蠲痹顆粒醇提物抑制Th17細(xì)胞表達(dá)治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制研究

吳招，鄒楠婷，顧茜蘭，楊海浩，應(yīng)賽，李小絲，祁燕，彭江云，萬(wàn)春平

云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明650500

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是臨床常見的慢性、全身性、自身免疫性疾病，病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)部位產(chǎn)生軟骨侵蝕、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜組織增生等而導(dǎo)致軟骨和骨的破壞，引起關(guān)節(jié)畸形[1]。目前治療RA 的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥物主要有抗風(fēng)濕藥、非甾體類抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等，也采用基因治療和免疫治療[2]。溫陽(yáng)散寒除濕方（蠲痹顆粒）是云南省名老中醫(yī)吳生元教授根據(jù)扶陽(yáng)理論，針對(duì)RA 的臨床治療總結(jié)出的效驗(yàn)方，主要由川芎、附子、五加皮、桂枝等組成，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)散寒、通絡(luò)止痛的作用，主要治療寒濕痹阻型RA。前期臨床研究證實(shí)，蠲痹顆粒（JBKL）能改善寒濕痹阻型RA 患者臨床癥狀，降低紅細(xì)胞沉降率（ESR）、C-反應(yīng)蛋白（CRP）、類風(fēng)濕因子（RF）等指標(biāo)，具有良好的臨床療效；此外，前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果亦表明，蠲痹顆粒具有較好的鎮(zhèn)痛作用和抗炎作用[3-4]。

Th17 細(xì)胞是一類與白細(xì)胞介素-23（IL-23）密切相關(guān)的Th 細(xì)胞亞群，其主要分泌IL-21，IL-17F，IL-17A 等。Th17 細(xì)胞主要介導(dǎo)機(jī)體自身免疫性反應(yīng)、炎性反應(yīng)等的發(fā)生與發(fā)展，具有高致病性[5]。前期研究結(jié)果顯示，RA 患者體內(nèi)的Th17 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加，與RA 的發(fā)展密切相關(guān)[6-7]。因此，本研究以Th17 細(xì)胞分化為切入點(diǎn)，研究蠲痹顆粒醇提物通過(guò)調(diào)控Th17 細(xì)胞而介導(dǎo)治療RA 的作用機(jī)制，揭示蠲痹顆粒醇提物治療寒濕痹阻型RA 的內(nèi)在規(guī)律及臨床應(yīng)用的現(xiàn)代生物學(xué)特征。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物7～8 周齡SPF 級(jí)雄性DBA/1 小鼠，體質(zhì)量（20.00±2.00）g，購(gòu)買于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司[SCXK（京）2019-0010]。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物房，飼料和水消毒后由動(dòng)物自由攝取，環(huán)境溫度（20±2）℃，相對(duì)濕度（50±5）%，12 h 晝夜循環(huán)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)條例進(jìn)行。

1.2 蠲痹顆粒浸膏醇提物的制備稱取289.4 g 蠲痹顆粒，加水溶解混勻后加入乙醇，使含醇量達(dá)到80%，靜置過(guò)濾，減壓回收乙醇，得浸膏。將浸膏放入真空干燥箱干燥2 d后，獲固體浸膏，得蠲痹顆粒浸膏醇提物3.658 g。蠲痹顆粒醇提物保存于4 ℃冰箱備用。

1.3 試劑及主要儀器牛Ⅱ型膠原、弗氏完全佐劑（CFA）（Sigma公司）；APC-小 鼠IL-17A 抗體（TC11-18H10）、FITC-小鼠IFN-γ 抗體（XMG1.2）、PE-Cy7 小鼠CD4 抗體（RM4.5）、PE-小鼠Foxp3（MF23）抗體（BD PharMingen 公司）；RPMI-1640 培養(yǎng)基（GibcoBRL 公司）；其他試劑均為分析純。流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Biosciences）、離心機(jī)（德國(guó)Thermo Scientific Heraeus）、石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡儀器有限公司）、二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo-fisher）；組織包埋機(jī)、烘片機(jī)、正置顯微鏡、全自動(dòng)組織脫水機(jī)（德國(guó)萊卡儀器有限公司）。

