慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平與牙周臨床指標(biāo)和炎性因子的相關(guān)性研究*

張 婧,汪 靜

陜西省寶雞市中心醫(yī)院口腔科,陜西寶雞 721000

慢性牙周炎是指微生物在牙周長(zhǎng)期定植、繁殖,并向牙周深部組織擴(kuò)散引起的牙齒支持組織慢性炎癥,該病是臨床常見的慢性口腔炎癥性疾病[1]。研究表明,慢性牙周炎可以引起口腔異味、牙齦腫痛、牙齦出血等癥狀,如未給予及時(shí)有效的治療,炎癥往牙周深部組織進(jìn)展,引起牙齦退縮、牙周膿腫,甚至牙齒脫落[2]。目前臨床上對(duì)于慢性牙周炎主張?jiān)缙谠\斷并給予及時(shí)治療,尋找慢性牙周炎病情評(píng)估的指標(biāo)對(duì)于指導(dǎo)臨床治療具有重要的價(jià)值。齦溝液是由牙齦結(jié)締組織分泌的一種液體,其成分可以反映牙周炎癥反應(yīng)情況[3]。乳鐵蛋白(LF)是由中性粒細(xì)胞脫顆粒過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白,具有抗菌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫功能等作用,其水平還可以反映炎癥反應(yīng)情況[4]。音猬因子(Shh)蛋白是Hedgehog信號(hào)通路的重要因子,也是Hedgehog蛋白家族的重要成員,在組織修復(fù)、細(xì)胞再生和炎癥損傷中發(fā)揮重要作用[5]。髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體-1(TREM-1)是BOUCHON等[6]于2001年報(bào)道的炎性因子,與炎癥反應(yīng)有密切關(guān)系。慢性牙周炎患者齦溝液中LF、Shh蛋白、TREM-1水平與牙周臨床指標(biāo)及炎性因子的關(guān)系尚不清楚。鑒于此,本研究進(jìn)行了相關(guān)分析,以期為慢性牙周炎的臨床診治提供一定參考,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2021年1-12月收治的慢性牙周炎患者104例作為研究組,其中男66例、女38例,年齡32～65歲、平均(43.55±6.12)歲,病程6～9年、平均(3.04±1.57)年。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)入組患者符合《牙周病學(xué)(第4版)》關(guān)于慢性牙周炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];(2)患者口腔X線片檢查顯示存在牙槽骨部分吸收,牙頸部無(wú)牙體病變;(3)全口余留牙≥18顆;(4)患者入組前2個(gè)月內(nèi)未服用抗菌藥物及使用含漱液,未接受過(guò)其他牙周治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并糖尿病、心腦血管疾病、慢性肝腎疾病患者;(2)合并牙髓炎及侵襲性牙周炎患者;(3)合并免疫系統(tǒng)疾病患者;(4)近半年內(nèi)有創(chuàng)傷、感染及手術(shù)史患者;(5)妊娠、哺乳期女性。另選取同期在本院進(jìn)行口腔檢查的健康志愿者30例作為對(duì)照組,其中男18例、女12例,年齡33～62歲、平均(43.06±4.68)歲。研究組與對(duì)照組性別、年齡比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員批準(zhǔn),患者及家屬對(duì)本研究知情同意。

1.2方法

1.2.1牙周臨床指標(biāo)檢測(cè) 所有患者進(jìn)行除第3磨牙外的全口牙周臨床檢查,每顆牙分別選取舌側(cè)、頰側(cè)的遠(yuǎn)中、正中和近中共計(jì)6個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)探診深度(PD)、附著喪失(AL)和出血指數(shù)(BI),最后取平均值作為檢測(cè)結(jié)果。PD為齦緣至牙周袋底部或齦溝底部的距離。牙齦無(wú)萎縮時(shí),AL為PD減去釉牙骨質(zhì)界到齦緣距離;當(dāng)發(fā)生牙齦萎縮時(shí),AL為PD與釉牙骨質(zhì)界到齦緣距離之和。使用牙周探針對(duì)牙周袋或齦溝進(jìn)行探診,取出探針30 s后觀察牙齦出血情況,記錄BI。0分:牙齦健康、無(wú)出血;1分:牙齦有炎性改變,但探診時(shí)無(wú)出血;2分:牙齦探診后出現(xiàn)點(diǎn)狀出血;3分:牙齦探診后有明顯出血,牙齦裂開;4分:牙齦探診后劇烈出血;5分:牙齦自動(dòng)出血[7]。選取舌側(cè)邊緣齦、頰側(cè)近中齦乳頭、頰側(cè)遠(yuǎn)中齦乳頭、頰側(cè)邊緣齦4個(gè)位點(diǎn)記錄炎癥反應(yīng)情況。0分:牙齦健康;1分:牙齦輕度炎癥;2分:牙齦中度炎癥;3分:牙齦重度炎癥,將4個(gè)位點(diǎn)得分求平均值作為牙齦指數(shù)(GI)[8]。

