基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討二白膏治療慢性濕疹的作用機(jī)制

王羽儂，馮蕙裳，王瑩，王家悅，李元文，張豐川

作者單位：1北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院皮膚科，北京 100029；

2北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院皮膚科，北京 100029；

3北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院皮膚科，北京 100027

慢性濕疹常由急性及亞急性濕疹遷延不愈而成，常表現(xiàn)為患部皮膚肥厚粗糙，呈苔蘚樣變、鱗屑及皸裂，瘙癢程度輕重不一，病情遷延反復(fù)數(shù)月或數(shù)年。多發(fā)于手足、軀干四肢間擦部位及外陰、肛門等處，以四肢多見(jiàn)，常對(duì)稱分布。慢性濕疹病人無(wú)法忍受癥狀反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響其正常生活和工作，無(wú)論生理還是心理都遭受長(zhǎng)期折磨［1］。目前外用藥治療中，糖皮質(zhì)激素藥膏應(yīng)用最為廣泛，但存在長(zhǎng)期應(yīng)用耐藥、激素依賴等問(wèn)題；中醫(yī)外治常采用多種中藥外洗及中成藥軟膏涂抹［2］。慢性濕疹屬于中醫(yī)“濕瘡，血虛風(fēng)燥證”范疇，治療以活血祛風(fēng)，潤(rùn)燥止癢為原則。

二白膏為導(dǎo)師張豐川教授經(jīng)驗(yàn)方，由白及粉、三七粉組成，用時(shí)取適量加凡士林調(diào)和成膏涂抹患處，具有潤(rùn)燥生肌、養(yǎng)血活血、收斂止癢的功效。張教授多年在臨床中用其治療身體各部位慢性濕疹，改善皮膚粗糙肥厚、皸裂及瘙癢療效甚佳，且使用方便易攜帶，病人依從性好。本研究在2019年的臨床研究基礎(chǔ)上，于2022 年1―5 月開(kāi)展網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，從藥物活性成分出發(fā)，多角度、多層次聯(lián)系“藥物-疾病-基因”相互作用靶點(diǎn)及相關(guān)作用通路，探討二白膏多靶點(diǎn)整合調(diào)節(jié)慢性濕疹的作用機(jī)制，進(jìn)而驗(yàn)證其臨床療效。

1 材料與方法

1.1 復(fù)方二白膏活性成分的篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)（TCMSP）搜集白及、三七化學(xué)成分，將類藥性≥0.18 和脂水分配系數(shù)<0.5 作為機(jī)體對(duì)外源化學(xué)物的吸收、分布、代謝和排泄（ab?sorption，distribution，metabolism，and excretion，AD?ME）性質(zhì)參數(shù)以預(yù)測(cè)以上單味藥的有效成分。為避免個(gè)別認(rèn)可度較高的有效成分被篩選掉，故同時(shí)查閱《中國(guó)藥典（2015 版）》與CNKI 中相關(guān)文獻(xiàn)，得到此類成分并合并至TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選結(jié)果。通過(guò)SwissTargerPrediction 網(wǎng)站（http：//www. swisstarget?prediction.ch/）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)［3］。

1.2 慢性濕疹靶點(diǎn)預(yù)測(cè)在人類在線孟德?tīng)栠z傳平臺(tái)（OMIM，https：//www.omim.org/）和人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards，http：//www.genecards.org/）輸入關(guān)鍵詞“chronic eczema”獲取慢性濕疹的靶點(diǎn)。

1.3 成分疾病共有靶點(diǎn)的獲取及蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將二白膏靶點(diǎn)與慢性濕疹靶點(diǎn)通過(guò)Draw Venn Diagrams 網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）取交集，得到成分疾病共有靶點(diǎn)。將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入String網(wǎng)站（https：//string-db.org/）繪制蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（protein-protein in?teraction，PPI），并利用Cytoscape 3.9.1軟件對(duì)蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化處理及拓?fù)涮卣鞣治?，以“?jié)點(diǎn)度中心性”（degree centrality，DC）、“中介中心性”（betweenness centrality，BC）及“接近中心性”（close?ness centrality，CC）3 個(gè)參數(shù)的中位數(shù)作為篩選條件，篩選2次得到成分治療疾病的核心靶點(diǎn)。

1.4 GO 分析和KEGG 富集分析基因本體論GO分析是一種可以通過(guò)生物途徑對(duì)基因進(jìn)行說(shuō)明與注釋的富集分析方法。京都基因與基因組百科全書(shū)通路分析可對(duì)篩選靶標(biāo)參與的通路進(jìn)行富集分析。本研究將成分對(duì)疾病的直接作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DA?VID 網(wǎng)站（https：//david.ncifcrf.gov/），進(jìn)行GO 和KEGG分析。

