小動(dòng)物麻醉機(jī)在大鼠應(yīng)激性胃潰瘍實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

［摘要］目的探討小動(dòng)物麻醉機(jī)對(duì)大鼠應(yīng)激性胃潰瘍模型制備的影響。方法使用小動(dòng)物麻醉機(jī)并采用異氟烷替代乙醚進(jìn)行吸入性麻醉；同時(shí)，在保留原有應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中潰瘍指數(shù)觀察的指標(biāo)基礎(chǔ)上，將模型組分為造模后1 h、2 h組，采用腹主動(dòng)脈取血替代下腔靜脈取血，并用ELISA法測(cè)定血清中去甲腎上腺素（NE）和皮質(zhì)酮（CORT）含量，比較各組大鼠胃組織潰瘍情況。結(jié)果與空白對(duì)照組比較，模型組造模后1 h、2 h組大鼠的潰瘍指數(shù)明顯升高（Plt;0.01）；模型組造模后2 h組大鼠的NE和CORT含量明顯升高（Plt;0.01）。與模型組造模后1 h組相比，造模后2 h組大鼠的潰瘍指數(shù)、NE和CORT含量均有不同程度明顯升高（Plt;0.05，Plt;0.01）。結(jié)論借助小動(dòng)物麻醉機(jī)，通過(guò)倒置法和冷貯法成功制備了大鼠應(yīng)激性胃潰瘍模型。改進(jìn)后的麻醉方法符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的“3R”原則，避免乙醚帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)室安全隱患，麻醉效果好。

［關(guān)鍵詞］應(yīng)激性胃潰瘍；實(shí)驗(yàn)技術(shù)；實(shí)驗(yàn)教學(xué)

doi：10.3969/j.issn.1674-7593.2023.03.029

Application of Small Animal Anesthesia Machine in Stress Gastric Ulcer Experiment in Rats

Wang Qiujing1，Kang Jinsong2，Zhang Dawei1，Sun Minying1，Li Tianshu1**

1Functional Experiment Center，College of Basic Medical Sciences，Jilin University，Changchun130021；2Department of Pathophysiology，Collegeof Basic Medical Sciences，Jilin University，Changchun130021

**Corresponding author：Li Tianshu，email：lits@jlu.edu.cn

［Abstract］ObjectiveTo explore the effect of small animal anesthesia machine on the establishment of stress gastric ulcer model in rats.MethodsSmall animal anesthesia machine was used during the establishment of stress gastric ulcer model with isoflurane anesthesia instead of ether inhalation.Blood was taken from abdominal aorta instead of inferior vena cava at 1 and 2 hours after modeling.The serum norepinephrine（NE） and corticosterone（CORT） levels were determined by ELISA.The ulcer was examined and ulcer index was calculated.ResultsCompared with the blank control group，the ulcer index in the model group was significantly increased at 1 and 2 hours after modeling（Plt;0.01），and the levels of NE and CORT in the model group increased significantly at 2 hours after modeling（Plt;0.01）.The ulcer index，NE and CORT levels in the rats at 2 hours after modeling were higher than those at 1 hour after modeling（Plt;0.05，Plt;0.01）.ConclusionWith the help of small animal anesthesia machine，the stress gastric ulcer model in rats is successfully established by inversion and cold storage method.The improved anesthesia method conforms to the “3R” principle of animal experiment，avoids the potential safety hazards caused by ether，and has good anesthetic effect.

［Key words］Stress gastric ulcer；Experimental technology；Experimental teaching

大鼠應(yīng)激性胃潰瘍實(shí)驗(yàn)是機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，學(xué)生從實(shí)驗(yàn)中可詳細(xì)觀察到機(jī)體從正常生理狀態(tài)到有應(yīng)激性胃潰瘍的病理變化的整個(gè)過(guò)程，是臨床專業(yè)醫(yī)學(xué)生需要重點(diǎn)掌握的內(nèi)容。大鼠應(yīng)激性胃潰瘍實(shí)驗(yàn)的原實(shí)驗(yàn)方案中，模型組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠實(shí)驗(yàn)前需要禁食24 h，建立應(yīng)激性胃潰瘍動(dòng)物模型時(shí)大鼠由于饑餓變得煩躁不安難以捕捉甚至攻擊人，為了確保學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中不被饑餓的大鼠抓咬，復(fù)制動(dòng)物模型前需要采用麻醉，然后再進(jìn)行大鼠固定。由于需要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中保持清醒狀態(tài)，胃腸蠕動(dòng)不受干擾，胃酸正常分泌。而戊巴比妥鈉和水合氯醛等麻醉藥物麻醉時(shí)間長(zhǎng)，容易影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胃腸正常工作。乙醚麻醉時(shí)間短，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清醒快，起到了保護(hù)學(xué)生的作用，又不影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。

