缺氮與恢復(fù)供氮后水稻銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)特征分析

胡太蛟　張珊珊　林艷　宋亞娜

摘 要：為了解水稻吸收和利用銨態(tài)氮的分子機(jī)制，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測了水稻全部預(yù)測的12條銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在缺氮及恢復(fù)供氮處理后的表達(dá)情況。結(jié)果表明：全部銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在水稻根、莖和葉中都有表達(dá)，AMT1.1在葉中表達(dá)水平最高，其表達(dá)受到氮缺乏和氮源類型的影響。缺氮處理后，水稻根部的表達(dá)全部大幅下調(diào)，莖中多數(shù)下調(diào)，少數(shù)上調(diào)或波動，葉中大部分先上調(diào)再回落；恢復(fù)供氮后，水稻根部多數(shù)大幅上調(diào)，莖和葉中則有所分化，部分上調(diào)或先上調(diào)再回落。這一現(xiàn)象與水稻氮代謝途徑的整體銨轉(zhuǎn)運(yùn)途徑有關(guān)，銨的吸收是由根到莖再到葉轉(zhuǎn)運(yùn)，銨代謝消耗則反向轉(zhuǎn)運(yùn)。

關(guān)鍵詞：表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；水稻；AMT基因；氮

中圖分類號：S 511 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：0253-2301（2023）04-0012-10

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.04.003

Analysis of the Expression Characteristics of Rice Ammonium Transporter Gene Afterthe Treatment of Nitrogen Deficiency and the Recovery of Nitrogen Supply

HU Tai-jiao1， ZHANG Shan-shan2， LIN Yan1， SONG Ya-na1

（Institute of Biotechnology， Fujian Academy of Agricultural Sciences / Fujian Key Laboratory of

Agricultural Genetic Engineering， Fuzhou， Fujian 350003， China; 2. Crop College，

Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350000， China）

Abstracts： In order to understand the molecular mechanism of absorption and utilization of ammonium nitrogen in rice， the real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression of all the 12 predicted ammonium transporter genes in rice after the treatment of nitrogen deficiency and nitrogen restoration. The results showed that all the ammonium transporter genes were expressed in the roots， stems and leaves of rice. AMT1.1 had the highest expression level in leaves， and its expression was affected by nitrogen deficiency and the types of nitrogen source. After the treatment of nitrogen deficiency， the expression in rice roots was all significantly down-regulated， the expression in most of the stems were down-regulated， a few were up-regulated or fluctuated， and the expression in most of the leaves were first up-regulated and then down. After restoring the nitrogen supply， the expression in most of the rice roots were significantly up-regulated， while the expression in stems and leaves were differentiated， partially up-regulated or first up-regulated and then down-regulated. This phenomenon was related to the overall ammonium transport pathway of rice nitrogen metabolism pathway. The absorption of ammonium was transported from roots to stems and then to leaves， and the metabolic exhaustion of ammonium was reversed.

Key words： Expression； Real-time fluorescence quantitative PCR； Rice； AMT gene； Nitrogen

氮是水稻生長和發(fā)育過程必不可少且需求量最大的3種主要營養(yǎng)元素之一，約占水稻干物質(zhì)總量的1%～5%，被稱為生命元素[1-2]。自然條件下的土壤中含氮量千變?nèi)f化且濃度普遍不高，人工增施氮肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的常規(guī)操作[3]。然而，水稻及其他農(nóng)作物的氮利用效率都普遍很低，平均效率為30%～50%[4]，國內(nèi)更低，只有28.3%[5]。土壤中過多的氮肥無法充分利用不僅造成極大的資源浪費(fèi)，同時(shí)也產(chǎn)生嚴(yán)重的環(huán)境問題。通過增施氮肥提高農(nóng)作物產(chǎn)量的生產(chǎn)方式也已經(jīng)達(dá)到了一個(gè)技術(shù)平臺期，繼續(xù)增加氮肥已難以達(dá)到大量提高產(chǎn)量的目的。因此，深入了解氮的吸收機(jī)制后可以對癥下藥，對提高水稻及其他農(nóng)作物氮的利用效率意義深遠(yuǎn)。

植物吸收利用土壤中的氮主要是無機(jī)態(tài)的氮，分為兩種形態(tài)：銨態(tài)氮（ammonium，NH4+）和硝態(tài)氮（nitrate，NO3-）[6-7]。由于銨態(tài)氮的吸收耗能更少，有研究表明植物偏向于優(yōu)先利用銨態(tài)氮[8-9]。水稻是喜銨作物，偏向于優(yōu)先利用銨態(tài)氮[10]。水稻對銨態(tài)氮的吸收是通過銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ammonium transporter，AMT）來實(shí)現(xiàn)的[11-12]。

