基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討肺巖寧方治療非小細(xì)胞肺癌機(jī)制

桑舒柳，丁蓉珍，姜靖潔，龔亞斌

作者單位：上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腫瘤科，上海 200437

據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前肺癌的死亡率仍居首位，是癌癥死亡的主要原因［1］。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）約占肺癌總發(fā)病率的85%［2］。肺癌治療方法包括手術(shù)、放化療、靶向、免疫等［3-4］，但病人預(yù)后欠佳。據(jù)調(diào)查顯示約40%的NSCLC 病人存在表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變［5］，靶向治療在臨床應(yīng)用越來(lái)越廣泛，但病人仍出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。多項(xiàng)研究已證實(shí)中醫(yī)藥在惡性腫瘤的治療中應(yīng)用廣泛，可增效減毒，提高病人生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期等［6］。肺巖寧方是上海市名中醫(yī)徐振曄教授總結(jié)多年臨床實(shí)踐而研發(fā)出來(lái)的抗癌經(jīng)驗(yàn)方，由生黃芪、黃精、石見(jiàn)穿、七葉一枝花等組成，具有益氣養(yǎng)精，解毒散結(jié)之功［7］。臨床研究表明肺巖寧方能有效抑制晚期肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移［8］，并能有效提高NSCLC 病人的生存質(zhì)量［9］，但肺巖寧方治療EGFR 突變型NSCLC 的具體分子機(jī)制仍未闡明。本研究于2020 年 11 月至2021 年 2 月以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為切入點(diǎn)，預(yù)測(cè)肺巖寧方治療EGFR 突變型NSCLC 的主要活性成分、作用靶點(diǎn)及作用通路，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證，探討肺巖寧方治療EGFR突變型NSCLC的潛在作用機(jī)制，為其臨床上更廣泛應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化合物有效成分和靶點(diǎn)的收集及疾病靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)以“白術(shù)”“蜂房”“干蟾皮”“黃精”“黃芪”“靈芝”“山慈菇”“石見(jiàn)穿”“淫羊藿”“重樓”“山茱萸”為檢索詞，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中檢索11 味藥的化學(xué)成分，根據(jù)藥物動(dòng)力學(xué)（ADME），以生物利用度（OB）≥30%，類(lèi)藥性（DL）≥0.18為限制條件。查閱文獻(xiàn)后對(duì)TCMSP中未預(yù)測(cè)到的有效化合物成分進(jìn)行補(bǔ)充。在Pubchem提取相應(yīng)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的smile 號(hào)，并通過(guò)Swiss Tar?get Prediction收集對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。

將關(guān)鍵詞設(shè)置為“non-small cell lung cancer”，檢索Genecard（www.genecards.org）和DisGeNET（www.disgenet.org）數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇“Homo sapiens”，檢索NSCLC 的疾病靶點(diǎn)。然后將藥物靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)取并集，得到韋恩圖，并集得到的靶點(diǎn)則為肺巖寧方治療NSCLC的潛在靶點(diǎn)。

1.2 肺巖寧方活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建將上述獲得的活性成分及靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)關(guān)系導(dǎo)入到軟件Cytoscape 3.7.2 中進(jìn)行相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析，畫(huà)出肺巖寧方“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”圖，采用“Network Analyze”插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析來(lái)篩選重要的活性成分。

將肺巖寧方與NSCLC 的并集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https：//string-db.org） 平臺(tái)，選擇“Homo sapiens”，篩選條件為置信度>0.7，下載蛋白互作文件后將其導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2 中，生成PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，以“De?gree”“BetweennessCentrality”和“ClosenessCentrality”超過(guò)中位數(shù)的值來(lái)篩選出重要靶點(diǎn)。

1.3 基因富集分析和化合物-靶點(diǎn)-通路圖的構(gòu)建將1.2 的重要靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape（http：//metascape.org/）平臺(tái)，選擇“Homo sapiens”， 進(jìn)行GO 和 KEGG富集分析。用Cytoscape畫(huà)出肺巖寧方化合物-靶點(diǎn)-通路關(guān)系圖。

