葛根素通過mTOR信號通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化治療慢性術(shù)后痛實驗研究

陸培春，潘鵬

昆山市中醫(yī)醫(yī)院麻醉科，江蘇 昆山215300

慢性術(shù)后疼痛已被描述為一個主要的公共問題[1]，患病率在5%～85%[2]，該比率取決于手術(shù)類型和測量工具[3]。但目前來看，慢性術(shù)后疼痛的管理，仍無法得到滿意的效果，越來越多的工作正在努力探索新的潛在目標(biāo)或鎮(zhèn)痛策略。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生表型和功能的改變，導(dǎo)致了慢性痛的產(chǎn)生和發(fā)展[4]。小膠質(zhì)細(xì)胞（MG）活化后具有M1 和M2兩種表型，分別有促炎、抑炎不同的功能[5]。但通過調(diào)節(jié)MG 表型轉(zhuǎn)化，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路可發(fā)揮其潛在的抑制中樞炎性反應(yīng)的作用[6]。葛根素是葛根的主要成分，已被證明在多種疾病中有效抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和（或）膠質(zhì)細(xì)胞的激活[7-8]。筆者推測葛根素可以通過mTOR 抑制MG 活化，本研究旨在通過建立慢性術(shù)后疼痛模型來研究葛根素對慢性疼痛的作用及其相關(guān)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠由南通大學(xué)實驗動物中心提供，倫理委員會批準(zhǔn)（編號：S2022118-009），體質(zhì)量200～250 g，鼠齡8～10 周。50 只大鼠被隨機(jī)分成對照組、假手術(shù)組、模型組、葛根素組、mTOR 抑制劑組5組，每組10 只。大鼠都被飼養(yǎng)在適宜的環(huán)境當(dāng)中。

1.2 大鼠皮膚/肌肉切口牽拉（SMIR）模型的制備及處理按照Flatters SJ[9]的方法建立大鼠SMIR 模型，對照組：不做任何處理。假手術(shù)組：戊巴比妥鈉30 mg/kg 麻醉大鼠后，無菌條件下在右后肢隱靜脈內(nèi)側(cè)3～4 mm處，切割皮膚1.5～2 cm 后縫合。模型組：在假手術(shù)組基礎(chǔ)上暴露淺層肌肉，避開隱神經(jīng)，將撐開器頭部放入淺層肌肉下?lián)伍_至2 cm，暴露內(nèi)收肌筋膜，持續(xù)1 h（見圖1A）后縫合。葛根素組：在模型組基礎(chǔ)上，參照文獻(xiàn)[10]自建模第1 天開始腹腔注射葛根素（100 mg/kg），連續(xù)給藥7 d。mTOR 抑制劑組：在模型組基礎(chǔ)上，連續(xù)7 d 腹腔注射mTOR 抑制劑（雷帕霉素，1 mg/kg[11]）。

圖1 SMIR 后不同時間點MWT

1.3 機(jī)械性刺激縮爪閾值（MWT）檢測按照Dixon WJ[12]方法測定MWT，von Frey filament 纖毛刺激儀（美國North Coast Medical 公司）按照剛度力的遞增順序（0.16～26 g）垂直刺激術(shù)側(cè)后爪的足底中部區(qū)域，以von Frey 輕微彎曲并保持約6～8 s 作為標(biāo)準(zhǔn)，出現(xiàn)縮爪、舔爪及爪子急劇撤回等現(xiàn)象視為陽性反應(yīng)，否則為陰性。從0.16 g 開始，升降法記錄5次，有2 次或2 次以上的反應(yīng)視為機(jī)械性觸誘發(fā)痛。若無則用相鄰的大1 級力度刺激，如出現(xiàn)2 次及以上的陽性反應(yīng)則給予相鄰小1 級力度的刺激，再連續(xù)測定5次，間隔30 s。對照閾值表查閾值，單位為“g”。

1.4 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測mTOR、pmTOR 蛋白表達(dá)麻醉后收集術(shù)后第7 天L3～5腰膨大，全細(xì)胞裂解試劑盒（上海生工公司）用于組織樣品蛋白提取。將100 μg 總蛋白加載到相應(yīng)濃度的凝膠泳道上（上海生工公司）進(jìn)行分離。然后用轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（美國伯樂公司）將蛋白轉(zhuǎn)移到0.45 mm PVDF 膜上。在室溫下將膜放在含有5.0%脫脂奶粉的Tris 緩沖鹽水和Tween-20 封閉溶液中孵育2 h，然后在一抗封閉溶液中4.0 ℃下孵育過夜：mTOR（1∶1 000，美國CST 公司）、p-mTOR（1∶1 000，美國CST 公司）和GAPDH（1∶5 000，美國Sigma 公司）。用Tris緩沖鹽水和Tween 20（10 min/次）洗膜3次，室溫下用羊抗兔二抗（1∶5 000，美國Jackson 公司）孵育2 h。洗滌后，使用Tanon 2500 凝膠成像系統(tǒng)和超敏ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（愛必信生物科技公司）檢測。使用Image J 分析結(jié)果，計算條帶的灰度值，GAPDH 作為內(nèi)參。