但是傳統(tǒng)乙醚麻醉方法存在一些弊端：①乙醚因在使用時(shí)無(wú)法隨時(shí)改變或控制其濃度，不適用于麻醉誘導(dǎo)，濃度過(guò)大和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，動(dòng)物極其容易死亡；②乙醚具有強(qiáng)烈的刺激性氣味，會(huì)強(qiáng)烈刺激呼吸道，促進(jìn)黏液分泌增加，從而有堵塞呼吸道的危險(xiǎn)，且在麻醉初期常出現(xiàn)興奮加強(qiáng)現(xiàn)象，故在麻醉時(shí)需要隨時(shí)有人看管，否則動(dòng)物容易死亡，而且對(duì)師生身體健康有影響；③乙醚易燃、易揮發(fā)，有發(fā)生火災(zāi)和爆炸的危險(xiǎn)，存在實(shí)驗(yàn)室安全隱患。另外，乙醚屬于危險(xiǎn)和易制毒化學(xué)品，根據(jù)國(guó)家《危險(xiǎn)化學(xué)品安全管理?xiàng)l例》《易制毒化學(xué)品管理?xiàng)l例》受公安部門(mén)嚴(yán)格管制，不易購(gòu)買。

實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有小動(dòng)物麻醉機(jī)操作方便，可以控制麻醉深度，確保麻醉動(dòng)物的安全。小動(dòng)物麻醉機(jī)采用單呼吸管路，無(wú)再循環(huán)呼吸系統(tǒng)，減少小動(dòng)物呼吸阻力，適合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物短暫麻醉。而且麻醉機(jī)氣密性線路設(shè)計(jì)減少了麻醉氣體異氟烷的消耗，確保了實(shí)驗(yàn)環(huán)境，解決了乙醚所帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)室安全隱患問(wèn)題，使用小動(dòng)物麻醉機(jī)確保了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)安全，利于實(shí)驗(yàn)教學(xué)發(fā)展。

1對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥品和儀器

雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量500 ～550 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)［SCXK（吉）2018-0007］），動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心開(kāi)展，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)［SYXK（吉） 2018-0001］。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和處理嚴(yán)格遵循動(dòng)物福利3Ｒ原則和吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)相關(guān)條例（福利倫理審查編號(hào)：2019年研審第60號(hào)）。

異氟烷由山東安特牧業(yè)科技有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：20201202）；氨基甲酸乙酯由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：T20080319）；去甲腎上腺素（NE）和皮質(zhì)酮（CORT）測(cè)定ELISA試劑盒購(gòu)于上海扶生實(shí)業(yè)有限公司（貨號(hào)A107688、A10765）。R520IP小動(dòng)物呼吸麻醉機(jī)（深圳瑞沃德生命科技有限公司生產(chǎn)）。

1.2應(yīng)激實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉固定

使用小動(dòng)物麻醉機(jī)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉和固定，小動(dòng)物麻醉機(jī)配備的不銹鋼支架可以將揮發(fā)罐、麻醉誘導(dǎo)箱、空氣泵、廢氣吸附罐等主要部件集中；麻醉劑無(wú)須注射，麻醉濃度可調(diào)節(jié)，同時(shí)配備專業(yè)的廢氣吸附系統(tǒng)，廢氣吸附罐配備風(fēng)扇和稱重器，記錄其使用情況；可同時(shí)對(duì)多只動(dòng)物進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，并有5個(gè)通道，同時(shí)維持實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的麻醉狀態(tài)；麻醉罐有精確的麻醉藥濃度調(diào)節(jié)刻度，流量計(jì)可控制整體氣體流量及誘導(dǎo)箱流量，控制麻醉深度。需注意：確?？諝獗门c麻醉機(jī)緊密相連；誘導(dǎo)麻醉完成后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器刻度盤(pán)，調(diào)節(jié)合適地維持麻醉濃度。

