牛大力中總甾醇的提取條件優(yōu)化、含量測(cè)定及抗氧化性研究

石敏　謝青夢(mèng)?黃思榮

摘要：【目的】對(duì)牛大力中總甾醇的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立其含量測(cè)定方法，并對(duì)其抗氧化性進(jìn)行初步探究，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)牛大力價(jià)值提供參考。【方法】采用超聲提取-分光光度計(jì)法，通過(guò)正交試驗(yàn)獲得牛大力中總甾醇的最佳提取工藝參數(shù)和含量測(cè)定條件；通過(guò)自由基清除試驗(yàn)初步探究其抗氧化性?！窘Y(jié)果】結(jié)果顯示，料液比1∶80、乙醇濃度80%、超聲溫度50℃、超聲功率450 W、超聲時(shí)間90 min、超聲次數(shù)2次，測(cè)定波長(zhǎng)546 nm、5%香草醛-冰醋酸溶液用量0.4 mL、高氯酸用量0.8 mL、水浴溫度80℃、水浴時(shí)間30 min時(shí)，牛大力中總甾醇的提取效果最佳，測(cè)定方法的方法學(xué)考察結(jié)果良好，對(duì)DPPH·和ABTS·清除率均達(dá)到95%以上?！窘Y(jié)論】構(gòu)建的牛大力總甾醇提取、測(cè)定方法簡(jiǎn)便快捷、提取率高、穩(wěn)定準(zhǔn)確、靈敏度高，可為牛大力價(jià)值挖掘、質(zhì)量控制和天然抗氧化劑開(kāi)發(fā)提供借鑒。

關(guān)鍵詞：牛大力；總甾醇；提??；含量測(cè)定；抗氧化

中圖分類號(hào)：S667.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1003-4374（2023）02-00-10

Study on Extraction， Detection and Antioxidant Activity of Total Sterol from

Millettia speciosa Champ.

Shi Min， Xie Qing-meng， Huang Si-rong

（Guangxi Vocational University of Agriculture ， Nanning， Guangxi 530007， China）

Abstract： 【Objective】In order to exploiting the value of Millettia speciosa Champ.， the extraction condition of total sterol from Millettia speciosa Champ. was optimized， and the determination method was established， the antioxidant activity was evaluated at the same time. 【Method】The optimum extraction process parameters and content determination conditions of total sterols in Millettia speciosa Champ. were obtained by ultrasonic extraction-spectrophotometer method and orthogonal test. Its antioxidant activity was preliminarily explored by free radical scavenging test.【Result】The result showed that the extraction and determination effect were best when material-to-liquid ratio was 1∶80， ethanol concentration was 80 %， ultrasonic temperature was 50℃， ultrasonic power was 450 W， ultrasonic time was 90 min， extraction times was 2， the detection wavelength was 546 nm， the volume of 5%vanillin-glacial acetic acid was 0.4 mL， the volume of perchloric acid was 0.8 mL， the water bath temperature was 80℃， and the water bath time was 30 min. Tests showed that the scavenging rate on DPPH· and ABTS· were above 95%. 【Conclusion】This extraction and analysis method of total sterol from Millettia speciosa Champ. was simple， efficient， accurate and sensitive， which will become reference to exploit the value， control the quality of Millettia speciosa Champ. and develop the natural antioxidants.

Key words： Millettia speciosa Champ.， total sterol， extraction， detection， antioxidant activity

牛大力為豆科植物美麗崖豆藤（Millettia speciosa Champ.）的干燥根，分布于長(zhǎng)江流域以南各地。牛大力含有多糖、黃酮、甾醇、酚酸和生物堿等多種活性成分［1-4］，可用于治療腰肌勞損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺熱、肺結(jié)核、腎虛、慢性支氣管炎、慢性肝炎、白帶異常、遺精等。［5，6］南方地區(qū)，尤其是廣東和廣西，常將牛大力泡酒、熬湯或煮粥，藥食兩用，口感甘甜，芳香獨(dú)特。近幾年，牛大力開(kāi)始以深加工產(chǎn)品的形式出現(xiàn)在市場(chǎng)上。［7-9］