1.5 免疫熒光染色法觀察mTOR 定位及MG 激活選取術(shù)后第7 天大鼠麻醉后，收集L3～5腰膨大，4%多聚甲醛固定，蔗糖溶液脫水。切成6 μm 的厚度冰凍切片。室溫下用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，1%TritonX-100 通透1 h，5%牛血清封閉2 h，用1%血清稀釋一抗。切片與mTOR（1∶100，美國CST 公司）、NeuN（1∶100，美國CST 公司）、GFAP（1∶100，美國CST 公司）和Iba1（1∶100，英國abcam 公司）孵育。4.0 ℃過夜，用PBS 洗滌10 min×3 次。用PBS稀釋二抗，Cy3-山羊抗兔IgG（1∶1 000，美國Jackson公司）和FITC-山羊抗小鼠IgG（1∶1 000，美國Jackson 公司）。室溫下避光孵育2 h，PBS 沖洗15 min×3次，封片。熒光顯微鏡進(jìn)行拍照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS22.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。行為學(xué)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析。Image J 軟件分析蛋白質(zhì)印跡特異性條帶密度以及免疫熒光強度值，多組間比較采用單因素方差分析，先進(jìn)行正態(tài)性與方差齊性檢驗。若方差齊，兩兩比較采用LSD 法。若方差不齊，先行Welch（W）校正檢驗，然后用Dunnett′s T3法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗至少重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 SMIR 后不同時間點MWT見圖1。按照Flattes SJ等[9]方法成功復(fù)制和建立了SMIR 模型（圖1A），檢測MWT。對照組、假手術(shù)組、模型組術(shù)前MWT 基礎(chǔ)值分別為（23.42±1.12）g、（23.16±1.14）g和（22.76±0.87）g，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與基礎(chǔ)值比較，假手術(shù)組痛閾無明顯變化，而模型組在術(shù)后第1、3、7、14 天痛閾呈進(jìn)行性下降（P＜0.05）；與對照組和假手術(shù)組比較，模型組顯著降低（P＜0.05）（圖1B）。

2.2 蛋白質(zhì)印跡檢測大鼠脊髓中mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)見圖2。與對照組相比，假手術(shù)組和模型組術(shù)后7 d 脊髄中mTOR 表達(dá)無升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組、假手術(shù)組相比，模型組術(shù)后7 d 脊髄中p-mTOR 表達(dá)增加（P＜0.05）。

圖2 大鼠腰段脊髓背角mTOR、p-mTOR 蛋白表達(dá)

2.3 免疫熒光檢測mTOR 蛋白在大鼠脊髓中定位見圖3。為研究mTOR 在大鼠脊髓中具體表達(dá)于哪些細(xì)胞中，選取模型組術(shù)后第7 天的脊髓組織切片，將mTOR 分別與脊髓中各類細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)。結(jié)果顯示：mTOR 與Iba1 共定位，與GFAP和NeuN 不定位。

圖3 mTOR 在脊髓中定位（×200，標(biāo)尺50 μm）

2.4 腹腔注射葛根素、雷帕霉素后大鼠行為學(xué)變化見圖4。葛根素、雷帕霉素給藥后檢測MWT。假手術(shù)組、模型組、葛根素組和抑制劑組術(shù)前MWT基礎(chǔ)值分別為（23.16±1.14）g、（22.76±0.87）g、（23.24±1.02）g 和（22.58±0.64）g，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組術(shù)后3 d、7 d、14 d 比較，葛根素組和抑制劑組MWT 顯著升高（P＜0.05）；表明葛根素、雷帕霉素可提高SMIR 大鼠痛覺閾值，緩解機(jī)械性痛覺過敏。

圖4 腹腔注射葛根素、雷帕霉素后大鼠行為學(xué)變化

2.5 腹腔注射葛根素后mTOR、p-mTOR 蛋白表達(dá)變化見圖5。與假手術(shù)組、模型組相比，葛根素組術(shù)后7 d 脊髄中mTOR 表達(dá)無升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與假手術(shù)組、模型組相比，葛根素組術(shù)后7 d 脊髄中p-mTOR 表達(dá)降低（P＜0.05），提示葛根素可以降低mTOR 磷酸化。

圖5 腹腔注射葛根素后mTOR、p-mTOR 蛋白表達(dá)變化

2.6 腹腔注射葛根素、雷帕霉素抑制脊髓中MG 活化見圖6。免疫熒光染色方法檢測MG 特異性標(biāo)記物Iba1 的表達(dá)。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脊髓背角Iba1 陽性面積顯著增加（P＜0.05）；與假手術(shù)組比較，葛根素組、mTOR 抑制劑組Iba1 陽性面積增加（P＜0.05）。與模型組相比，葛根素組、mTOR 抑制劑組Iba1 陽性面積顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