1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將二白膏藥物、有效成分、靶點(diǎn)及作用通路導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件，建立“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.6 分子對(duì)接分子對(duì)接是通過(guò)受體的特征以及受體和藥物分子之間的相互作用方式來(lái)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)的方法。主要研究分子間（如配體和受體）相互作用，并預(yù)測(cè)其結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法。本研究基于在線CB-Dock 網(wǎng)站（http：//cao.labshare.cn/）進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證［4］；通過(guò)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB（https：//www.rcsb.org/）得到核心靶點(diǎn)的3D 晶體結(jié)構(gòu)，TCMSP 網(wǎng)站得到成分的mol2 結(jié)構(gòu)，同時(shí)將活性成分的mol2結(jié)構(gòu)和靶點(diǎn)的PDB 文件導(dǎo)入CB-Dock網(wǎng)站，進(jìn)行分子對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 二白膏化學(xué)成分篩選與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)搜索二白膏各味藥的化學(xué)成分，白及36 種，三七119 種；根據(jù)其中“類藥性≥0.18 和脂水分配系數(shù)<0.5”條件，選定17 種成分作為活性成分，其中白及9 種，三七8 種，另從藥典及相關(guān)文獻(xiàn)［5-6］驗(yàn)證指標(biāo)性成分。

將活性成分通過(guò)SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，去除重復(fù)項(xiàng)后共得到626 個(gè)成分靶點(diǎn)。

2.2 慢性濕疹靶點(diǎn)以“chronic eczema”為關(guān)鍵詞在OMIM 和GeneGards 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別找到2 342 和2 421個(gè)疾病靶點(diǎn)，篩選、合并去除重復(fù)項(xiàng)后，共得到689種疾病靶點(diǎn)。

2.3 藥物成分與疾病靶點(diǎn)映射結(jié)果及PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過(guò)Draw Venn Diagrams 網(wǎng)站，得到97 個(gè)共有靶點(diǎn)，如圖1所示。

圖1 二白膏靶點(diǎn)和慢性濕疹靶點(diǎn)的韋恩圖

String 網(wǎng)站是一個(gè)功能蛋白關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。將所有靶點(diǎn)導(dǎo)入網(wǎng)站后，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，其中一個(gè)靶點(diǎn)被String網(wǎng)站自動(dòng)刪除，保存為TSV格式后，并利用Cy?toscape 3.9.1 軟件對(duì)蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行拓?fù)涮卣鞣治?，篩選成分治療疾病的核心靶點(diǎn)，如圖2，表1 所示；將構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理，如圖3所示。將15 個(gè)核心靶點(diǎn)排序后，SRC（度值=60）、ESR1（度值=42）、MMP9（度值=44）、AKT1（度值=67）、EGFR（度值=58）是該網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浜Y選過(guò)程

圖3 二白膏中97個(gè)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表1 二白膏治療慢性濕疹的15個(gè)核心靶點(diǎn)信息

2.4 GO 分析及KEGG 富集分析利用DAVID 網(wǎng)站對(duì)97 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析。以FDR<0.05 為篩選條件，得到GO 生物學(xué)條目146 條，主要涉及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)（細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋亡等）、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等方面，根據(jù)FDR 值排序后，排名前10的生物過(guò)程如圖4所示。由此推測(cè)二白膏治療慢性濕疹可能是一個(gè)復(fù)雜的多途徑協(xié)同作用的結(jié)果。

圖4 97個(gè)靶點(diǎn)的GO富集分析

為了進(jìn)一步揭示二白膏治療慢性濕疹的作用機(jī)制，我們對(duì)97 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路分析，根據(jù)FDR<0.05 及慢性濕疹相關(guān)信號(hào)通路篩選出18 條相關(guān)途徑，分析結(jié)果如圖5所示，可以發(fā)現(xiàn)這些基因數(shù)目主要在PI3K-Akt 信號(hào)通（hsa04151）（見(jiàn)圖6）、JAK-STAT 信號(hào)通路（hsa04630）、TNF 信號(hào)通路（hsa04668）、MAPK信號(hào)通路（04010）等相關(guān)通路。

圖5 97個(gè)靶點(diǎn)的KEGG通路分析

圖6 KEGG通路圖（PI3K）

2.5 “藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建為了更好地闡明藥物、成分、靶點(diǎn)和通路之間的關(guān)系，我們使用Cytoscape 3.9.1 構(gòu)建了“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)（圖7A）及靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)（圖7B）。通過(guò)該網(wǎng)絡(luò)，我們可以直觀地展示二白膏治療慢性濕疹的有效物質(zhì)及其可能的作用機(jī)制。

圖7 藥物-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖：A為藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(綠色節(jié)點(diǎn)代表藥物，黃色節(jié)點(diǎn)代表成分，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn))；B為靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖(紅色節(jié)點(diǎn)代表核心靶點(diǎn)，黃色節(jié)點(diǎn)代表核心靶點(diǎn)外的靶點(diǎn)，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表通路)