水稻中預(yù)測有12個(gè)AMT基因（TIGR數(shù)據(jù)庫，http：//rice.plantbiology.msu.edu/）[13]，所有12個(gè)基因的蛋白都含有銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域（Accession No.PF00909）（Pfam分析，http：//pfam.sanger.ac.uk/search/sequence），符合銨離子轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。大部分蛋白都含有10～11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其中N端在膜外，C端在膜內(nèi)，與已知的其他AMT蛋白的晶體結(jié)構(gòu)相符合[13]。

研究基因的表達(dá)，通常從轉(zhuǎn)錄水平定量檢測轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，或者從翻譯水平定量檢測轉(zhuǎn)錄后翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)。前者的方法包括反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、基因芯片、Northern Blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR），后者一般是酶聯(lián)免疫吸附測定法 （Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ， ELISA）、蛋白芯片和蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）法。早期研究一般采用RT-PCR[14-15]，目前主流是采用特異性和高敏感性的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法[16-18]，ELISA和Western blot受限于目標(biāo)抗體的獲得難度難以普及。據(jù)報(bào)道：OsAMT1.1是組成型表達(dá)，主要表達(dá)部位是嫩枝和根，其表達(dá)幾乎不受氮缺乏、氮源提供的形式與水平的影響[19-20]。OsAMT1.2和OsAMT1.3是根特異性表達(dá)的，但在嫩枝中也能檢測到，前者受銨的誘導(dǎo)，后者受銨的抑制，后者還受光周期的調(diào)控，白天比晚上的表達(dá)水平高很多[19]。Kumar等[20]研究表明AMT1家族基因在秈稻與粳稻中的表達(dá)是有差別的。cDNA芯片分析表明，氮缺乏試驗(yàn)處理后，粳稻品種武運(yùn)粳7中組成型表達(dá)的AMT2.1在根中增強(qiáng)表達(dá)，AMT3.1在嫩枝中明顯下調(diào)表達(dá)，AMT3.2和AMT3.3在根中都明顯增強(qiáng)表達(dá)，嫩枝中只有AMT3.3明顯增強(qiáng)[13]。Li等[21]報(bào)道9個(gè)水稻銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在水稻植株的不同部位都有表達(dá)，包括成熟根、幼嫩根、莖和新老葉片，結(jié)果表明：OsAMT1.1、OsAMT3.2和OsAMT3.3主要在老葉中表達(dá)，根和莖中也表達(dá)；OsAMT1.2和OsAMT1.3主要在根中表達(dá)；OsAMT2.1、OsAMT2.2、OsAMT2.3和OsAMT3.1主要在幼苗中表達(dá)，尤其在新葉中表達(dá)最高，相對于其他莖中表達(dá)的AMT基因，它們是優(yōu)勢表達(dá)的；幼苗期和分蘗期的9個(gè)水稻銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)模式一致，只是分蘗期需要更多的氮營養(yǎng)；氮缺乏處理48 h后，OsAMT1.1、OsAMT1.2、OsAMT3.1、OsAMT3.2和OsAMT3.3的表達(dá)是上調(diào)的，OsAMT1.3的表達(dá)是下調(diào)的；氮缺乏后再恢復(fù)供銨氮或硝酸銨后，OsAMT1.2和OsAMT3.3的表達(dá)是下調(diào)的，OsAMT1.3的表達(dá)是上調(diào)的；氮缺乏后再恢復(fù)供硝態(tài)氮后，OsAMT1.1和OsAMT1.2的表達(dá)是下調(diào)的[21]。

總的來說，水稻AMT的研究在相關(guān)的序列預(yù)測、結(jié)構(gòu)與基本功能以及部分基因的表達(dá)與調(diào)控方面都有了可喜的進(jìn)展，但是每個(gè)基因具體的生物學(xué)功能以及表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍然不太清楚。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測了秈稻明恢86全部預(yù)測的12條AMT基因于缺氮及恢復(fù)供氮處理后的表達(dá)情況，以期為解析水稻每個(gè)AMT基因具體的生物學(xué)功能以及表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以水稻明恢86為材料，采用水培方式。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 水稻營養(yǎng)液配方參照國際水稻所水稻營養(yǎng)液配方配制，略有調(diào)整（表1），其中常規(guī)氮用N1（NH4NO3）、銨氮用N2（NH4Cl）、缺氮處理時(shí)不添加氮元素，其他所有元素都相同。