植物甾醇是一種生物活性物質(zhì)，主要包括谷甾醇和豆甾醇等。現(xiàn)代研究表明，植物甾醇對(duì)人體有增強(qiáng)抵抗力的作用，有利于減少細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)；植物甾醇可加速膽固醇代謝，抑制膽固醇的吸收，對(duì)心腦血管疾病有一定的療效；同時(shí)植物甾醇可促進(jìn)血液循環(huán)，起到活血化瘀的功效。［10-12］植物甾醇還具有一定的抗氧化活性，低濃度的甾醇就能有效抑制自由基的氧化。［13-16］甾醇含量測(cè)定方法有：分光光度計(jì)法、氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜法、薄層色譜法和酶法等。［17-22］其中，氣相色譜法樣品前處理繁瑣，氣相色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)樣品制備要求高、分析時(shí)間長(zhǎng)、耗費(fèi)高，薄層色譜法準(zhǔn)確度低、重復(fù)性差，酶法技術(shù)要求高。分光光度計(jì)法相對(duì)簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確可靠。目前，尚未有關(guān)于牛大力中總甾醇提取工藝及抗氧化性研究的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)采用超聲提取-分光光度計(jì)法，通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)牛大力中總甾醇的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)單因素試驗(yàn)，對(duì)總甾醇的測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對(duì)該方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性等進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)清除DPPH·和ABTS·試驗(yàn)，初步探究牛大力中總甾醇的抗氧化性。本試驗(yàn)探索簡(jiǎn)便快捷、提取率高、穩(wěn)定準(zhǔn)確、靈敏度高的牛大力中總甾醇提取、檢測(cè)方法，為牛大力深加工提供工藝參數(shù)，為牛大力定質(zhì)分級(jí)提供依據(jù)，從而有效推動(dòng)中草藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

牛大力采自廣西15個(gè)不同產(chǎn)區(qū)，由廣西藥用植物園長(zhǎng)期從事藥用植物資源調(diào)查和物種保育研究工作的彭玉德高級(jí)工程師鑒定，確認(rèn)樣品屬于豆科植物美麗崖豆藤的根薯部。牛大力用水沖洗干凈后自然晾干，于烘箱中干燥至恒重，打成粉狀，于干燥器中保存。［23］

β-谷甾醇對(duì)照品（純度：HPLC ≥98%）：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；無(wú)水乙醇（分析純）和冰醋酸（分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；香草醛（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；高氯酸（優(yōu)級(jí)純）：上海華誼集團(tuán)華原化工有限公司；1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·）（純度≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸（純度≥99%）：成都市科龍化學(xué)品有限公司；2，2-二氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基（ABTS·）（純度≥98%）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

UV-2601雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京北分瑞利分析儀器（集團(tuán)）有限責(zé)任公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司； HWS-24電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取β-谷甾醇對(duì)照品10 mg，用無(wú)水乙醇溶解并定容至100 mL，即得0.1 mg/mL的β-谷甾醇對(duì)照品貯備液，于4℃下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

準(zhǔn)確移取0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8 mL上述β-谷甾醇對(duì)照品貯備液，于90℃水浴中揮干乙醇溶劑，加入一定體積的5%香草醛-冰醋酸溶液及高氯酸，水浴中保溫一段時(shí)間，速冷，加入冰醋酸至5 mL，搖勻，于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以β-谷甾醇的質(zhì)量濃度（ρ）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

1.3.2 樣品的提取和測(cè)定

準(zhǔn)確稱取牛大力粉末，加入一定體積和濃度的乙醇溶液，稱定質(zhì)量，浸泡后超聲提取一段時(shí)間，冷卻后稱重并補(bǔ)加提取溶液至原重，采用離心（4000 r/min，10 min）分離出上清液，重復(fù)提取數(shù)次，合并上清液，得到供試液。

將供試液稀釋10倍，準(zhǔn)確移取稀釋后的供試液1 mL，按“1.3.1”項(xiàng)下步驟顯色并測(cè)定吸光度，根據(jù)公式1-1計(jì)算牛大力樣品中總甾醇的提取量。

X＝ρｘVｘN/m（1-1）

其中，X為牛大力總甾醇提取量（mg/g）；ρ為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到的待測(cè)液中總甾醇質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為待測(cè)液體積（mL）；N為牛大力 樣品稀釋倍數(shù)；m為牛大力樣品質(zhì)量（g）。