1.4 關(guān)節(jié)炎模型的建立、分組及給藥參照文獻(xiàn)[8]構(gòu)建DBA/1 小鼠關(guān)節(jié)炎（CIA）模型，具體方法為：牛Ⅱ型膠原加入醋酸，使牛Ⅱ型膠原與等體積的弗氏完全佐劑（CFA）充分乳化，DBA/1 小鼠麻醉后，對(duì)其尾根部致敏。1 周后以相同劑量進(jìn)行第2 次免疫攻擊，進(jìn)行第2 次免疫攻擊時(shí)，肉眼觀察小鼠四肢關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度，并進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分等級(jí)和標(biāo)準(zhǔn)為：1 級(jí)為正常、2 級(jí)為出現(xiàn)趾關(guān)節(jié)發(fā)紅或紅腫、3 級(jí)為踝關(guān)節(jié)以下中度紅腫、4 級(jí)為包括膝關(guān)節(jié)在內(nèi)的嚴(yán)重紅腫、包括膝關(guān)節(jié)在內(nèi)的完全紅腫，關(guān)節(jié)變形、殘廢[9]。評(píng)分大于或等于2 級(jí)時(shí)說(shuō)明小鼠造模成功。模型小鼠分為CIA 模型組（Model 組）和蠲痹顆粒醇提物干預(yù)組（JBKL 組），每組10 只。JBKL 組灌胃給予蠲痹顆粒醇提物21 mg/kg（相當(dāng)于生藥1.66 g/kg），Model 組給予相同劑量的0.9%氯化鈉溶液作為對(duì)照。給藥劑量按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人用藥量的換算公式計(jì)算得出。每天給藥1 次。

1.5 細(xì)胞制備免疫20 d后，處死小鼠，消毒后取出脾臟和淋巴結(jié)。用載玻片磨碎脾臟和淋巴結(jié)，培養(yǎng)基沖洗過(guò)膜，離心后棄去上清，彈勻，加入紅細(xì)胞裂解液，混勻，靜置后加入培養(yǎng)基，離心后棄去上清。再加入培養(yǎng)基，過(guò)膜，離心。培養(yǎng)基冼2 次后，加入含血清的RPMI-1640，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并將細(xì)胞調(diào)至所需濃度。

1.6 組織病理學(xué)檢測(cè)小鼠處死后，取其后肢，福爾馬林固定，脫鈣后進(jìn)行石蠟包埋，切片（5 μm 厚度），蘇木精-伊紅（HE）染色后顯微鏡下觀察，按照關(guān)節(jié)組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定。見表1。

表1 關(guān)節(jié)組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 分

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色：調(diào)至所需濃度的小鼠脾淋巴細(xì)胞與刺激劑于CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)4 h，收集培養(yǎng)后的細(xì)胞，洗液清冼2次，加入相應(yīng)抗體并進(jìn)行表面染色。染色結(jié)束后，進(jìn)行固定和穿膜，加入熒光標(biāo)記的抗IL-17 抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。對(duì)于Treg 胞內(nèi)熒光染色，按胞內(nèi)染色方法染色，無(wú)需加入刺激劑，流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞并進(jìn)行分析。

1.8 熒光定量PCR 檢測(cè)Th17 細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)抽提小鼠脾淋巴細(xì)胞，提取總RNA后，操作合成cDNA。然后應(yīng)用SYBR GreenI 嵌合熒光法在實(shí)時(shí)定量PCR 儀進(jìn)行Th17 細(xì)胞相關(guān)基因（IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-23p19、IFN-γ 和RORγt）表達(dá)檢測(cè)。PCR反應(yīng)程序結(jié)束后，設(shè)置β-actin 為內(nèi)參基因，計(jì)算出2 組基因表達(dá)差異倍數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，即2-△△Ct±標(biāo)準(zhǔn)差值。目的基因特異性引物序列見表2。

表2 目的基因特異性引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用GraphPad Prism、SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蠲痹顆粒醇提物對(duì)CIA 模型小鼠關(guān)節(jié)炎組織病理的影響見圖1。在CIA 模型組小鼠中觀察到明顯的關(guān)節(jié)炎病理表現(xiàn)：產(chǎn)生滑膜組織增生、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、軟骨和骨的侵蝕等，見圖1A；而與Model 組比較，JBKL 組小鼠關(guān)節(jié)滑膜炎和關(guān)節(jié)損傷明顯減輕，見圖1B。與Model 組比較，JBKL 組關(guān)節(jié)組織學(xué)評(píng)分降低（P＜0.05），見圖1C。