RNA提取試劑RNA-easy Isolation Reagent、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑HiScript II Q RT SuperMix for qPCR （+g DNA wiper）和熒光定量PCR Mix試劑Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 主要儀器 植物培養(yǎng)使用加拿大CONVIRON公司的A1000PG多功能植物生長箱；核酸定量使用美國Nanodrop公司的NanoDrop 1000超微量分光光度計(jì)；熒光定量PCR反應(yīng)采用美國ABI公司的QuantStudio 3熒光定量PCR儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 水稻種子預(yù)培養(yǎng) 水稻種子于室溫清水浸種48 h，其間換水2～3次，然后控干水分37℃黑暗中催芽1 d，再轉(zhuǎn)移到90 mm培養(yǎng)皿中，用常規(guī)氮N1水培營養(yǎng)液混合培養(yǎng)。

1.3.2 水稻幼苗培養(yǎng)條件及管理 采用多功能植物生長箱培養(yǎng)，參數(shù)設(shè)置為26℃/28℃各12 h，光照12/黑暗12 h，相對濕度為80%，光照強(qiáng)度設(shè)置為3。苗齡7～10 d時(shí)，選取粗壯且生長較一致的幼苗單株轉(zhuǎn)移至水培盒中繼續(xù)水培，水培盒容積約2.5 L。使用常規(guī)氮N1水培營養(yǎng)液培養(yǎng)，pH 5.5，加入硝化抑制劑二氰胺5.89 mg·L-1。每隔3 d換1次營養(yǎng)液[22]。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 苗齡15 d時(shí)進(jìn)行處理1：缺氮處理（N水平為0，其他元素同常規(guī)氮N1營養(yǎng)液），缺氮前樣品為對照組。缺氮處理96 h后，一組樣品進(jìn)行處理2：常規(guī)氮N1營養(yǎng)液處理；另一組樣品進(jìn)行處理3：銨氮N2營養(yǎng)液處理；處理2和3的對照組為缺氮處理96 h后樣品。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)2次[21]。

1.3.4 取樣與水稻cDNA模板合成 參照Li等[21]和趙首萍等[22]的方法并稍有修改，缺氮處理后，分別在0、2、6、48和96 h各取樣1次，根、葉和剩余的莖稈部分分開。樣品經(jīng)液氮速凍后，于-80℃保存?zhèn)溆谩；謴?fù)供氮后分別在2、24 h各取樣1次，樣品同樣處理[21-22]。所有樣品經(jīng)液氮研磨后，用RNA-easy Isolation Reagent（貨號：R701-02）提取，詳細(xì)步驟按說明書操作。所提取的總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度及質(zhì)量，然后使用NanoDrop 1000超微量分光光度計(jì)來定量其濃度。下一步使用約1 ug總RNA進(jìn)行cDNA的合成，使用諾唯贊公司的HiScript II Q RT SuperMix for qPCR （+g DNA wiper），按照產(chǎn)品說明書操作。

1.3.5 測定項(xiàng)目 依據(jù)水稻12條AMT基因?qū)?yīng)的NCBI數(shù)據(jù)庫中的cDNA序列以及內(nèi)參OsActin（X16280.1）的序列（表2）分別設(shè)計(jì)特異引物（表3），送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所獲得的原始數(shù)據(jù)為Ct值，其3個(gè)重復(fù)的平均值即為CtMean，其標(biāo)準(zhǔn)誤差為SD。各樣品的Ct值與對應(yīng)的內(nèi)參的CtMean值之差即為ΔCt，其中對照組的為ΔCt1，處理組的為ΔCt2，則ΔCt2-ΔCt1=ΔΔCt。各基因相對內(nèi)參基因的表達(dá)水平用E表示，則E=2^（-ΔΔCt）。采用EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的確認(rèn)

已合成好的引物用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)水稻樣品作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，通過該反應(yīng)所獲得的擴(kuò)增曲線來判斷引物是否可用于后續(xù)的檢測。同一引物同一模板4次重復(fù)所獲得的擴(kuò)增曲線要滿足盡量靠近，不能有太大的偏離（或者不同重復(fù)的Ct值最高相差小于0.5），且Ct值最好小于35。由圖1可知，預(yù)試驗(yàn)滿足條件的引物選定為后續(xù)試驗(yàn)的引物。

2.2 缺氮情況下水稻各部位AMT基因的表達(dá)情況

總體來看，缺氮處理后，水稻12條AMT基因的相對表達(dá)E值絕大多數(shù)與對照相比都達(dá)到了極顯著水平（P<0.01），其中在根部和莖稈部中的表達(dá)是明顯下調(diào)的（E值小于1），在葉中則大部分是明顯上調(diào)的（E值大于1）。