1.3.3 總甾醇提取工藝的優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取牛大力樣品粉末1.0000 g，固定乙醇濃度90%、超聲溫度50℃、超聲功率350 W、超聲時(shí)間60 min、超聲次數(shù)1次，考察料液比（1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80）對(duì)總甾醇提取量的影響；固定料液比1∶70、超聲溫度50℃、超聲功率350 W、超聲時(shí)間60 min、超聲次數(shù)1次，考察乙醇濃度（60%、70%、80%、90%、100%）對(duì)總甾醇提取量的影響；固定料液比1∶70、乙醇濃度80%、

超聲功率350 W、超聲時(shí)間60 min、超聲次數(shù)1次，考察超聲溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）對(duì)總甾醇提取量的影響；固定料液比1∶70、乙醇濃度80%、超聲溫度50℃、超聲時(shí)間60 min、超聲次數(shù)1次，考察超聲功率（300 W、350 W、400 W、450 W、500 W）對(duì)總甾醇提取量的影響；固定料液比1∶70、乙醇濃度80%、超聲溫度50℃、超聲功率450 W、超聲次數(shù)1次，考察超聲時(shí)間（0 min、30 min、60 min、90 min、120 min）對(duì)總甾醇提取量的影響；固定料液比1∶70、乙醇濃度80%、超聲溫度50℃、超聲功率450 W、超聲時(shí)間60 min，考察超聲次數(shù)（1次、2次、3次）對(duì)牛大力總甾醇提取量的影響。

（2）正交試驗(yàn)

根據(jù)總甾醇提取條件單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)牛大力總甾醇 提取條件進(jìn)行優(yōu)化，其中選取的四因素和三水平見(jiàn)表1。

（3）驗(yàn)證試驗(yàn)

按正交試驗(yàn)最優(yōu)提取組合進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，分別計(jì)算牛大力中總甾醇提取量和3次平行試驗(yàn)的RSD，并與正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，評(píng)價(jià)提取工藝的可靠性。

1.3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別精密移取適量β-谷甾醇對(duì)照品貯備液和牛大力供試液，按“1.3.1”項(xiàng)下步驟進(jìn)行顯色， 于波長(zhǎng)300～900 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，選擇測(cè)定的波長(zhǎng)。

1.3.5 含量測(cè)定條件的優(yōu)化

準(zhǔn)確移取β-谷甾醇對(duì)照品貯備液0.5 mL，固定高氯酸0.8 mL、水浴溫度70℃、水浴時(shí)間30 min、顯色時(shí)間10 min，考察5%香草醛-冰醋酸溶液的用量（0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL）對(duì)吸光度的影響；固定5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL、高氯酸0.8 mL、水浴時(shí)間30 min、顯色時(shí)間10 min，考察水浴溫度（50℃、60℃、70℃、80℃、90℃）對(duì)吸光度的影響；固定5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL、高氯酸0.8 mL、水浴溫度80℃、顯色時(shí)間10 min，考察水浴時(shí)間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min）對(duì)吸光度的影響；固定5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL、高氯酸0.8 mL、水浴溫度80℃、水浴時(shí)間30 min，考察顯色時(shí)間（0 min、5 min、10 min、15 min、20 min）對(duì)吸光度的影響。

1.3.6 精密度試驗(yàn)

選取1份牛大力樣品，按“1.3.1”項(xiàng)下步驟進(jìn)行提取和顯色后，連續(xù)測(cè)定吸光度6次，計(jì)算牛大力中總甾醇提取量和RSD，評(píng)價(jià)該方法的精密度。

1.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

選取同一批牛大力樣品6份，分別按“1.3.1”項(xiàng)下步驟進(jìn)行提取和測(cè)定，計(jì)算牛大力中總甾醇提取量和RSD，評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性。

1.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選取1份牛大力樣品，按“1.3.1”項(xiàng)下步驟進(jìn)行提取和顯色，分別于顯色結(jié)束60 min內(nèi)，每間隔10 min測(cè)定一次吸光度，計(jì)算牛大力中總甾醇提取量和RSD，評(píng)價(jià)該方法的顯色穩(wěn)定性。

選取1份牛大力樣品，按“1.3.1”項(xiàng)下步驟進(jìn)行提取，將得到的牛大力供試液分別于室溫下放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h，再按“1.3.1”項(xiàng)下步驟進(jìn)行顯色測(cè)定，評(píng)價(jià)該方法的樣品穩(wěn)定性。

1.3.9 抗氧化試驗(yàn)