1.2.2齦溝液采集 探診兩組研究對(duì)象后去除牙齦軟垢和菌斑,吹干牙面,用2 mm×10 mm的Whatman濾紙深插入齦溝底部,停留30 s,取出濾紙并放入EP管中。EP管中預(yù)先放入0.2 mL的磷酸鹽緩沖液(PBS),震蕩1 h,3 000 r/min離心10 min,離心半徑12 cm,取上清液。

1.2.3齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1及炎性因子的檢測(cè) 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-7水平。將上清液分裝,取原倍的標(biāo)準(zhǔn)品150 μL進(jìn)行稀釋,取96孔板,分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔、待測(cè)樣品孔。首先進(jìn)行酶標(biāo)包被,加入標(biāo)準(zhǔn)品50 μL,然后加入40 μL樣品稀釋液和10 μL待測(cè)樣品,輕輕搖晃混勻樣品,封板后置于37 ℃恒溫條件下孵育30 min。拆掉封膜后將液體棄用,拍干,除空白孔外每個(gè)孔加入酶標(biāo)液50 μL,顯色劑A、B各50 μL,震蕩混勻,在37 ℃恒溫條件下避光顯色15 min。加入終止液50 μL,15 min后在450 nm波長(zhǎng)下觀察吸光度值,并計(jì)算待測(cè)樣品中相關(guān)指標(biāo)的水平。LF、Shh蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海百蕊生物科技有限公司,TREM-1檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海初態(tài)生物科技有限公司,TNF-α、IL-6、IL-7檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京伊諾凱科技有限公司。所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3慢性牙周炎病情嚴(yán)重程度的評(píng)估[7]輕度:GI<1,PD<4 mm,AL為1～2 mm,牙齒松動(dòng)不明顯;中度:GI為1～2,PD為4～6 mm,AL為>2～4 mm,牙齒輕度松動(dòng),多根牙出現(xiàn)輕度分叉病變;重度:GI>2,PD>6 mm,AL>4 mm,牙齒多處松動(dòng),牙根分叉明顯。

2 結(jié) 果

2.1兩組齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平比較 研究組齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平比較

2.2不同病情嚴(yán)重程度慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平比較 根據(jù)病情嚴(yán)重程度將患者分為輕度組38例、中度組44例、重度組22例。重度組患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平顯著高于中度組、輕度組(P<0.05);中度組患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平顯著高于輕度組(P<0.05)。見表2。

表2 不同病情嚴(yán)重程度慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平比較

2.3不同病情嚴(yán)重程度慢性牙周炎患者牙周臨床指標(biāo)比較 重度組患者PD、AL、BI、GI顯著高于中度組、輕度組(P<0.05);中度組患者PD、AL、BI、GI顯著高于輕度組(P<0.05)。見表3。

表3 不同病情嚴(yán)重程度慢性牙周炎患者牙周臨床指標(biāo)比較

2.4不同病情嚴(yán)重程度慢性牙周炎患者齦溝液炎性因子水平比較 重度組患者齦溝液TNF-α、IL-6、IL-17水平顯著高于中度組、輕度組(P<0.05);中度組患者齦溝液TNF-α、IL-6、IL-17水平顯著高于輕度組(P<0.05)。見表4。

表4 不同病情嚴(yán)重程度慢性牙周炎患者齦溝液炎性因子水平比較

2.5慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1與牙周臨床指標(biāo)和炎性因子的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示,慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平與PD、AL、BI、GI及齦溝液TNF-α、IL-6、IL-17水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。見表5。

表5 慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1與牙周臨床指標(biāo)和炎性因子的相關(guān)性

3 討 論

慢性牙周炎的主要病因是牙齒和牙齦交界處的齦溝內(nèi)、牙面內(nèi)的病原微生物大量繁殖,引起牙周慢性炎癥,并形成牙周袋和牙菌斑,炎癥反復(fù)遷延不愈,最終造成牙槽骨吸收、牙齒松動(dòng)[9]。慢性牙周炎造成的牙周支持組織損傷是不可逆的,因此,臨床上對(duì)于慢性牙周炎應(yīng)早期診斷,及時(shí)治療。齦溝液是由牙齦結(jié)締組織分泌的一種液體,當(dāng)牙周發(fā)生炎癥時(shí),組織細(xì)胞可以分泌和表達(dá)大量的炎性因子,通過(guò)檢測(cè)齦溝液中炎性因子水平可以反映炎癥反應(yīng)情況[10]。因此,尋找慢性牙周炎齦溝液特異性分子對(duì)于疾病診治具有重要的意義。

