藜麥4,5-多巴雙氧化酶基因(CqDODA)家族的全基因組鑒定與分析

丁洪霞,楊 博,陳方軍,彭 悅,郭善利,陳世華

(煙臺大學生命科學學院,山東 煙臺 264006)

甜菜素主要存在于真菌(擔子菌:鵝膏菌[1])、細菌(重氮營養(yǎng)葡萄糖酸桿菌[2])、水生植物(藍藻[3-4])、開花植物(石竹目:莧菜、鸚鵡花[5]、大花馬齒莧[1])等物種中。甜菜素具有清除自由基的能力和一定的抗氧化活性,可被用作食品著色劑,并對幾種類型的癌癥有預防能力[6-7]。甜菜素是一類由酪氨酸衍生而來的植物色素,甜菜醛氨酸是甜菜素合成的重要中間產(chǎn)物,也是甜菜素最常見的發(fā)色基團。DODA(3,4-dihydroxyphenylalanine 4,5-dioxygenase)基因編碼的4,5-多巴雙氧化酶是甜菜素生物合成的關鍵酶之一[8],它打開酪氨酸的氧化產(chǎn)物左旋多巴(L-DOPA)C-4和C-5之間的二羥基苯丙氨酸環(huán),生成不穩(wěn)定的Seco-DOPA,然后自發(fā)形成甜菜醛氨酸[9]。DODA屬于LigB基因家族成員,在石竹目中LigB基因復制產(chǎn)生了DODAα和DODAβ兩個分支,其中DODAα分支中的基因具有編碼該酶的功能[2,10],研究認為DODAβ可以編碼打開左旋多巴的C-2和C-3位產(chǎn)生麝香黃素的酶[3]。DODA基因的同源基因在非合成甜菜素的植物中是已知的,如擬南芥(AtLigB)和水稻(AK104601)等,雖然是DODA基因的同源基因,但是它們編碼的酶不具有催化合成甜菜醛氨酸的功能[11]。

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)是莧科藜屬的一年生雙子葉自花授粉的草本植物,屬于偽谷類作物。藜麥起源于南美洲安第斯地區(qū),但能適應世界多地的生態(tài)環(huán)境,具有較好的耐鹽堿、耐干旱及耐低溫特性和極大的農(nóng)藝栽培價值和潛力[12]。藜麥被認為是可以提高世界糧食安全的重要作物,全株可食用,具有豐富的營養(yǎng)成分,有色藜麥種子中含有高抗氧化能力的酚類和甜菜素[13-14]。已有研究表明利用有色藜麥品種建立藜麥愈傷組織培養(yǎng)體系,可以獲得具有產(chǎn)生甜菜素能力的藜麥細胞[15]。藜麥中分離和鑒定了CqDODA酶,基于多巴胺的色素生物合成途徑的所有中間化合物和產(chǎn)物都已明確[16]。目前國內(nèi)外對藜麥DODA(CqDODA)基因的研究較少,且對該基因家族尚無深入系統(tǒng)分析及研究。

2017年藜麥高質(zhì)量基因組的組裝[17],為藜麥基因組學研究及藜麥的遺傳、進化及基因功能研究奠定了重要的遺傳基礎。為了進一步了解CqDODA基因在藜麥中的作用,基于藜麥全基因組序列,本研究利用生物信息學的方法鑒定了CqDODA基因家族的全部成員,分析了蛋白理化性質(zhì),保守結構域、啟動子順式作用元件、表達模式、系統(tǒng)發(fā)育關系、自身共線性及其與祖先種共線性等,為深入研究CqDODA基因的功能和藜麥甜菜素的研究提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 CqDODA基因的鑒定與蛋白理化性質(zhì)及蛋白一、二級結構預測

藜麥基因組數(shù)據(jù)來源于NCBI藜麥數(shù)據(jù)庫,在NCBI上分別下載莧菜(AcDODA1)、擬南芥(AtLigB)、甜菜(BvDODA1)等16個物種的蛋白序列。用TBTools軟件將不同物種的DODA蛋白序列分別對比藜麥蛋白數(shù)據(jù)庫,選出質(zhì)量較高(E-value<1×10-20)的CqDODAs候選基因。用NCBI CDD (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)工具(Expect Value為 0.01)驗證候選基因是否含有4,5-DOPA-Dioxygenase(PSSMID 153375)結構域,最終篩選出18個CqDODA基因。使用ExPASy 在線網(wǎng)站提供的Protparam工具(https://web.expasy.org/protparam/)對CqDODA基因家族成員編碼蛋白的氨基酸序列進行一級結構和二級結構特性分析,得到DODA蛋白的氨基酸長度、分子量、等電點等理化性質(zhì)。Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#)和CELLO(http://cello.life.nctu.edu.tw/)用于預測亞細胞定位。