（1）DPPH·清除能力試驗(yàn)

分別準(zhǔn)確移取0.010 mg/mL、0.020 mg/ mL、0.030 mg/ mL、0.040 mg/mL、0.050 mg/mL、0.060 mg/ mL、0.080 mg/ mL、0.100 mg/mL、0.125 mg/mL的供試液各5 mL，與1 mL的0.1 mmol/L DPPH溶液充分混合均勻 ，避光處放置反應(yīng) 30 min，于517 nm處測(cè)定得到 A_樣品；移取無(wú)水乙醇5 mL，與1 mL的上述DPPH溶液混合，避光處放置反應(yīng) 30 min，于517 nm處測(cè)定得到 A_空白；分別移取上述不同濃度的供試液5 mL，與1 mL的無(wú)水乙醇混合，避光處放置反應(yīng) 30 min，于517 nm處測(cè)定得到 A_對(duì)照。其中，參比為無(wú)水乙醇，陽(yáng)性對(duì)照為維生素C。計(jì)算公式：

清除率（％）＝A_空白-A_樣品+A_對(duì)照/A_空白x100％（1-2）

（2）ABTS·清除能力試驗(yàn)

等體積混合2.5 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液與7 mmol/ L ABTS溶液，于避光處放置約12 h，即得ABTS貯備液。稀釋ABTS貯備液，使其于734 nm處的吸光度值為0.7 ± 0.02，即得ABTS工作液。［24］分別移取0.010 mg/mL、0.020 mg/mL、0.030 mg/ mL、0.040 mg/ mL、0.050 mg/mL、0.060 mg/mL、0.080 mg/ mL、0.100 mg/mL、0.125 mg/mL的供試液1 mL，與2 mLABTS工作液充分混合均勻 ，于734 nm處測(cè)定得到A樣品；移取無(wú)水乙醇1 mL，與2 mL ABTS工作液充分混合均勻 ，于734 nm處測(cè)定得到 A空白。其中，參比為無(wú)水乙醇，陽(yáng)性對(duì)照為維生素C。計(jì)算公式：

清除率（％）＝A_空白-A_樣品/A_空白x100％（1-3）

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 總甾醇提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 料液比對(duì)總甾醇提取的影響

料液比對(duì)總甾醇提取的影響見(jiàn)圖1。料液比在1∶40～1∶70范圍內(nèi)，與總甾醇提取量呈正相關(guān)；料液比超過(guò)1∶70后，溶出量已達(dá)到最大值的甾醇不再繼續(xù)溶出，引起總甾醇提取量不升反降。因此，初步確定最優(yōu)料液比為1∶70。

2.1.2 乙醇濃度對(duì)總甾醇提取的影響

乙醇濃度對(duì)總甾醇提取的影響見(jiàn)圖2。乙醇濃度在60%～80%范圍內(nèi)，與總甾醇提取量呈正相關(guān)；乙醇濃度超過(guò)80%后，與總甾醇提取量卻呈負(fù)相關(guān)，這是高濃度乙醇促使部分醇溶性雜質(zhì)的溶出導(dǎo)致甾醇的溶出受到限制。因此，初步確定最優(yōu)乙醇濃度為80%。

2.1.3 超聲溫度對(duì)總甾醇提取的影響

超聲溫度的高低會(huì)直接影響分子運(yùn)動(dòng)速率的大小，從而引起物質(zhì)提取量的變化。超聲溫度對(duì)總甾醇提取的影響見(jiàn)圖3。超聲溫度較低時(shí)，甾醇物質(zhì)的溶出速率較慢；超聲溫度高到一定程度時(shí)，除了甾醇物質(zhì)，還有揮發(fā)性的成分和熱不穩(wěn)定的雜質(zhì)也會(huì)相繼溶出， 同時(shí)高溫會(huì)加快提取溶劑的揮發(fā)，影響提取的效率。因此，初步確定最優(yōu)超聲溫度為50℃。

2.1.4 超聲功率對(duì)總甾醇提取的影響

超聲功率對(duì)總甾醇提取的影響見(jiàn)圖4。牛大力總甾醇提取量先隨超聲功率的增大而增加，這是由于劇烈的空化效應(yīng)提高了牛大力細(xì)胞的破壞率，加速了甾醇提取 ；當(dāng)超聲功率超過(guò)450 W后，大功率的超聲波會(huì)引起雜質(zhì)的大量溶出。 因此，初步確定最優(yōu)超聲功率為450 W。

