基于網(wǎng)絡藥理學與分子對接探討紫蘇預防心血管疾病的作用機制

李旻玥，蔣朝芬，鐘勻，蘇正偉，李興玉，

1.云南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學理學院，云南 昆明650201

紫蘇是唇形科草本植物[1-2]，是一種傳統(tǒng)藥食同源植物，已列入《藥食同源物品名錄》[3-4]。2020 年版《中華人民共和國藥典》中記載紫蘇性溫、味辛[5]。其藥用價值和食用方法在《本草綱目》有記載[6-7]。我國現(xiàn)已研制出10 多種含有紫蘇的中藥制劑[2]，此外，紫蘇還是一種保健品。

紫蘇的化學成分主要有黃酮類、揮發(fā)油、脂肪酸類、香豆素類等[8-9]。紫蘇在臨床上可用于治療尋常疣、魚蟹中毒[10]，可解熱、降血脂等[11]。長期食用還可預防和治療心血管疾?。–VD）[12-14]。

CVD 是一種常見慢性疾病之一。高血壓病、冠心病等都屬于CVD，CVD 患者會出現(xiàn)頭暈、心悸等癥狀。CVD 發(fā)病隱匿、并發(fā)癥嚴重，嚴重影響人們的生活質(zhì)量[15-16]。在我國，CVD 的患病率逐漸上升且年輕化，根據(jù)《中國心血管病報告2018》概要[17]，我國CVD 患病人數(shù)近3億，若不采取措施，在今后10 年患病率和病亡率將會急劇增長。全球CVD 的形勢也很嚴峻，嚴重危及患者家庭和社會[18]。

中藥紫蘇在治療CVD 方面的安全性高，有顯著療效，雖然紫蘇的多種成分已有研究，但紫蘇的全方位研究文獻較少，藥理作用分析不夠完善。因此，本研究運用網(wǎng)絡藥理學探究紫蘇的活性成分及其治療CVD 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 紫蘇活性成分及其作用靶標以“紫蘇”為關鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）（https：//tcmsp-e.com/）中檢索得到紫蘇的全部化學成分及靶點，以口服生物利用度（OB）≥20%，類藥性（DL）≥0.10[19]為條件進一步篩選紫蘇的有效化合物及其作用靶點。

1.2 CVD 靶點以“Cardiovascular”or“Cardiovascular Neurosis” or “Atherosclerosis” or “Myocardial Infarction”or“Cardiopathy”為關鍵詞在人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards（https：//www.genecards.org/）和人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）（https：//www.omim.org/）中檢索，刪除重復項得到CVD 的相關靶基因。

1.3 藥物-疾病共同靶點將紫蘇活性成分的作用靶點與CVD 靶點進行交集，導入Venny 2.1 在線軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）中制作韋恩圖，得到共同靶基因。

1.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡的構建及拓撲分析在STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）中對交集靶點進行檢索，物種設置為“Homo sapiens”，其他條件默認，獲得PPI 初步網(wǎng)絡。然后獲取靶點相互作用的網(wǎng)絡關系數(shù)據(jù)，將其導入Cytoscape 軟件（版本3.8.2）制作PPI 網(wǎng)絡圖。并利用Cytoscape 軟件中cytoHubba 插件獲得degree（度值）排名前10 的核心靶點[20]。

1.5 “成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡構建在Cytoscape軟件構建“成分-靶點-通路-疾病”關系網(wǎng)絡，并對其進行網(wǎng)絡可視化。其中節(jié)點表示紫蘇活性成分、靶點、通路和疾??；邊表示各節(jié)點之間的相互關系。

1.6 GO 功能富集分析通過STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）獲得GO 功能富集分析數(shù)據(jù)；再通過Cytoscape 軟件中的“BiNGO”插件獲得GO 功能富集相關數(shù)據(jù)的P-value 值。使用線上制圖工具微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）繪制GO 功能富集分析氣泡圖。

1.7 KEGG 富集分析利用STRING 數(shù)據(jù)庫獲得和KEGG 通路富集分析的數(shù)據(jù)，根據(jù)富集的基因數(shù)目選取最多的前20 條信號通路，利用線上制圖工具微生信平臺繪制KEGG 氣泡圖。

1.8 分子對接驗證選取成分-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡圖中degree 值較高的4 個關鍵化合物和KEGG氣泡圖中最重要的前4 條信號通路對應的關鍵蛋白，通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得活性成分的2D 結構，用Chem 3D 進行能量最小化處理后作為配體，運用PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載關鍵靶點的3D 結構，將其導入Pymol 軟件進行處理后作為受體。利用AutoDock 軟件進行分子對接，并運用Pymol 軟件將對接結果進行可視化分析。