1.4 肺巖寧方抗非小細(xì)胞肺癌核心靶點(diǎn)的篩選將“1.2”篩選的靶點(diǎn)導(dǎo)入GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇“總體生存”，P<0.05 和P（HR）<0.05 作為L(zhǎng)UAD 數(shù)據(jù)集的顯著性閾值，篩選出肺巖寧方治療NSCLC 的核心靶點(diǎn)。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)EGFR 突變型肺癌細(xì)胞株HCC827購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，置于37 ℃、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中。將肺巖寧方干燥成凍干粉后保存于?20 ℃冰箱中。按照實(shí)驗(yàn)要求將肺巖寧方凍干粉溶解于培養(yǎng)基中稀釋成所需濃度，用0.22μm濾器過(guò)濾后現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.6 CCK8 實(shí)驗(yàn)HCC827 細(xì)胞用不同濃度（0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 g/L）的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)在96 孔板中，對(duì)照組則為不含肺巖寧方的培養(yǎng)基，密度為3×103個(gè)/孔。肺巖寧方干預(yù)48 h后在每板內(nèi)加入CCK-8 試劑（每孔10 μL），隨后放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，測(cè)定每孔的吸光度（OD）值，波長(zhǎng)設(shè)置為450 nm，計(jì)算細(xì)胞抑制率和IC50值。

1.7 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)將HCC827 細(xì)胞以1 000個(gè)/孔的密度接種于六孔板孔內(nèi)，用含30%FBS 的培養(yǎng)基，用不同濃度的肺巖寧方干預(yù)細(xì)胞，2 周后棄培養(yǎng)基，用PBS 清洗后用多聚甲醇固定30 min，加入0.1%結(jié)晶紫溶液染色，30 min 后流水沖洗，晾干拍照。

1.8 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)將HCC827細(xì)胞消化計(jì)數(shù)重懸至2×104個(gè)/孔，先加入100 U Matrigel 膠，再吸取細(xì)胞懸液，同時(shí)加入不同濃度的肺巖寧方到上室，下室加入500 μL 含15% FBS 的培養(yǎng)基后將24 孔板置于培養(yǎng)箱，24 h 將Transwell 小室取出，棄培養(yǎng)基，用PBS 輕微沖洗2 次，甲醛固定30 min 后加入 0.1%結(jié)晶紫溶液染色，30 min后用PBS清洗，晾干即可于倒置顯微鏡下拍照。

1.9 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)用trizol 試劑提取HCC827 細(xì)胞中總RNA。然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)生產(chǎn)廠家的說(shuō)明書(shū)采用RT-qPCR 芯片分析基因表達(dá)譜。采用2?ΔΔCt計(jì)算法測(cè)定mRNA表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。統(tǒng)計(jì)作圖采用GraphPad 軟件。數(shù)據(jù)以表示，兩組獨(dú)立樣本資料采用t檢驗(yàn)，多組間統(tǒng)計(jì)用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及治療靶點(diǎn)結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道和TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出有效成分白術(shù)8 種，蜂房6 種，干蟾皮10 種，黃精13 種，黃芪13 種，靈芝42 種，山慈菇7 種，石見(jiàn)穿7 種，淫羊藿16 種，重樓11 種。取P>0，將所有化合物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)去掉重復(fù)后得到靶點(diǎn)共904 個(gè)。GenCards 等數(shù)據(jù)庫(kù)收集到NSCLC 疾病靶點(diǎn)共3 813 個(gè)，我們將肺巖寧方和疾病靶點(diǎn)取并集得到521 個(gè)靶點(diǎn)，即肺巖寧方治療NSCLC 的潛在靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 肺巖寧方與NSCLC交叉靶點(diǎn)的韋恩圖

2.2 活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)由972 個(gè)節(jié)點(diǎn)構(gòu)成，包括7 637 條邊，其中單個(gè)靶點(diǎn)的度值（degree）決定所連接靶點(diǎn)的數(shù)量，見(jiàn)圖2。

圖2 肺巖寧方成分潛在治療靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

將521個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)，以置信度>0.7為條件進(jìn)行篩選后導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.2生成PPI網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析，以“Degree”大于中位數(shù)（51）、“BetweennessCentrality”大于中位數(shù)（0.009 325 23）和“ClosenessCentrality”大于中位數(shù)（0.454 049 14）為條件共篩選出重要靶點(diǎn)共71個(gè)。見(jiàn)圖3。

圖3 肺巖寧方NSCLC潛在治療靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO 和KEGG 富集分析將71 個(gè)重要靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 平臺(tái)，分析GO 和KEGG 富集情況。GO分析取P值前20，其中生物過(guò)程主要包括細(xì)胞遷移、正向調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移酶活性等，細(xì)胞組成主要包括膜筏、膜微區(qū)、胞質(zhì)核周區(qū)等，分子功能主要包括蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性磷酸轉(zhuǎn)移酶活性等。KEGG 富集分析顯示肺巖寧方抗NSCLC 的信號(hào)通路主要有PI3K-AKT 信號(hào)通路、癌癥相關(guān)信號(hào)通路HIF-1信號(hào)通路等。見(jiàn)圖4。