慢性疼痛在治療上的選擇有限，是值得學(xué)者們重點研究的問題。阿片類藥物仍然是慢性疼痛的常規(guī)治療方法，但長時間暴露于阿片類藥物治療會產(chǎn)生耐受和痛覺過敏。中醫(yī)藥以其療效確切、副作用少等優(yōu)勢逐漸受到人們的關(guān)注。有文獻(xiàn)[13]表明，鞘內(nèi)給藥葛根素可以通過抑制神經(jīng)炎性過程和膠質(zhì)細(xì)胞的激活，在坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷模型和糖尿病引起的神經(jīng)性疼痛中產(chǎn)生劑量依賴性抗傷害效應(yīng)[14]，并且葛根素還可通過抑制促炎介質(zhì)減輕完全氟氏佐劑誘導(dǎo)的炎癥動物模型中的疼痛[15]。這些研究結(jié)果提示葛根素對各種因素引起的慢性疼痛有緩解作用，但其對慢性術(shù)后痛的作用及作用機(jī)制研究尚少，哪些重要的分子參與整個過程有待深入的研究。

本實驗構(gòu)建SMIR 慢性術(shù)后痛模型，分別檢測各組大鼠的MWT 發(fā)現(xiàn)，建模后7 d 模型組大鼠痛閾顯著下降至建模后28 d 逐漸恢復(fù)，與既往研究結(jié)果一致[16]，表明SMIR 模型建立成功；葛根素組在經(jīng)過葛根素治療7 d 以后，可明顯緩解大鼠疼痛，提高機(jī)械痛閾，表明葛根素對慢性術(shù)后痛也具有一定的療效。葛根素是從天然植物葛根中提取的一種C-糖基化大豆異黃酮，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用，目前較廣泛的應(yīng)用于治療心血管系統(tǒng)的疾病。近年的研究發(fā)現(xiàn)葛根素對各種慢性疼痛有緩解作用[17-18]。該實驗進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)葛根素可能通過抑制mTOR 通路治療慢性術(shù)后痛。

mTOR 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，大多數(shù)研究mTOR 在疼痛中作用的研究都集中在脊髓水平，在背角淺層和背根神經(jīng)節(jié)中發(fā)現(xiàn)mTOR 的表達(dá)[19]。發(fā)現(xiàn)在癌癥相關(guān)炎癥和神經(jīng)病理性疼痛包括脊髓損傷時，在背角和背根節(jié)的mTOR 的磷酸化水平會增加。此外，在炎癥性和神經(jīng)病理性疼痛的動物模型當(dāng)中，使用mTOR 抑制劑雷帕霉素可降低背角神經(jīng)元的過度興奮性和抗傷害性[20]。筆者發(fā)現(xiàn)大鼠脊髓中mTOR 蛋白表達(dá)在建模及葛根素治療后無明顯變化，但p-mTOR 在建模后表達(dá)升高，而在葛根素治療后表達(dá)減低，表明慢性術(shù)后痛可使mTOR 磷酸化水平增高，而葛根素可降低mTOR 磷酸化水平。并且脊髓p-mTOR 的蛋白表達(dá)變化伴隨著大鼠痛覺閾值變化，提示mTOR 磷酸化可能參與慢性術(shù)后痛的發(fā)生以及發(fā)展。而在結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)雜腦損傷中發(fā)現(xiàn)了mTOR 磷酸化與MG 促炎激活之間有直接聯(lián)系，mTOR 磷酸化導(dǎo)致促炎MG 活化[21]，筆者發(fā)現(xiàn)注射mTOR 抑制劑雷帕霉素后大鼠疼痛緩解，而脊髓背角MG 激活減弱，這進(jìn)一步揭示了在SMIR 模型中mTOR 磷酸化和MG 的聯(lián)系。

有報道腹腔注射葛根素可抑制脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)[22]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，本實驗發(fā)現(xiàn)mTOR 在脊髓背角中主要表達(dá)在MG中，另外發(fā)現(xiàn)大鼠建模后機(jī)械痛閾下降，mTOR 磷酸化水平增高，同時脊髓背角MG 特異性細(xì)胞標(biāo)記物Iba1 熒光陽性面積增加，MG 顯著激活；而葛根素治療后大鼠機(jī)械痛閾升高，mTOR 磷酸化水平降低，同時脊髓背角MG激活減弱，特異性細(xì)胞標(biāo)記物Iba1 熒光陽性面積減少，表明葛根素可顯著抑制MG 活化。

綜上所述，本實驗通過構(gòu)建SMIR 慢性術(shù)后痛模型，觀察葛根素對其療效及大鼠脊髓背角內(nèi)mTOR、p-mTOR 的變化和MG 激活情況，初步探究了慢性術(shù)后疼痛的相關(guān)分子變化，葛根素可通過抑制mTOR磷酸化減少MG 活化從而緩解慢性術(shù)后痛。