在根中（表4）：全部AMT基因的相對表達(dá)都是下調(diào)的，只是下調(diào)的幅度與趨勢稍有差別。AMT1.1、AMT1.3、AMT2.2、AMT3.1和AMT5.2的下調(diào)幅度達(dá)到或超過80%（E值<0.2或接近），且隨時(shí)間變化波動不大。AMT2.3和AMT4也下調(diào)明顯，且隨時(shí)間逐步下調(diào)至20%以下或接近于0的極低水平。AMT1.2和AMT2.1的下調(diào)幅度較小，其隨時(shí)間的變化趨勢與基因AMT3.2、AMT3.3和AMT5.1的一致，都是先逐步下調(diào)然后有一個(gè)回調(diào)的波動，總體還是在下調(diào)的范圍內(nèi)變化。

在莖稈中（表5）：基因AMT1.1、 AMT1.2、 AMT1.3、 AMT2.3、 AMT3.3、 AMT4、 AMT5.1和AMT5.2的相對表達(dá)下調(diào)明顯，且隨時(shí)間變化波動不大?；駻MT2.1和AMT2.2的相對表達(dá)先是明顯下調(diào)然后再上調(diào)，波動幅度在2倍以內(nèi)?；駻MT3.1和AMT3.2總體也下調(diào)明顯。

在葉中（表6）：除了基因AMT2.1和AMT3.3的相對表達(dá)是一個(gè)逐步上調(diào)的趨勢，其他AMT基因的相對表達(dá)都是先上調(diào)然后再下調(diào)，上調(diào)的峰值大多數(shù)出現(xiàn)在6 h或以內(nèi)，一般上調(diào)2倍左右，最高AMT5.1可達(dá)11倍以上。96 h以后，基因AMT1.2、AMT2.2、AMT2.3、AMT3.1、AMT4和AMT5.2等6條AMT基因的相對表達(dá)已下降到50%以內(nèi)（E值<0.5），其中最低的AMT2.3幾乎下降為0；而基因AMT2.1、AMT3.3、AMT3.2和AMT5.1則上調(diào)到2.5倍以上。

2.3 缺氮后恢復(fù)供氮情況下水稻各部位AMT基因的表達(dá)情況

總體來看，缺氮再恢復(fù)供氮處理后，水稻12條AMT基因的相對表達(dá)E值絕大多數(shù)與對照相比都達(dá)到了極顯著水平（P<0.01）。除AMT1.2外，水稻其余11條AMT基因在根部的表達(dá)是明顯上調(diào)的（E值>1），且上調(diào)的幅度都較大，一般達(dá)4倍以上，最高AMT1.3可達(dá)600倍以上；在莖稈和葉中則大部分是下調(diào)的（E值<1），或者先上調(diào)然后再下調(diào)，其幅度也比在根部的變化小。

在根中（表7）：恢復(fù)常規(guī)氮N1后，基因AMT1.1、AMT3.1、AMT3.2、AMT3.3、AMT5.1和AMT5.2的相對表達(dá)都是先上調(diào)再下調(diào)，與恢復(fù)氨氮N2后比較，以上基因除AMT1.1外，其他的變化趨勢一致，且后者的變化波動更大。AMT1.2是恢復(fù)常規(guī)氮N1后唯一出現(xiàn)下調(diào)的基因，它在恢復(fù)氨氮N2后卻是緩緩上調(diào)的。AMT1.3、AMT2.1、AMT2.2、AMT2.3和AMT4的相對表達(dá)在恢復(fù)常規(guī)氮N1后都是持續(xù)上調(diào)（E值>1）的，且上調(diào)幅度均在4倍以上，最高達(dá)到294倍以上；與恢復(fù)氨氮N2后比較，前3個(gè)基因的表達(dá)還是持續(xù)上調(diào)，且幅度較大，最高達(dá)到693倍以上，后兩個(gè)基因則是先上調(diào)再下調(diào)，變化幅度相對較小。

在莖稈中（表8）：除了基因AMT1.2、AMT2.1、AMT2.3、AMT3.1和AMT5.1的相對表達(dá)是先有一個(gè)明顯的上調(diào)再下調(diào)，其他AMT基因的相對表達(dá)都是下調(diào)的，只是隨時(shí)間變化波動不大。另外，所有AMT基因的相對表達(dá)變化趨勢似乎與恢復(fù)供氮的氮素類型無關(guān)。