圖4 肺巖寧方治療NSCLC潛在靶點(diǎn)的GO和KEGG富集分析

2.4 肺巖寧方成分-NSCLC 治療靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建利用Cytoscape 建立肺巖寧方治療NSCLC的活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)由219 個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 579條邊組成（圖5）。

2.5 肺巖寧方核心靶點(diǎn)分析在GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索71 個(gè)重要靶點(diǎn)，通過(guò)總體生存率篩選出了14個(gè)核心靶點(diǎn)（表1）。

2.6 肺巖寧方具有抑制HCC827 細(xì)胞增殖的作用CCK8 結(jié)果顯示，用不同濃度的肺巖寧方（0~1 g/L）干預(yù)HCC827 細(xì)胞48 h，肺巖寧方能顯著降低細(xì)胞HCC827 細(xì)胞的增殖能力，并呈劑量依賴(lài)性。IC50值約為700 mg/L。見(jiàn)表2。

表2 用CCK8法檢測(cè)肺巖寧方（0~1 000 mg/L）作用48 h后的HCC827細(xì)胞的抑制率/（%，）

注：①與0 mg/L相比，P<0.01。②與對(duì)照組相比，P<0.001。

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2.7 肺巖寧方具有抑制HCC827 細(xì)胞集落形成的作用克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6 所示，與對(duì)照組相比，肺巖寧方干預(yù)14 d 后，HCC827 細(xì)胞的克隆形成數(shù)量明顯降低，且呈濃度依賴(lài)性，說(shuō)明肺巖寧方具有抑制HCC827細(xì)胞集落形成的作用。見(jiàn)表3。

圖6 肺巖寧方對(duì)HCC827細(xì)胞克隆形成的影響）

表3 肺巖寧方對(duì)HCC827細(xì)胞克隆形成的影響/（%，）

表3 肺巖寧方對(duì)HCC827細(xì)胞克隆形成的影響/（%，）

注：①與對(duì)照組相比，P=0.015。

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2.8 肺巖寧方具有抑制HCC827 細(xì)胞侵襲能力的作用侵襲結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，肺巖寧方干預(yù)24 h 后，HCC827 細(xì)胞的侵襲能力受到明顯抑制（P<0.001），說(shuō)明肺巖寧方具有抑制肺癌細(xì)胞的侵襲能力。見(jiàn)圖7，表4。

圖7 肺巖寧方對(duì)HCC827細(xì)胞侵襲能力的影響

表 4 肺巖寧方對(duì)HCC827細(xì)胞侵襲能力的影響/（%，）

表 4 肺巖寧方對(duì)HCC827細(xì)胞侵襲能力的影響/（%，）

注：①與對(duì)照組相比，P<0.01。②與對(duì)照組相比，P<0.001。

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2.9 肺巖寧方核心靶點(diǎn)mRNA 的驗(yàn)證為了驗(yàn)證肺巖寧方對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選的14 個(gè)核心靶點(diǎn)mRNA 水平的影響，用IC50的濃度干預(yù)HCC827 細(xì)胞48 h 后，采用RT-qPCR 芯片進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示肺巖寧方能抑制HCC827 細(xì)胞中KIT 的mRNA 表達(dá)（P<0.01）。見(jiàn)圖8，表5。

圖8 對(duì)照組和肺巖寧方組14個(gè)核心靶點(diǎn)的mRNA表達(dá)熱圖

表 5 干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體KIT mRNA的表達(dá)/

表 5 干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體KIT mRNA的表達(dá)/

注：①與對(duì)照組相比，P<0.05。

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3 討論

中藥方劑的化合物成分復(fù)雜，目前研究仍未完全闡明其分子機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種生物信息分析工具，被廣泛用于研究中藥方劑的活性成分及潛在作用靶點(diǎn)，為其作用機(jī)制提供依據(jù)［10-11］。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)肺巖寧方能下調(diào)CXCLs/CXCR2 軸抑制腫瘤微環(huán)境中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)從而預(yù)防肺癌轉(zhuǎn)移［12］。此外，肺巖寧方可以促進(jìn)代謝和改變線粒體膜電位來(lái)誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡［13］。為了進(jìn)一步研究肺巖寧方抗NSCLC 的分子機(jī)制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法挖掘肺巖寧方的活性成分，探索肺巖寧方化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與NSCLC 疾病靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)，并根據(jù)篩選出的核心靶點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