1.3模型制備

將48只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照1 h、2 h組、倒置法應(yīng)激胃潰瘍模型1 h、2 h組、冷貯法應(yīng)激胃潰瘍模型1 h、2 h組，共6組，每組8只。空白對(duì)照組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前正常喂食，自由飲水；模型組動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前24 h禁食，自由飲水。模型制備：倒置法應(yīng)激胃潰瘍模型1 h、2 h組，分別將大鼠頭向下倒置1 h和2 h ；冷貯法應(yīng)激胃潰瘍模型1 h、2 h組，分別將大鼠平放置于4℃冰箱冷藏層1 h和2 h。

1.4觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

空白對(duì)照組和造模后大鼠用20% 氨基甲酸乙酯（0.5 mL/100 g）麻醉后，ELISA法檢測(cè)大鼠血清去甲腎上腺素（NE）和皮質(zhì)酮（CORT）含量：腹主動(dòng)脈取血5 mL，3 000 r/min，4℃離心10 min，取血清至-80℃冰箱保存。血清NE和CORT含量的測(cè)定嚴(yán)格遵照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將大鼠胃經(jīng)過(guò)10%甲醛溶液固定后，沿胃大彎剖開(kāi)平展于玻璃板上，用放大鏡觀察潰瘍的大小及數(shù)目，潰瘍的嚴(yán)重程度用潰瘍指數(shù)來(lái)判定。參照Guth標(biāo)準(zhǔn)［1］計(jì)算潰瘍指數(shù)，損傷（包括糜爛點(diǎn)）≤1 mm ，計(jì)1 分;1 mm＜損傷≤2 mm，計(jì)2分;2 mm＜損傷≤3 mm，計(jì)3分;3 mm＜損傷≤4 mm，計(jì)4分;損傷＞4 mm，計(jì)5分;損傷寬度＞1 mm 者，計(jì)算分值按寬度數(shù)加倍，將積分相加即為該動(dòng)物的潰瘍指數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，任意兩組比較采用SNK-q檢驗(yàn)，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組大鼠胃組織潰瘍情況比較

如圖1所示，空白對(duì)照組大鼠胃組織無(wú)明顯的潰瘍或出血情況，而模型組大鼠胃組織有大量的出血和潰瘍病灶。冷貯模型2 h組和冷貯模型1 h組大鼠胃黏膜均可見(jiàn)數(shù)個(gè)潰瘍，冷貯模型2 h組大鼠潰瘍數(shù)目比冷貯模型1 h組多，冷貯模型2 h、1 h組與空白對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）；倒置模型2 h組大鼠胃黏膜亦可見(jiàn)潰瘍，但數(shù)量、潰瘍面積均較冷貯模型2 h組少，倒置模型1 h組大鼠胃黏膜表面光滑，輕度出血、水腫，有少量潰瘍，與空白對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）。模型組2 h與1 h潰瘍指數(shù)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01），見(jiàn)表1。

2.2大鼠血清NE和CORT含量比較

如表1所示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠冷貯、倒置2 h的NE和CORT的含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）；倒置模型2 h組的NE含量比倒置組1 h明顯升高（Plt;0.05），冷貯模型組、倒置模型2h組的CORT含量均顯著高于冷貯模型組、倒置模型1 h組（Plt;0.01）。

3討論

本項(xiàng)目通過(guò)改進(jìn)大鼠應(yīng)激性胃潰瘍實(shí)驗(yàn)教學(xué)技術(shù)方法，使用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的小動(dòng)物麻醉機(jī)，采用異氟烷麻醉劑替代傳統(tǒng)乙醚吸入性麻醉固定，此麻醉方法能減少動(dòng)物疼痛和保證手術(shù)或其他實(shí)驗(yàn)操作順利進(jìn)行，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)“3R”原則［2］。異氟烷與乙醚比較其優(yōu)點(diǎn)是：不易燃燒，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，更安全，誘導(dǎo)、恢復(fù)和麻醉快速，縮短實(shí)驗(yàn)所用時(shí)間，吸入后80% 以上以原形隨呼氣排出，體內(nèi)代謝少，異氟烷麻醉能維持動(dòng)物的心率、血氧分壓、血液pH值等生理功能處于穩(wěn)定狀態(tài)，且價(jià)格適宜，是目前廣泛使用的吸入麻醉藥［3-4］。通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)異氟烷麻醉劑進(jìn)行了摸索，麻醉效果好，對(duì)模型本身和檢測(cè)指標(biāo)無(wú)影響，可達(dá)到實(shí)驗(yàn)預(yù)期目的，解決了乙醚易燃易爆所帶來(lái)的安全隱患問(wèn)題，匹配教學(xué)需要。小動(dòng)物麻醉機(jī)專業(yè)的氣密性呼吸線路設(shè)計(jì)，保證了麻醉氣體的穩(wěn)定，減少麻醉氣體的消耗，保證了干凈的呼吸空間和實(shí)驗(yàn)環(huán)境，確保了同學(xué)們的實(shí)驗(yàn)安全，有利于實(shí)驗(yàn)教學(xué)發(fā)展；儀器操作使用比較簡(jiǎn)單、容易，同學(xué)們也能很快掌握此方法。