2 結果與分析

2.1 紫蘇有效成分及靶點篩選見表1。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫查詢312 種紫蘇化學成分，根據(jù)OB≥20%，DL≥0.10 的條件篩選后有41 個活性成分。通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫中Related Targets 獲得主要活性成分對應靶點2 481個，去除重復值后用Perl 軟件以Symbol 形式標準化后得94 個靶點。

表1 紫蘇活性成分

2.2 CVD 靶點篩選通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索得到15 227 個靶基因，通過OMIM 數(shù)據(jù)庫檢索得到36 個靶基因，數(shù)據(jù)整合并刪除重復值后得到15 138 個CVD 相關靶蛋白基因。

2.3 藥物-疾病共同靶點見圖1。通過Venny 2.1將94 個紫蘇藥物靶點和15 138 個CVD 靶點交集后獲得藥物-疾病共同靶點89 個。

圖1 紫蘇活性成分靶點與CVD 靶點交集

2.4 PPI 網(wǎng)絡構建見圖2～3。將89 個共同靶點提交至STRING 平臺，研究物種設置為“Homo sapiens”，分析獲得初步網(wǎng)絡后，再獲取相互作用的網(wǎng)絡關系的靶點數(shù)據(jù)，將其導入Cytoscape 軟件，繪制PPI 網(wǎng)絡圖，該網(wǎng)絡圖包含節(jié)點86個，邊848 條。獲得PPI 網(wǎng)絡圖后，利用Cytoscape 軟件中cytoHubba 插件獲得degree 排名前10 的關鍵靶點，分別為CASP3、CTNNB1、MYC、ALB、HIF1A、CCND1、FOS、VEGFA、CASP8、MDM2。上述靶點在PPI 網(wǎng)絡圖中發(fā)揮了重要作用，可能為紫蘇與CVD 關聯(lián)的關鍵靶點。

圖2 靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡圖

圖3 PPI 網(wǎng)絡中的高密度子網(wǎng)

2.5 “成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡圖見圖4。以上述得到的41 個紫蘇活性成分、246 靶點、30 條關鍵通路和CVD 為基礎構建“Node”與“Style”文件，導入到Cytoscape 構建“成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡。利用插件Network Analyzer 分析網(wǎng)絡的拓撲參數(shù)，共166 節(jié)點，659 條邊，平均節(jié)點度為7.94。由圖可知一個活性成分和多個靶點及通路相連，一個靶點連接多個活性成分和靶點，這說明紫蘇治療CVD可能是多成分、多靶點、多通路的作用結果。化學成分木犀草素、芹菜素、β-胡蘿卜素和β-谷甾醇連接度最高，鑒定為主要活性成分；與活性化合物連接度最高的靶點有CASP3、CTNNB1 等靶點，鑒定為關鍵作用靶點；與關鍵靶點連接度最高的有Pathways in cancer（P1）、Prostate cancer（P2）等，鑒定為重要生物學通路。

圖4 紫蘇治療CVD 的成分-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡

2.6 GO 功能富集分析見圖5～7。將89 個共同靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫并導出GO 功能富集數(shù)據(jù)，進行分子功能（MF）、生物過程（BP）和細胞組分（CC）分析，篩選P-value 值前10 條利用微生信平臺繪制氣泡圖。GO 富集分析結果顯示，紫蘇治療CVD 共涉及85 個與MF 相關過程，富集度排前10 主要集中于結合、蛋白質(zhì)結合等方面；936 條BP 通路，排在前10 其中主要生物過程有化學反應、有機物反應等；共有59 條CC 過程，富集度前10 主要涉及蛋白質(zhì)復合物、細胞內(nèi)細胞器腔等。

圖5 GO 分子功能（MF）富集分析

圖6 GO 生物過程（BP）富集分析

圖7 GO 細胞組成（CC）富集分析

2.7 KEGG 富集分析見圖8。主要有Pathways in cancer、Prostate cancer 等。通過KEGG 通路富集分析條形圖直觀地展現(xiàn)了每條信號通路中紫蘇抗CVD靶點的富集比，圖中縱坐標表示富集通路的名稱，橫坐標表示富集的基因數(shù)目。

圖8 KEGG 通路富集分析

2.8 分子對接見表2、圖9。從PubChem 數(shù)據(jù)庫中下載木犀草素、芹黃素、β-胡蘿卜素和β-谷甾醇的2D 結構。從PDB 數(shù)據(jù)庫中下載CCND1、CASP3、CTNNB1、MYC、HIF1A、VEGFA、FOS、MDM2 和CASP8 蛋白的PDB 文件，處理后用AutoDock Vina 進行分子對接。能量越低，配體與受體結合的構象越穩(wěn)定，發(fā)生作用的可能性越大。當結合能絕對值＞4.25 表示分子與靶點具有一定的結合能力，絕對值＞5.0 表示結合能力較強，絕對值＞7.0 表示結合能力很強[21]。