圖1 蠲痹顆粒醇提物對(duì)CIA 模型小鼠關(guān)節(jié)炎組織病理的影響

2.2 蠲痹顆粒醇提物對(duì)CIA 模型小鼠調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的影響見圖2。與Model 組比較，JBKL 組Foxp3+CD4+T（調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞）表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.05）。

圖2 蠲痹顆粒醇提物對(duì)CIA 模型小鼠調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的影響

2.3 蠲痹顆粒醇提物對(duì)CIA 模型小鼠脾淋巴細(xì)胞Th17 表達(dá)的影響見圖3。與Model 組比較，JBKL組小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-17+CD4+比例降低（P＜0.05），Treg/Th17 比值增加（P＜0.05）。

圖3 蠲痹顆粒醇提物對(duì)CIA 模型小鼠脾淋巴細(xì)胞Th17 表達(dá)的影響

2.4 蠲痹顆粒醇提物對(duì)CIA 模型小鼠Th17 相關(guān)基因表達(dá)的影響見圖4。JBKL 組小鼠脾淋巴細(xì)胞IL-17A、IL-23p19、IL-21、IFN-γ 的mRNA 的表達(dá)水平低于Model組，Th17 特異轉(zhuǎn)錄因子RORγt 的轉(zhuǎn)錄水平低于Model 組（P＜0.05）。

圖4 蠲痹顆粒醇提物對(duì)CIA 模型小鼠Th17 細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

RA 是主要以關(guān)節(jié)破壞性、關(guān)節(jié)侵蝕性及關(guān)節(jié)滑膜炎為病變特征的全身性自身免疫性疾病，臨床表現(xiàn)為侵蝕性、對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎性病變。伴隨著疾病的發(fā)展，不僅影響患者的心臟、腎臟、肺部等器官，且對(duì)患者造成心理壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[10]。疾病的發(fā)生主要與機(jī)體內(nèi)T 細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)[11-12]。T 淋巴細(xì)胞主要分化為以Treg、Th17 為代表的兩個(gè)細(xì)胞亞群。最新研究表明，Treg、Th17 細(xì)胞的功能和分化過(guò)程具有相同之處，兩者卻又相互對(duì)抗。Treg 細(xì)胞主要分泌抑炎細(xì)胞因子，對(duì)于RA 的發(fā)病起免疫抑制作用；Th17 細(xì)胞主要分泌促炎細(xì)胞因子，對(duì)于RA 的發(fā)病起促炎作用。Treg 細(xì)胞/Th17 細(xì)胞比例之間的平衡與失調(diào)影響著RA 病情的轉(zhuǎn)移和發(fā)展[13-15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蠲痹顆粒醇提物能夠改善CIA 模型小鼠關(guān)節(jié)炎病理表現(xiàn)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，蠲痹顆粒醇提物干預(yù)后能下調(diào)Th17 細(xì)胞表達(dá)，上調(diào)Treg 細(xì)胞表達(dá)水平，即維持著Treg 細(xì)胞/Th17 細(xì)胞之間的平衡，下調(diào)促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素IL-17A 表達(dá)，與前期研究結(jié)果一致[16]。

在Th17 的產(chǎn)生和分化過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子RORγt 起重要調(diào)控作用[17-18]。基于此，本研究進(jìn)一步應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 深入研究蠲痹顆粒醇提物調(diào)控Th17 細(xì)胞分化的分子機(jī)制。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示，蠲痹顆粒醇提物藥物干預(yù)后顯著下調(diào)Th17 相關(guān)基因IL-17A、IL-23p19、IL-21、IFN-γ及轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA 表達(dá)水平。綜合上述研究結(jié)果推測(cè)，蠲痹顆粒醇提物可能通過(guò)干預(yù)Th17 分化所需的關(guān)鍵細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，阻止了CD4+T 細(xì)胞向高致病性Th17 細(xì)胞分化，維持Treg 細(xì)胞/Th17 細(xì)胞比例之間平衡，從而介導(dǎo)對(duì)RA 的治療作用。

本研究不僅為扶陽(yáng)學(xué)派吳生元教授運(yùn)用扶陽(yáng)理論治療RA 提供一定的臨床科學(xué)基礎(chǔ)，同時(shí)也發(fā)展并豐富了中醫(yī)治療痹證理論的科學(xué)內(nèi)涵。