在缺乏抗生素選擇壓力的情況下，SCVs表型可能存在不穩(wěn)定的現(xiàn)象，伴隨氨基糖苷類(lèi)耐藥性的喪失，進(jìn)而恢復(fù)到野生型菌落表型[1]。Martin等[3]利用低水平慶大霉素誘導(dǎo)技術(shù)獲得點(diǎn)突變的SCVs，在非抗生素壓力條件下其恢復(fù)突變率高達(dá)80%，其中，15個(gè)SCVs中有12個(gè)菌株可恢復(fù)至野生型表型，其余未恢復(fù)突變的3個(gè)菌株均為片段缺失的菌株。為解決恢復(fù)突變率高的問(wèn)題，本研究采用二次誘導(dǎo)法獲得SCVs，經(jīng)1/2×MIC及2×MIC慶大霉素分別誘導(dǎo)6和12 h，可獲得SCVs，在5 μg·mL-1慶大霉素培養(yǎng)條件下可維持穩(wěn)定的表型，其恢復(fù)突變率為0%，然而在非抗生素壓力條件下，有30%的恢復(fù)突變率。為進(jìn)一步提升其穩(wěn)定性，降低恢復(fù)突變率，在5 μg·mL-1慶大霉素培養(yǎng)條件下連續(xù)傳代20次，在非抗生素壓力條件下，其恢復(fù)突變率為0%。為了維持其穩(wěn)定性，后續(xù)藥敏、凝血、脅迫及熒光定量PCR試驗(yàn)仍加入慶大霉素維持其穩(wěn)定表型?；谝陨辖Y(jié)果，推測(cè)所篩選的SCVs為胸苷突變體，并受Agr及SigB調(diào)控系統(tǒng)中相關(guān)調(diào)控途徑影響。后續(xù)將進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)增加恢復(fù)突變的篩選數(shù)量，得到片段缺失的無(wú)需抗生素環(huán)境培養(yǎng)的更為穩(wěn)定的SCVs。

目前，除利用低濃度抗誘導(dǎo)法獲得SCVs外，常用的SCVs獲得方法還有基因敲除技術(shù)和分離篩選鑒定技術(shù)。利用敲除法獲得的SCVs表型穩(wěn)定，不產(chǎn)生恢復(fù)突變的SCVs，并可進(jìn)一步探究其致病機(jī)制[22,45]。但與基因敲除法相比，利用低水平慶大霉素誘導(dǎo)技術(shù)獲得的SCVs雖然在非抗生素壓力條件下存在不穩(wěn)定的現(xiàn)象，但低劑量添加抗生素維持其穩(wěn)定表型對(duì)新藥研發(fā)影響極小。此外，從首次誘導(dǎo)到成功篩選穩(wěn)定型SCVs僅需3 d，而利用基因敲除手段獲得SCVs用時(shí)較長(zhǎng)，且成功率較低，存在風(fēng)險(xiǎn)。另外，與臨床樣本中分離鑒定法相比，低濃度抗誘導(dǎo)法較為安全，且具有操作簡(jiǎn)單、無(wú)需采集病理樣本及16S rRNA測(cè)序診斷等優(yōu)點(diǎn)[23,46]。因此，本研究利用低水平慶大霉素二次誘導(dǎo)方法獲得SCVs，具有操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)較短，表型穩(wěn)定，特性明確等優(yōu)點(diǎn)，為SCVs獲得提供新方法，同時(shí)為新型藥物在持續(xù)性、復(fù)發(fā)性SCVs感染防治研究中提供穩(wěn)定的生物學(xué)材料。