1.2 CqDODA基因結構與蛋白保守基序分析

根據(jù)獲得的18個CqDODA基因家族成員,提取它們的基因組DNA序列和CDS序列,使用GSDS 2.0在線網(wǎng)站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)對CqDODA基因結構進行作圖分析;使用MEME5.1在線網(wǎng)站(http://meme-suite.org/tools/meme)對CqDODA蛋白序列進行蛋白保守基序(Motif)搜索,可被搜索的Motif數(shù)量設置為10。

1.3 蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

從NCBI上下載藜麥及不同物種的DODA蛋白序列。CluastW程序用于多個DODA蛋白序列比對。利用MEGA7.0軟件,采用鄰接法和1000次Bootstrap重復構建藜麥與不同物種的蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹。用同樣的方法構建了CqDODAs自身的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 CqDODA基因重復序列分析

使用MCScanX對C.quinoa、C.pallidicaule和C.suecicum進行全基因組共線性分析,從共線性結果文件中篩選出CqDODA共線性基因對以及藜麥與C.pallidicaule和C.suecicum之間的共線性基因對,并用TBtools軟件繪圖。使用TBtools軟件計算藜麥自身CqDODA共線性基因對的Ka/Ks值(非同義替換率/同義替換率)。

1.5 CqDODA基因表達模式分析

在NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫中下載藜麥各組織器官和幾個品種的RNA-Seq數(shù)據(jù)(SRP226463、SRP116149),以RNA-Seq為基礎進行l(wèi)og2轉換計算TPM(每百萬次讀取的轉錄本),分別找到CqDODA基因家族所有成員的TPM值,使用TBtools軟件繪制CqDODA基因家族的組織表達熱圖。

1.6 啟動子區(qū)順式作用元件預測

從藜麥基因組數(shù)據(jù)庫中獲得了CqDODAs轉錄起始點上游3000個堿基,作為相關基因的啟動子序列。這些序列用PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測分析順式作用元件,并用GSDS2.0作可視化分析。

2 結果與分析

2.1 CqDODA全基因組的鑒定

根據(jù)DODA蛋白的保守結構域,通過對比藜麥數(shù)據(jù)庫和保守結構域數(shù)據(jù)庫,在藜麥中鑒定出18個含4,5-多巴雙氧化酶結構域的CqDODA蛋白。根據(jù)其基因在染色體上的位置(表1),分別命名為CqDODA1至CqDODA18。藜麥一共18對染色體,這18個CqDODA分布在3、4、5、12號染色體上,其中12個基因在5號和12號染色體上。

表1 CqDODA基因信息

表1(續(xù))

2.2 CqDODA蛋白理化性質(zhì)及一、二級結構預測

18個CqDODA蛋白的理化性質(zhì)和一、二級結構特征如表2所示。CqDODA的長度在178～865個氨基酸殘基之間,分子質(zhì)量為19.72～99.46 kU,其中最小分子質(zhì)量的是CqDOPA9,最大分子質(zhì)量的是CqDOPA18;理論的等電點為5.27～8.02,大部分CqDODA蛋白呈酸性,其中CqDODA9和CqDODA17等電點大于7,為堿性蛋白;CqDODA蛋白中有9個蛋白不穩(wěn)定指數(shù)大于40,是不穩(wěn)定蛋白;蛋白親水性大于-0.5屬于親水蛋白,CqDODA6是疏水蛋白,其余均為親水蛋白;蛋白的二級結構中α-螺旋和無規(guī)卷曲結構較多。

基于CqDODA蛋白的亞細胞定位預測結果如表2所示,這些CqDODA蛋白具有葉綠體、線粒體、細胞壁、細胞質(zhì)和細胞核等多個亞細胞定位特征,CqDODA2、3、5、10、15、16等6個CqDODA蛋白存在細胞壁和細胞質(zhì)定位特征,CqDODA1、6、7、9、12、13、14、16、17等9個CqDODA蛋白具有葉綠體定位特征,多個CqDODA蛋白都有兩個以上的亞細胞定位特征。