模型組大體標(biāo)本觀察胃組織有大量的出血和潰瘍病灶，胃黏膜呈明顯充血、水腫，可見(jiàn)大量紅細(xì)胞滲出并形成血痂，血痂與胃黏膜結(jié)合牢固，難以分離，用放大鏡能觀察到潰瘍的大小及數(shù)目等變化，說(shuō)明形態(tài)學(xué)上符合應(yīng)激性潰瘍的特點(diǎn)。應(yīng)激時(shí)可激活藍(lán)斑-交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)（Locus coeruleus sympathetic adrenal medullary，LSAM）和下丘腦-垂體-腎上腺系統(tǒng)（Hypothalamic pituitary adrena，HPA）［5］。由于交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)的強(qiáng)烈興奮，兒茶酚胺分泌增多，尤其藍(lán)斑核產(chǎn)生的NE對(duì)腦的大多數(shù)部位具有興奮作用，從而加強(qiáng)覺(jué)醒狀態(tài)，使腦的神經(jīng)元對(duì)未來(lái)的刺激及時(shí)響應(yīng)［6］。此外，HPA在促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（Corticotropin releasing hormone，CRH）的作用下，促腎上腺皮質(zhì)激素（Adreno corticotropic hormone，ACTH ）、腎上腺糖皮質(zhì)激素（ Glucoco ticoid，GC）水平升高，引起胃酸、胃蛋白酶分泌增加，使胃黏膜發(fā)生糜爛，引發(fā)應(yīng)激性胃潰瘍。GC在嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)主要為CORT［7］。本研究在造模后檢測(cè)了血清中NE和CORT水平［8-9］，發(fā)現(xiàn)血清中NE和CORT含量變化，能反映應(yīng)激刺激反應(yīng)強(qiáng)度的大小及應(yīng)激后相應(yīng)地快速分泌出濃度不同的各種應(yīng)激激素。由于交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)的強(qiáng)烈興奮，NE等兒茶酚胺分泌增多，血液發(fā)生重分布而使胃腸黏膜血管發(fā)生痙攣性收縮，組織灌流量驟減，黏膜局部發(fā)生缺血性壞死，促使應(yīng)激性潰瘍的形成。此外，CORT分泌增加，使胃腸黏膜上皮細(xì)胞再生和修復(fù)能力降低，促使應(yīng)激性潰瘍的形成加重，尤其對(duì)老年大鼠效果顯著。此變化也與應(yīng)激的特點(diǎn)相符。學(xué)生不僅可以利用此模型認(rèn)識(shí)應(yīng)激性潰瘍的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，還可以通過(guò)NE和GC等臨床激素檢測(cè)指標(biāo)為切入點(diǎn)，探討LSAM和HPA的調(diào)節(jié)作用時(shí)期，對(duì)于學(xué)生深入理解全身適應(yīng)綜合征（Systemic adaptation syndrome，GAS）的三個(gè)時(shí)期具有十分重要的臨床意義［10］。實(shí)現(xiàn)臨床實(shí)踐技術(shù)與機(jī)能實(shí)驗(yàn)有機(jī)融合，從而提高學(xué)生綜合分析問(wèn)題能力和臨床實(shí)踐能力［11-12］。

綜上所述，本研究利用小動(dòng)物麻醉機(jī)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉和固定，利用倒置法和冷貯法成功制備了大鼠應(yīng)激性胃潰瘍模型，避免了乙醚的缺點(diǎn)，取得了滿意的實(shí)驗(yàn)效果。此模型不僅可以用于觀察應(yīng)激性潰瘍的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，還可用于應(yīng)激性潰瘍的發(fā)病機(jī)制探討及治療等方面的研究。不僅適合本科生實(shí)驗(yàn)教學(xué)，還可用于相關(guān)的科研工作中，值得推廣應(yīng)用。

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（2022-07-12收稿）