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證根據(jù)PPI 網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)鋵W(xué)分析，選擇“度”排名前5 的靶點(diǎn)SRC（原癌基因酪氨酸蛋白激酶）、ESR1（雌激素受體α）、MMP-9（基質(zhì)金屬蛋白酶-9）、AKT1（絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶1）、EGFR（表皮生長(zhǎng)因子受體）；通過(guò)構(gòu)建核心靶點(diǎn)-成分網(wǎng)絡(luò)（圖8），選擇對(duì)應(yīng)核心靶點(diǎn)數(shù)最多的前4個(gè)化合物ginsenoside f2（人參皂苷F2）、3-（p-hydroxyben?zyl）-4-methoxy-9，10-dihydrophenanthrene［3-（對(duì)-羥芐基）-4-甲氧基-9，10-二氫菲］、DFV（二羥基黃烷酮）、Diop（鄰苯二甲酸二異辛酯）做進(jìn)一步分析?；谠诰€對(duì)接網(wǎng)站，將5 個(gè)靶蛋白與4 個(gè)活性成分分別進(jìn)行對(duì)接，結(jié)果見(jiàn)表2。表2中受體和配體進(jìn)行分子對(duì)接所得到復(fù)合物的得分越低，代表受體和配體親和力越高。20 種對(duì)接方法均顯示較好的對(duì)接活性，表明二白膏的活性成分可能通過(guò)與SRC、ESR1、MMP9、AKT1、EGFR 等活性靶點(diǎn)作用，發(fā)揮治療慢性濕疹的作用。

圖8 核心靶點(diǎn)-成分網(wǎng)絡(luò)：圖左節(jié)點(diǎn)代表核心靶點(diǎn)，圖右節(jié)點(diǎn)代表成分

表2 二白膏治療慢性濕疹的成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能/（kJ/mol)

3 討論

濕疹屬中醫(yī)“濕瘡”范疇，常反復(fù)發(fā)作，瘙癢劇烈［7］。中醫(yī)認(rèn)為濕邪郁久耗傷氣陰，局部血虛津虧，肌膚失養(yǎng)，故皮膚干燥粗糙、肥厚乃至皸裂。西醫(yī)認(rèn)為本病與免疫、遺傳、過(guò)敏原、皮膚屏障功能障礙等因素有關(guān)，局部治療多采用糖皮質(zhì)激素［8-9］。但局部外用藥物治療存在潛在的不良反應(yīng)，如誘發(fā)感染、皮膚燒灼感、皮膚萎縮、毛細(xì)血管擴(kuò)張等，且易形成激素依賴，停藥后癥狀反復(fù)［10］。

二白膏為張豐川教授治療慢性濕疹局部外用藥多年經(jīng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用療效確切。白及、三七均為植物藥，無(wú)毒性，無(wú)特殊氣味，顏色較淺，對(duì)皮膚美觀無(wú)礙，且?guī)缀鯚o(wú)不良反應(yīng)，方便病人自行調(diào)配及隨身攜帶，病人依從性好。《唐本草》載白及“手足皸拆，嚼以涂之”，言其因味澀收斂，能生肌斂瘡，治療手足皸裂、肛裂等收效甚佳?，F(xiàn)代研究表明其可縮短凝血時(shí)間及抑制纖溶，具有良好的局部止血作用，能形成人工血栓而止血［11］。其根中含白及甘露聚糖，具抗?jié)兓钚裕?2］。體外實(shí)驗(yàn)表明白及對(duì)多種細(xì)菌及真菌有一定抑制作用［13］。還可以通過(guò)提高細(xì)胞外角質(zhì)膠原水平、傷口巨噬細(xì)胞數(shù)量以抵御氧化、幫助皮膚生成皮膚保護(hù)膜［14］，可謂是卓越的藥用輔料，可見(jiàn)治療慢性濕疹大有裨益。三七“能治一切血病”，具有養(yǎng)血止血、補(bǔ)血散瘀、活血定痛的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為三七中主要含有皂苷類、三七素、三七氨酸等成分［15］，具有活血、止血、促造血；抗氧化、促進(jìn)成纖維細(xì)胞和膠原合成、改善皮膚組織結(jié)構(gòu)；抗組胺、增強(qiáng)皮膚免疫力、抗炎等作用［16-17］?？梢?jiàn)二白膏對(duì)過(guò)敏性炎癥性皮膚病有較好的抗過(guò)敏抗炎作用，減輕慢性濕疹。