在葉中（表9）：基因AMT1.1、AMT1.2、AMT3.2、AMT3.3和AMT5.2的相對表達(dá)都是下調(diào)的，與恢復(fù)供氮類型無關(guān)，波動幅度也不大?；駻MT1.3和AMT2.2的相對表達(dá)在恢復(fù)N1或N2后都是先下調(diào)再上調(diào)的，一般上調(diào)2倍以上，最高可達(dá)14倍以上，比較而言，恢復(fù)N2后的變動幅度比恢復(fù)N1的變動幅度更大。 基因AMT2.1的相對表達(dá)在恢復(fù)N1或N2后都是先上調(diào)再下調(diào)的，幅度變化較?。?50%）?；駻MT2.3、AMT3.1和AMT5.1的相對表達(dá)在恢復(fù)N1后會有一個(gè)明顯的上調(diào)，至少3倍以上，最高可達(dá)116倍以上，然后下調(diào)；在恢復(fù)N2后，其變化趨勢是相反的，先下調(diào)再上調(diào)，變化幅度也更小，最高不超過5倍。基因AMT4的相對表達(dá)在恢復(fù)N1后是先下調(diào)再上調(diào)的，上調(diào)幅度最高達(dá)4倍；在恢復(fù)N2后基本是下調(diào)的，下調(diào)幅度超過50%。

3 結(jié)論與討論

本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，分析了水稻全部預(yù)測的12條AMT基因在缺氮處理后及缺氮再恢復(fù)供氮處理后的基因表達(dá)情況，為解析每個(gè)AMT基因具體的生物學(xué)功能以及表達(dá)調(diào)控機(jī)制，幫助理解水稻吸收和利用銨態(tài)氮的分子機(jī)制，進(jìn)一步尋找提高水稻氮利用效率，培育水稻氮高效品種提供了理論參考數(shù)據(jù)。

Sonodaet等[19]和Li等[9]報(bào)道AMT1.1是組成型表達(dá)，主要表達(dá)部位是嫩枝和根，其表達(dá)幾乎不受氮缺乏、氮源提供的形式與水平的影響。本研究中，在常規(guī)氮N1營養(yǎng)液培養(yǎng)的水稻中，全部AMT基因在根部、莖稈和葉中都有檢測到基因表達(dá)，只是部分基因在一些組織中的表達(dá)水平極低。這與Li等[21]報(bào)道的9個(gè)水稻銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在水稻植株的不同部位都有表達(dá)部分相一致。可能由于AMT基因的表達(dá)水平普遍不高，早期的研究方法可能受檢測精度的局限，難以全面檢測到。Sonoda等[19]報(bào)道AMT1.2和AMT1.3是根特異性表達(dá)的，但在嫩枝中也能檢測到。前者受銨的誘導(dǎo)，后者受銨的抑制。本研究中，都是全部位表達(dá)的。AMT1.2可能受銨的誘導(dǎo)，但同時(shí)也受硝基氮的影響，缺氮再恢復(fù)常規(guī)氮N1時(shí)，它是下調(diào)的，更換成銨氮N2時(shí)，它是上調(diào)的。本研究中缺氮再恢復(fù)供氮后AMT1.3在根部和葉中都是上調(diào)的，根部的上調(diào)幅度比葉中更大，恢復(fù)N2比恢復(fù)N1的上調(diào)幅度更大，表明AMT1.3也是銨誘導(dǎo)的，且它的誘導(dǎo)效率比AMT1.2更高。缺氮處理后，粳稻中的AMT2.1、AMT3.1、AMT3.2和AMT3.3的表達(dá)變化與本研究秈稻中的不一致

[23]，這有可能是供試材料的品種差異影響的。從本研究中的結(jié)果來看，可能是與取樣時(shí)間和取樣頻次也有關(guān)，早期的研究多數(shù)是終點(diǎn)取樣或者間隔時(shí)間太長[9，17，19-21]。缺氮或缺氮再恢復(fù)供氮后，大多數(shù)基因的表達(dá)變化可能是一個(gè)隨時(shí)間波動變化的過程，由于取樣時(shí)間點(diǎn)還不夠多不夠密，有可能影響了結(jié)果的判斷，后續(xù)可以考慮引入轉(zhuǎn)錄組分析等方法。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）

收稿日期：2023-03-26

作者簡介：胡太蛟，男，1975年生，博士，助理研究員，主要從事植物基因工程研究。

*通信作者：宋亞娜，女，1973年生，研究員，主要從事土壤微生物研究。

基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃公益類項(xiàng)目（2019R1027-2）；福建省人民政府、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院“5511”協(xié)同創(chuàng)新工程（XTCXGC2021002）。