圖9 紫蘇活性成分與關鍵靶點對接

表2 紫蘇活性成分與關鍵靶點的最低結合能

分子對接的最低結合能結果顯示，CCND1、MDM2 與芹黃素、木犀草素有很強的結合活性；CASP3 與芹黃素、木犀草素、β-胡蘿卜素有較強的結合活性，與β-谷甾醇有一定的結合活性；VEGFA與芹黃素、木犀草素有較強的結合活性；CASP8 與β-胡蘿卜素、β-谷甾醇有較強的結合活性；HIF1A、FOS 與芹黃素有很強的結合活性；CTNNB1與β-胡蘿卜素有較強的結合活性；MYC 與β-胡蘿卜素有很強的結合活性。

3 討論

CVD 已成為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和致死率最高的疾病之一，全球約有1/3 的人死于CVD[22]。國內(nèi)外研究表明，中醫(yī)藥可以從患者的具體病癥出發(fā)，保護靶器官，預防多種并發(fā)癥，能很好地預防CVD 的一級、二級、三級病癥，所以中醫(yī)在防治CVD 方面有獨特的優(yōu)勢，體現(xiàn)了“治未病”的特色[23]。

本研究篩選得到紫蘇治療CVD 的活性成分4個，分別為β-谷甾醇、木犀草素、β-胡蘿卜素和芹黃素。關鍵作用靶點為CCND1、CASP3、CCNNB1、MDM2、VEGFA、HIF1A、MYC、FOS 和CASP8。重要生物學路徑為Pathways in cancer、PI3K-Akt、Kaposi′s sarcoma-associated herpes virus infection、Prostate cancer。核心作用網(wǎng)絡如圖10 所示，紫蘇治療CVD 具有多成分-多靶點-多通路的特點，4 個主要活性成分作用于9 個關鍵靶點通過4 條重要生物學路徑發(fā)揮治療作用。其中4 個主要成分的結構式如圖11 所示。

圖10 紫蘇治療CVD 的核心網(wǎng)絡

圖11 紫蘇的主要活性成分

芹黃素是一種黃酮類化合物，別名洋芹素、芹菜素。國內(nèi)外研究證明，芹黃素有很多生物活性，可以抗腫瘤、保護心腦血管等。芹黃素通過抑制血小板花生四烯酸代謝的途徑來改善動脈粥樣硬化和血栓的形成[24]。β-胡蘿卜素也稱葉紅素，屬于類胡蘿卜素，可以抗氧化、抗癌和預防CVD，因此在食品生產(chǎn)中常用作添加劑[25]。木犀草素是黃酮類化合物，具有多種藥理活性，可以消炎、降尿酸等，臨床上用于治療CVD[26]。β-谷甾醇具有祛痰、抑制腫瘤等作用，用于慢性氣管炎、動脈粥樣硬化癥[27]等。這4 種活性成分對治療CVD 都有一定的療效，紫蘇可能通過以上4 種成分防治CVD，說明本研究的預測結果有一定的可行性。

CASP3 即胱天蛋白酶3，可以發(fā)起細胞內(nèi)源性凋亡信號，與CVD 的發(fā)生有著密切的關系。細胞周期蛋白1（CCND1），可以調(diào)控細胞周期的進程，促進細胞分裂。VEGFA 由多種細胞分泌，被認為是一種重要的內(nèi)皮生長因子以及血管通透性的調(diào)節(jié)因子。CTNNB1、MYC、FOS、CASP8 都屬于原癌基因。本研究表明紫蘇藥物可能作用于這些靶點調(diào)控CVD。

PI3K-Akt 信號通路與細胞內(nèi)磷脂酰肌醇有關，關系著細胞的分化、增殖和凋亡。Pathways in cancer、Prostate cancer 等都和CVD 有著一定的關系，不好的飲食習慣會刺激FOS、CASP8 等原癌基因的表達，誘發(fā)癌癥。研究表明，CVD 和癌癥有著密切的關系，二者會相互促進加重[28]，因此這些通路是主要的信號通路。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學初步揭示了紫蘇在預防和治療CVD 方面具有多成分、多靶點、多通路的協(xié)同作用特點。不僅為紫蘇的臨床應用提供了理論依據(jù)，為將來相關研究提供了基礎，而且為傳統(tǒng)中藥材作用機制的研究提供新的思路。