本研究進(jìn)行了二白膏中有效成分與靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浜Y選、PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析、GO 富集分析和 KEGG 通路分析等。從藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖可以看出，二白膏的關(guān)鍵化合物主要集中在人參皂苷F2、二氫菲類化合物、食脂素、鄰苯二甲酸二異辛酯，其中人參皂苷F2 表現(xiàn)了高強(qiáng)度的活性，主要存在于三七中。多項(xiàng)研究表明，人參皂苷F2作為具有抗氧化應(yīng)激作用的天然產(chǎn)物，可通過(guò)一系列信號(hào)通路發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用［18］，且被證實(shí)具有良好的抗菌、抗炎活性［19］，可通過(guò)增加IL-10和Tregs的表達(dá)，降低IL-17和Th17細(xì)胞的表達(dá)來(lái)減輕炎癥［20］。二氫菲類化合物可有效地抑制炎性因子的產(chǎn)生，有抗病原菌［21］、解痙、抗血小板凝集、抗過(guò)敏等生物活性［22］。三七中的食脂素、鄰苯二甲酸二異辛酯在抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力等方面發(fā)揮了重要的藥理活性［23-24］。從基因蛋白分子層面，二白膏的分子作用靶點(diǎn)中有15個(gè)與慢性濕疹關(guān)的核心靶點(diǎn)，這15 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，可以發(fā)現(xiàn)主要分為細(xì)胞因子和蛋白激酶。細(xì)胞因子中AKT1、SRC、EG?FR、VEGFA、STAT3等體現(xiàn)了高度的協(xié)同作用，也是二白膏治療慢性濕疹發(fā)揮藥理作用的主要作用靶點(diǎn)。AKT1 是核降解的重要因子，參與了濕疹模型中角化不全病理中的角質(zhì)細(xì)胞終末分化和角質(zhì)化包膜形成的關(guān)鍵過(guò)程［25］。SRC 是重要的抗炎因子，有體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)某種中藥成分在NF-κB 信號(hào)通路中通過(guò)作用于SRC 而發(fā)揮抗炎作用［26］。外國(guó)學(xué)者Su 等［27］研究發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性和基因間相互作用，證明EGFR、SRC 和STAT3 作為轉(zhuǎn)錄因子或復(fù)合物發(fā)揮作用，介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄和激活，并與腫瘤生長(zhǎng)、腫瘤血管生成、胚胎植入和抗磷脂綜合征相關(guān)，能通過(guò)調(diào)節(jié)多種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子參與免疫反應(yīng)。故筆者從分子層面猜測(cè)，二白膏通過(guò)抗炎、修復(fù)皮膚組織，調(diào)控皮膚角化來(lái)治療慢性濕疹。從功能作用層面，GO 富集分析得到的條目中，主要涉及增強(qiáng)細(xì)胞增殖及遷移、抑制細(xì)胞凋亡、增加蛋白激酶活性、細(xì)胞表面黏附復(fù)合物、炎癥反應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)等多種生物過(guò)程，可作為二白膏治療慢性濕疹的關(guān)鍵過(guò)程。KEGG 通路富集分析篩選得到18 條信號(hào)通路，基因數(shù)目在P13-Akt 及JAK-STAT 通路上富集較多。其中PI3K-Akt 信號(hào)通路可被多種類型的細(xì)胞刺激或毒性損傷激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞的基本功能，如轉(zhuǎn)錄、翻譯、增殖、生長(zhǎng)和存活。已有大量證據(jù)表明，AKT 一旦被激活，可以通過(guò)磷酸化參與細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)合成、代謝和細(xì)胞周期的底物來(lái)控制關(guān)鍵的細(xì)胞過(guò)程［28］。且AKT1 缺失的小鼠可顯著抑制微血管通透性和白細(xì)胞向炎癥部位的募集，使得過(guò)敏反應(yīng)明顯減輕［29］，與本文中最主要的核心靶點(diǎn)作用機(jī)制相佐證。根據(jù)我們的研究結(jié)果，通過(guò)抑制AKT1 從而降低 PI3K -Akt 信號(hào)通路可能在二白膏活性成分治療慢性濕疹中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。此外，抑制JAKSTAT 信號(hào)通路可降低炎癥，改善細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［30］，且有研究證實(shí)糖皮質(zhì)激素正是通過(guò)抑制本文核心靶點(diǎn)中的IL-2 所誘導(dǎo)的JAK-STAT 通路來(lái)發(fā)揮其強(qiáng)效抗炎作用［31］。可見(jiàn)二白膏的藥理作用與糖皮質(zhì)激素有異曲同工之妙，且使用安全，不具有其可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)二白膏治療慢性濕疹的作用機(jī)制進(jìn)行了探究，證明為多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用的結(jié)果，可以推測(cè)二白膏通過(guò)抗炎、抗氧化、調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡、修復(fù)皮膚屏障等作用來(lái)治療慢性濕疹，臨床應(yīng)用前景廣闊。

（本文圖1~6見(jiàn)插圖8-2，圖7，8見(jiàn)插圖8-3）