本研究對(duì)慢性牙周炎患者及健康志愿者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平進(jìn)行了比較。LF是一種鐵離子結(jié)合糖蛋白,最初在牛乳汁中分離獲得[11]。研究表明,LF廣泛存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi),其中人初乳中LF含量為20%以上,在唾液、胃液等分泌物中LF含量也較高[12]。研究表明,在中性粒細(xì)胞脫顆粒過(guò)程中可以產(chǎn)生LF,LF具有抗炎癥反應(yīng)的作用[13]。Shh蛋白是一種分泌型蛋白,是Hedgehog蛋白家族的重要成員[14]。研究表明,Shh蛋白在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)一系列的催化修飾和裂解與膽固醇共價(jià)結(jié)合,并與軟脂酰輔酶A發(fā)生反應(yīng),完成蛋白修飾,分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用[15]。研究表明,Shh蛋白可以通過(guò)啟動(dòng)Hedgehog信號(hào)通路發(fā)揮促炎作用[16]。TREM-1主要表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞表面和中性粒細(xì)胞表面,它可以與Toll樣受體(TLR)2和TLR4結(jié)合并被激活,從而啟動(dòng)炎癥反應(yīng)[17]。BOSTANCI等[18]報(bào)道指出,牙周組織中存在TREM-1異常表達(dá),其水平與慢性牙周炎的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平異常升高,且隨病情嚴(yán)重程度的增加慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平逐漸升高,表明LF、Shh蛋白、TREM-1可能與慢性牙周炎的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。分析原因可能與以下幾方面有關(guān):(1)慢性牙周炎是牙齒支持組織的慢性炎癥,炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)在疾病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,而在中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)程中會(huì)啟動(dòng)中性粒細(xì)胞脫顆粒,并分泌大量的LF,導(dǎo)致齦溝液中LF水平升高[19];(2)在慢性牙周炎發(fā)病過(guò)程中Shh蛋白水平升高,并啟動(dòng)Hedgehog信號(hào)通路,發(fā)揮促炎作用[20];(3)在慢性牙周炎發(fā)病過(guò)程中也會(huì)導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞激活,而TREM-1主要表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞表面和中性粒細(xì)胞表面,其水平升高可能與牙周組織單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞聚集,啟動(dòng)炎癥反應(yīng)有關(guān)[21]。另外隨著病情的加重,牙周的炎癥反應(yīng)更加劇烈,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度增加,因此,齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平越高。

本研究結(jié)果顯示,隨著疾病嚴(yán)重程度的增加,慢性牙周炎患者PD、AL、BI、GI逐漸升高。PD、AL、BI、GI是反映慢性牙周炎嚴(yán)重程度的重要臨床指標(biāo)。隨著慢性牙周炎的病情加重,炎癥可以向牙周深部組織逐漸進(jìn)展,引起牙齦萎縮、牙周膿腫、牙周袋形成,導(dǎo)致PD、AL、BI、GI升高。本研究結(jié)果表明,隨著疾病嚴(yán)重程度的增加,慢性牙周炎患者齦溝液TNF-α、IL-6、IL-17水平逐漸升高。TNF-α可以作用于機(jī)體血管內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷,引起組織缺血和炎癥反應(yīng)[22]。TNF-α還可以直接參與炎癥反應(yīng),促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生膠原酶,導(dǎo)致組織壞死和吸收[22]。IL-6是主要由T淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的炎性因子,具有促進(jìn)中性粒細(xì)胞聚集和活化的作用[23]。IL-17是輔助性T細(xì)胞17(Th17)分泌的特異性因子,它能夠激活T淋巴細(xì)胞,發(fā)揮促炎作用[24]。在慢性牙周炎的發(fā)生和發(fā)展中,TNF-α可能引起牙周組織缺血和損傷,并促進(jìn)牙周炎癥反應(yīng)[25],而IL-6、IL-17可能與機(jī)體免疫細(xì)胞激活,炎癥反應(yīng)激活有關(guān)[26]。

本研究結(jié)果還顯示,慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平與PD、AL、BI、GI及齦溝液TNF-α、IL-6、IL-17水平呈正相關(guān),表明齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平可以反映慢性牙周炎病情及炎癥反應(yīng)情況。臨床上由于慢性牙周炎的早期診斷對(duì)于治療非常重要,而目前臨床上對(duì)于慢性牙周炎的診斷仍主要依據(jù)PD、AL、BI、GI等臨床指標(biāo),但檢測(cè)可能帶來(lái)一定的創(chuàng)傷。相對(duì)于全口牙周臨床檢查,齦溝液采集則更為方便,也方便動(dòng)態(tài)觀察。本研究結(jié)果也提示檢測(cè)齦溝液中LF、Shh蛋白、TREM-1對(duì)慢性牙周炎的診斷有一定的指導(dǎo)價(jià)值。

綜上所述,慢性牙周炎患者齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1水平異常升高,其水平與牙周臨床指標(biāo)和炎性因子呈正相關(guān),LF、Shh蛋白、TREM-1水平可以反映疾病嚴(yán)重程度,檢測(cè)齦溝液LF、Shh蛋白、TREM-1可以輔助評(píng)估慢性牙周炎的病情。