表2 CqDODA蛋白理化性質(zhì)及一、二級結構預測以及亞細胞定位

2.3 CqDODA基因結構和蛋白保守基序(Motif)分析

如圖1所示,CqDODA基因內(nèi)含子數(shù)目在2～15個之間,外顯子數(shù)目在2～16個之間,大部分CqDODA含有3 個外顯子,除了CqDODA18外均含有1～3個內(nèi)含子,分支2和分支3的基因結構差異較大,CqDODA基因在分支1中相似度高。蛋白保守基序如圖2,CqDODA蛋白含有4～9個蛋白保守基序,Motif-1、2、5這樣的結構存在于所有CqDODA成員中;CqDODA12和CqDODA13缺少Motif-8,CqDODA9缺少Motif-3,CqDODA18和CqDODA7的Motif-8被Motif-10取代,CqDODAs的蛋白基序組織高度保守。CqDODA基因家族雖然部分基因結構差異較大,但是在CqDODA蛋白在進化中卻相對保守。

圖1 CqDODAs系統(tǒng)發(fā)育關系和基因結構

圖2 CqDODA 蛋白Motif結構

2.4 蛋白系統(tǒng)發(fā)育進化分析

DODA蛋白的系統(tǒng)發(fā)育和結構分析來自包括藜麥在內(nèi)的15個不同物種,聚為A、B、C、D四個分支(圖3),分別包含2個、6個、6個和4個CqDODA蛋白。圖3中分支A和B對應圖2中的分支1,分支C對應圖2中的分支3,分支D對應圖2中的分支2。分支B中CqDODA7、8、9、16、17、18與毯粟草MvDODA親緣較近;分支D中CqDODA11、14、12、13與甜菜BvDODA2b、菠菜SoDODA5親緣關系較近;CqDODA10、15與菠菜SoDODA4、鹽地堿蓬SsDODA2是同一支進化而來;擬南芥、水稻和小麥等屬于分支B與分支B中的CqDODAs為同一祖先進化而來。結合表2蛋白亞細胞定位預測可以發(fā)現(xiàn),分支A定位于細胞質(zhì)、細胞壁、線粒體;分支B定位于細胞壁、葉綠體、線粒體、細胞質(zhì)、細胞核;分支C定位于葉綠體、線粒體、細胞質(zhì)、細胞壁;分支D定位于細胞膜、細胞壁、葉綠體、細胞質(zhì)、高爾基體、核中。

圖3 CqDODA蛋白系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.5 基因共線性分析

藜麥和兩個二倍體祖先種的共線性分析如圖4,CqDODA7、CqDODA18可能起源于C.pallidicaule,CqDODA1、2、5、13可能起源于C.suecicum。CqDODA基因自身共線性如圖5,在該基因家族中總共發(fā)現(xiàn)了3個基因復制事件,分別是CqDODA10和CqDODA13、CqDODA7和CqDODA16、CqDODA1和CqDODA5。CqDODA基因家族的擴大主要歸因于節(jié)段性復制事件。計算所有重復的CqDODA共線基因對的Ka/Ks值如表3,發(fā)現(xiàn)3對基因對均Ka?Ks,Ka/Ks值?1,這3對基因在進化過程中受純化選擇,非同義替換率Ka小于同義替換率Ks[18]。

圖4 C. quinoa與C. pallidicaule、C. suecicum的全基因組共線性

表3 共線CqDODA基因的Ka/Ks

2.6 CqDODA基因表達模式和順式作用元件分析

為了進一步分析CqDODA基因在藜麥甜菜素合成中的作用,本研究基于正常生長中的藜麥不同組織的RNA-seq數(shù)據(jù),分析了CqDODA基因家族中各成員表達模式(如圖6)。結果表明,CqDODAs表達模式差異較大,CqDODA2、15、10、16、18幾乎在全藜麥的所有組織中均表達,分支2的CqDODA1、14、11、13、12和分支3的CqDODA17、8幾乎不表達或者表達量很低,基因表達的時間和空間特異性不明顯。CqDODA4在花和未成熟的種子中存在高表達,CqDODA16在莖和正在發(fā)育的種子中存在高表達。在進化親緣關系較近的成對基因中,CqDODA1和CqDODA2、CqDODA3和CqDODA6、CqDODA9和CqDODA16、CqDODA18和CqDODA7表達差異非常大。對這些成對基因的順式作用元件(圖7)進一步分析可以發(fā)現(xiàn),表達量高的CqDODA基因家族成員的順式作用元件種類和數(shù)量均多于表達量低的成員,在親緣較近的成對基因中表達量低的一方缺少如玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)元件、干旱誘導性元件、在分生組織表達元件、在胚乳表達元件等。