首先，通過(guò)ADME 篩選，從肺巖寧方11 味藥中鑒定出了133個(gè)活性成分，主要包括槲皮素、白藜蘆醇、黃芩素等。已有研究［14-15］證實(shí)，肺巖寧方中多個(gè)活性成分可以抗腫瘤，比如槲皮素（SCG5、YYH14、CL1、SJC2、HQ13）是一種黃酮類(lèi)化合物，存在于山慈菇、淫羊藿、重樓、石見(jiàn)穿、黃芪中，可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲以及抑制腫瘤血管生成、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和介導(dǎo)細(xì)胞自噬等多條途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。黃芩素（HJ1）來(lái)源于黃精，是一種生物類(lèi)黃酮，在不同癌細(xì)胞中均具有抗腫瘤作用［16］，并能抑制EMT 通過(guò)PI3K/Akt/NF-kB 途徑使肺腺癌細(xì)胞抗凋亡從而提高肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性［17］。白藜蘆醇（SJC5）來(lái)源于石見(jiàn)穿，是一種天然的多萜類(lèi)化合物，可作為癌細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)劑［18］，可通過(guò)抑制細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖［19］。因此，肺巖寧方抗NSCLC 的機(jī)制可能與多個(gè)化合物協(xié)同作用有關(guān)。

然后，本研究對(duì)肺巖寧方的化合物成分對(duì)應(yīng)的重要靶點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)和生存分析篩選出14 個(gè)靶點(diǎn)，PCR array 結(jié)果顯示肺巖寧方能抑制HCC827 細(xì)胞KIT 基因的mRNA水平。KIT 是一種干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體，也被稱(chēng)為原癌基因c-KIT 或CD117，是一種受體酪氨酸激酶。據(jù)研究［20］，KIT 是經(jīng)典的腫瘤干細(xì)胞（tumor stem cells，TSCs）標(biāo)志分子，參與新生血管形成。此外，KIT 基因在肺癌和其他小細(xì)胞癌，胸腺癌以及卵巢癌等多種腫瘤中過(guò)表達(dá)［21］，同時(shí)也是預(yù)測(cè)NSCLC 預(yù)后不佳的潛在標(biāo)志物［22-24］。我們發(fā)現(xiàn)KIT 基因直接靶向肺巖寧方中華蟾素（GCP4）、華蟾素毒精（GCP3）、黃芩素（HJ1）、薯蕷皂素（HJ4）、白藜蘆醇（SJC5）等化合物。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以激活Sirt1 來(lái)下調(diào)c-kit/SCF，影響慢性前列腺炎進(jìn)展中平滑肌癌的發(fā)展［25］。因此，肺巖寧方可能是通過(guò)KIT下調(diào)達(dá)到抗腫瘤的目的。

最后，本研究通過(guò)中藥-化合物-靶點(diǎn)通路的關(guān)系探索肺巖寧方治療NSCLC的潛在機(jī)制。KEGG結(jié)果顯示肺巖寧方治療NSCLC 主要涉及多種癌癥相關(guān)信號(hào)通路、PI3K-AKT 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路等信號(hào)通路。據(jù)報(bào)道，PI3K/Akt 信號(hào)通路是重要的癌癥通路，可以促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)［26］，在某些癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中易發(fā)生異常激活［27］，其中最廣泛的兩種機(jī)制是由受體酪氨酸激酶和信號(hào)通路中特定元素的體細(xì)胞突變觸發(fā)［28］。研究［29-30］顯示，PI3KAkt 信號(hào)通路在抑制肺癌細(xì)胞增殖和促凋亡中起著重要作用。PI3K 活性受多種癌基因和生長(zhǎng)因子受體的調(diào)控，其信號(hào)升高常被認(rèn)為是癌癥發(fā)生的標(biāo)志［31］。本研究發(fā)現(xiàn)KIT 基因是PI3K-AKT 通路的關(guān)鍵分子。研究［32］表明KIT 能與干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF） 結(jié)合激活下游PI3K-AKT 通路信號(hào)。因此，肺巖寧方可能是通過(guò)下調(diào)KIT 從而抑制PI3K-AKT 信號(hào)通路來(lái)達(dá)到抗NSCLC 的目的。但本研究未進(jìn)一步進(jìn)行機(jī)制驗(yàn)證和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，這也是本研究下一步研究的方向。

綜上所述，本研究采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來(lái)探索肺巖寧方治療NSCLC的藥物成分-靶點(diǎn)-疾病的相互作用。肺巖寧方可能通過(guò)下調(diào)KIT 基因調(diào)控PI3KAKT 信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗癌的作用，這為臨床研究中肺巖寧方治療NSCLC 提供了科學(xué)依據(jù)，也為探索肺巖寧方抗NSCLC的作用機(jī)制提供了新的方向。

（本文圖1，2見(jiàn)插圖8-3，圖3~8見(jiàn)插圖8-4）