2.1.5 超聲時(shí)間對(duì)總甾醇提取的影響

超聲時(shí)間對(duì)總甾醇提取的影響見(jiàn)圖5。牛大力總甾醇提取量先隨超聲時(shí)間的增加而呈增加趨勢(shì)，表明超聲波產(chǎn)生的綜合效應(yīng)有利于物質(zhì)的析出；超聲時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，細(xì)胞壁破壞程度較大，內(nèi)容物提取較多，從而總甾醇提取量最高；超聲時(shí)間超過(guò)60 min后，除了目標(biāo)物質(zhì)之外，雜質(zhì)也大量析出，并吸附目標(biāo)物質(zhì)。 因此，初步確定最優(yōu)超聲時(shí)間為60 min。

2.1.6 提取次數(shù)對(duì)總甾醇提取的影響

提取次數(shù)對(duì)總甾醇提取的影響見(jiàn)圖6?？傜薮继崛×颗c提取次數(shù)呈正相關(guān)，說(shuō)明少次數(shù)的提取會(huì)造成提取不徹底，但多次提取又會(huì)導(dǎo)致成本增加。因此， 初步確定最優(yōu)提取次數(shù)為2 次。

2.2 總甾醇提取的正交試驗(yàn)結(jié)果分析

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見(jiàn)表2。影響牛大力中總甾醇提取的主次因素順序 為C＞A＞B，最優(yōu)提取組合方式為A3B2C3，即料液比為1∶80，乙醇濃度為80%，超聲時(shí)間為90 min。根據(jù)方差分析結(jié)果表3所示，C因素（超聲時(shí)間）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A因素（料液比）、B因素（乙醇濃度）均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析

驗(yàn)證試驗(yàn)所得牛大力中總甾醇提取量結(jié)果分別為22.80 mg/g、22.35 mg/g、22.18 mg/g，所得平均提取量為22.44 mg/g， RSD為1.43%（n=3），所得結(jié)果高于正交試驗(yàn)中的任一組，說(shuō)明該提取工藝穩(wěn)定可靠。

2.4 含量測(cè)定條件優(yōu)化結(jié)果分析

2.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇結(jié)果分析

β-谷甾醇對(duì)照品和牛大力提取液的紫外可見(jiàn)光譜掃描圖見(jiàn)圖7。β-谷甾醇對(duì)照品和牛大力甾醇提取液均在546 nm處有最大吸收峰。因此，選擇546 nm作為牛大力中總甾醇含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4.2 5%香草醛-冰醋酸溶液用量對(duì)吸光度的影響

在強(qiáng)氧化性酸的作用下，甾醇可與香草醛試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，因此5%香草醛-冰醋酸溶液用量對(duì)顯色反應(yīng)是否進(jìn)行的完全存在直接影響。香草醛-冰醋酸溶液用量對(duì)吸光度的影響見(jiàn)圖8。5%香草醛-冰醋酸溶液用量在0.2～0.4 mL范圍內(nèi)，與吸光度呈正相關(guān)；超過(guò)0.4 mL后，與吸光度卻呈負(fù)相關(guān)。因此，確定5%香草醛-冰醋酸溶液用量為0.4 mL。

2.4.3 高氯酸用量對(duì)吸光度的影響

雖然高氯酸的用量對(duì)顯色反應(yīng)也存在顯著影響，但不同用量的高氯酸會(huì)引起對(duì)照貯備液和供試液最大吸收波長(zhǎng)的變化。［25］綜合考慮，選擇高氯酸用量為0.8 mL。

2.4.4 水浴溫度對(duì)吸光度的影響

水浴溫度對(duì)吸光度的影響見(jiàn)圖9。隨水浴溫度的增大，吸光度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，水浴溫度過(guò)低不利于顯色反應(yīng)的發(fā)生，水浴溫度過(guò)高則可能會(huì)造成底物和顯色試劑的分解。因此，確定水浴溫度為80℃。

2.4.5 水浴時(shí)間對(duì)吸光度的影響

水浴時(shí)間對(duì)吸光度的影響見(jiàn)圖10。吸光度隨水浴時(shí)間的增大呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，表明底物顯色是否完全受水浴時(shí)間長(zhǎng)短的限制；水浴時(shí)間不夠顯色反應(yīng)未完成，水浴時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響甾醇物質(zhì)和顯色物質(zhì)的穩(wěn)定性。因此，確定水浴時(shí)間為30 min。