圖5 CqDODA基因家族自身共線性分析

對CqDODA基因家族上游3000 bp啟動子區(qū)域順式作用元件分析如圖7所示,CqDODA基因家族存在基本的啟動子元件如CAAT-box、TATA-box等,每個基因都有脫落酸反應元件(ABRE)厭氧誘導(ARE)和大量的光響應元件(TCT-Motif、G-Box、Box4、GT1-Motif、AE-Box等);CqDODA16含根特異性調(diào)控元件,CqDODA1、11、14含柵欄葉肉細胞分化元件,CqDODA10、12、13含創(chuàng)傷反應元件;在啟動子序列中還鑒定了一些激素調(diào)控的元件如脫落酸、生長素、赤霉素、水楊酸、茉莉酸甲酯等,還有一些環(huán)境誘導的調(diào)節(jié)元件如低溫響應、光響應、缺氧反應元件等。

圖6 CqDODA基因在不同組織的表達模式

圖7 CqDODA基因上游3000 bp啟動子區(qū)域順式作用元件

3 討 論

DODA酶在甜菜素合成中有重要的作用,甜菜素與植物的顏色和抗逆性等多方面有密切聯(lián)系。本研究基于藜麥基因組數(shù)據(jù),首次對CqDODA全基因家族進行系統(tǒng)研究。共確定了18個CqDODA基因,根據(jù)基因在染色體上的位置進行了命名,18個CqDODA基因集中分布在3、4、5、12號染色體上(表1)。CqDODA蛋白的一級和二級結構以及亞細胞定位的分析預測(表2)表明,CqDODA蛋白性質(zhì)接近,多為酸性蛋白且親水;這些蛋白理化性質(zhì)可以預測特異性位置以及CqDODA之間的底物選擇性。

基于多物種DODA蛋白進化分析,CqDODAs可以分為四支(圖3),并與菠菜、鹽地堿蓬、甜菜毯粟草、莧菜來源的DODAs具有較高的相似性和親緣關系最近。擬南芥AtLigB、豬籠草NaDODA等屬于分支B,其基因屬于DODAα分支,擬南芥和豬籠草等植物是產(chǎn)生花青素類色素的植物[19],不能產(chǎn)生甜菜素;AtLigB不具有打開C-4、C-5位二羥基苯丙氨酸環(huán)的功能,而是催化C-2、C-3位二羥基苯丙氨酸環(huán)生成麝香黃素[6]。CqDODAs與AtLigB、NaDODA均屬于分支B,三者的編碼基因屬同一支祖先基因進化而來,推測也屬于DODAα分支中[2];這一支中只有CqDODA8、CqDODA9和CqDODA16基因在藜麥不同組織中有表達,因此推測CqDODA7、18、9、16、8、17這6個基因與AtLigB一樣不具有編碼4,5-多巴雙氧化酶的功能,且CqDODA8、9、16在藜麥中表達了并產(chǎn)生了其他物質(zhì)。圖1中分支2的基因在正常生長的藜麥各組織中表達量極低,幾乎不表達(圖6),分支3也推測出不具有編碼4,5-多巴雙氧化酶的功能,因此推測出分支1中的8個CqDODA基因在藜麥甜菜素合成中具有重要的作用[17]。根據(jù)CqDODA基因結構和蛋白保守基序分析,可知分支1中的CqDODA基因所編碼的蛋白具有保守性,其中Motif-3、1、8、5、2、6高度保守(圖2);在分支1中僅有CqDODA15和CqDODA6基因所編碼的為穩(wěn)定蛋白,在熱圖上這兩個基因的表達量比同支的CqDODA10和CqDODA2等編碼不穩(wěn)定蛋白的基因表達量低,所以推測藜麥中的CqDODA在需要合成甜菜素時才表達產(chǎn)生 CqDODA蛋白,蛋白發(fā)揮活性以后CqDODA蛋白就立刻分解或者結合其他物質(zhì),最后失去酶的活性[20]。

CqDODA18和CqDODA7可能起源于C.pallidicaule,CqDODA1、2、5、13可能起源于C.suecicum,CqDODA1、2、5在進化過程中仍維持較近的親緣關系。啟動子區(qū)域的順式作用元件可以預測出CqDODAs基因上游含有豐富的激素響應和逆境脅迫響應元件(圖7),暗示CqDODAs基因在受到低溫、缺氧、創(chuàng)傷或激素處理時可能會發(fā)揮一定的作用[21]。一些親緣關系較近的成對基因中(CqDODA1/CqDODA2、CqDODA16/CqDODA9、CqDODA18/CqDODA7)出現(xiàn)表達量差異很大的情況,可能是由于表達量高的一方較表達量低的一方擁有更多的上游調(diào)控元件,從而造成了這一現(xiàn)象[22]。本研究通過生物信息學的方法系統(tǒng)研究分析CqDODA基因家族成員在藜麥中的功能,特別是對甜菜堿色素合成中的作用,為深入探究CgDODA基因家族提供理論支持。