2.4.6 顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響

顯色時(shí)間對(duì)吸光度的影響見(jiàn)圖11。吸光度隨顯色時(shí)間的增加有所降低，隨后趨于穩(wěn)定，表明水浴時(shí)顯色反應(yīng)已完成，水浴結(jié)束后可立即進(jìn)行測(cè)定，放置時(shí)間越久，顯色物質(zhì)越不穩(wěn)定。因此，確定顯色時(shí)間為0 min。

2.5 方法學(xué)考察結(jié)果分析

2.5.1 線性關(guān)系考察結(jié)果分析

β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖12。得到線性方程為y=85.853x-0.0003，r=0.9999，說(shuō)明濃度范圍為0.002～0.016 mg/mL的β-谷甾醇與A₅₄₆之間的線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度考察結(jié)果分析

精密度試驗(yàn)所得結(jié)果顯示，牛大力中總甾醇平均提取量為22.23 mg/g，RSD為0.87%（n=6），表明精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性考察結(jié)果分析

重復(fù)性試驗(yàn)所得結(jié)果顯示，牛大力中總甾醇平均提取量為21.99 mg/g，RSD為2.04%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性考察結(jié)果分析

顯色穩(wěn)定性試驗(yàn)所得結(jié)果顯示，牛大力中總甾醇平均提取量為22.17 mg/g，RSD為1.77%（n=7），表明牛大力供試液在顯色60 min內(nèi)穩(wěn)定。

樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)所得結(jié)果顯示，牛大力中總甾醇平均提取量為22.03 mg/g，RSD為3.21%（n=8），表明牛大力供試液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 樣品測(cè)定結(jié)果分析

不同產(chǎn)地牛大力中總甾醇含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4?？梢?jiàn)不同產(chǎn)地的牛大力中總甾醇含量差異較大，含量范圍在6.90～41.56 mg/g，可為廣西牛大力產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

2.7 抗氧化性研究結(jié)果分析

2.7.1 DPPH·清除能力試驗(yàn)結(jié)果分析

牛大力中總甾醇與維生素C對(duì)DPPH·清除能力見(jiàn)圖13。牛大力甾醇提取液在0.010～0.125 mg/mL濃度范圍內(nèi)，與DPPH·清除率呈正相關(guān)；其中最高清除率達(dá)到95.4%。與維生素C的抗氧化能力相比，在0.010～0.050 mg/mL濃度范圍內(nèi)，牛大力甾醇提取液對(duì)DPPH·清除能力明顯弱于維生素C；在0.060～0.125 mg/mL濃度范圍內(nèi)，卻與維生素C相當(dāng)。

2.7.2ABTS·清除能力試驗(yàn)結(jié)果分析

牛大力中總甾醇與維生素C對(duì)ABTS·清除能力見(jiàn)圖14。牛大力甾醇提取液在0.010～0.125 mg/ mL濃度范圍內(nèi)，與ABTS·清除率呈正相關(guān)；其中最高清除率達(dá)到98.2%。與維生素C的抗氧化能力相比，濃度為0.010～0.080 mg/mL時(shí)，牛大力甾醇提取液的ABTS·清除能力明顯弱于維生素C；濃度為0.100～0.125 mg/mL時(shí)，卻與維生素C相當(dāng)。

3 小結(jié)

本研究構(gòu)建了一種簡(jiǎn)便高效、準(zhǔn)確靈敏的牛大力中總甾醇的提取和含量測(cè)定方法，初步探究發(fā)現(xiàn)牛大力中的總甾醇具有一定的體外抗氧化性。經(jīng)過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化得到最佳條件：料液比為1∶80、乙醇濃度為80%、超聲溫度為50℃、超聲功率為450 W、超聲時(shí)間為90 min、超聲次數(shù)為2次，測(cè)定波長(zhǎng)為546 nm、5%香草醛-冰醋酸溶液用量為0.4 mL、高氯酸用量為0.8 mL、水浴溫度為80℃、水浴時(shí)間為30 min。本研究對(duì)牛大力產(chǎn)品的定量分析，牛大力加工產(chǎn)品的研制，天然抗氧化產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)均具有較大的指導(dǎo)作用。

參考文獻(xiàn)：

［1］王祝年，賴富麗，王茂媛，等.牛大力根的化學(xué)成分研究［J］.熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32（12）：2378-2380.

［2］王呈文，陳光英，宋小平，等.牛大力的化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2014，45（11）：1515-1520.

［3］伍月榕，彭麗珊，肖健.牛大力主要化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，40（4）：503-506.

［4］趙震宇，劉平懷，馬莎莎，等.藥食同源植物牛大力的研究進(jìn)展（英文）［J］.食品科學(xué)，2017，38（9）：293-306.

［5］全國(guó)中草藥匯編編寫組.全國(guó)中草藥匯編·上冊(cè)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1986：200.

［6］國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：572.

［7］趙琤，黃友琴，潘嫣麗，等.牛大力綠茶保健植物飲料的開(kāi)發(fā)研究［J］.廣西農(nóng)學(xué)報(bào)，2021，36（5）：33-42.

［8］趙琤，黃友琴，唐婷，等.牛大力綠茶保健植物飲料開(kāi)發(fā)市場(chǎng)分析［J］.廣西農(nóng)學(xué)報(bào)，2019，34（5）：58-62.

［9］王茂媛，羊青，王清隆，等.牛大力速溶茶的研制加工［J］.熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，36（9）：92-96.

［10］Piironen? V，Lingdsay D G，Miettinen T A，et al. Plant sterols： biosynthesis， biological function and their importance to human nutrition［J］. fournal of the Science of food and agriculture 2000，7（7）：939-966.

［11］韓軍花.植物甾醇的性質(zhì)、功能及應(yīng)用［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，2001，28（5）：285-291.

［12］吳時(shí)敏，吳謀成.植物甾醇的研究進(jìn)展與趨向

（Ⅰ）：植物甾醇的基礎(chǔ)研究［J］.中國(guó)油脂，2002，27（2）：73-75.

［13］何榮軍，周菲，趙月鈞，等.靈芝總甾醇的閃式提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39（9）：200-204.

［14］王晨慧，李春揚(yáng)，張曉磊，等.山藥酒中甾醇含量測(cè)定及清除DPPH自由基活性研究［J］.中國(guó)釀造，2020，39（11）：62-65.

［15］趙雁武，王憲偉，黃瀅璋，等.蘋果籽油中植物甾醇抗氧化活性研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，40（9）：221-226.

［16］彭昕，黃亮，王平，等.雷竹筍總黃酮和總甾醇的抗氧化性與抑菌性［J］.經(jīng)濟(jì)林研究，2017，35（3）：179-185.

［17］徐小軍，余國(guó)珍，陳鑒東.硫磷鐵法測(cè)定大豆甾醇提取物中總甾醇含量［J］.中國(guó)藥業(yè)，2010，19（8）：35-36.

［18］鄒燕娣，包李林，熊巍林，等.氧化鋁固相萃取-氣相色譜快速測(cè)定植物油中甾醇含量［J］.食品工業(yè)，2018，39（6）：253-256.

［19］楊靜，白冰，劉繡華，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定山藥中的植物甾醇［J］.食品科技，2019，44（6）：321-325.

［20］曾婉俐，米其利，李晶，等.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定煙草中5種甾醇的研究［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2019，31（11）：1879-1885.

［21］劉海霞，仇農(nóng)學(xué)，王峰，等.蘋果籽油中植物甾醇含量的薄層色譜-分光光度法測(cè)定［J］.中國(guó)油脂， 2008，33（11）：76-79.

［22］李文慶，孫敏甜，李文佳，等.HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定冬蟲夏草中3個(gè)甾醇的含量［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2018，29（4）：862-864.

［23］石敏，吳桂妮，藍(lán)淼杏.牛大力總酚酸提取工藝優(yōu)化、定量分析及抗氧化活性研究［J］.食品工業(yè)，2022，43（9）：82-87.

［24］李斌，雷月，孟憲軍，等.響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助提取藍(lán)靛果多酚工藝及其抗氧化活性［J］.食品科學(xué)，2015，36（22）：33-39.

［25］盛衛(wèi)國(guó)，葉劍鋒，徐勇，等.紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定普樂(lè)安片中總甾醇含量［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9（23）：8-9，13.

（責(zé)任編輯：黎月娟）