銀翹解毒片中摻偽山銀花成分監(jiān)測(cè)*

劉益慶，吳琦，趙猛，陳洪巖，錢(qián)明明，李玲

連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，連云港222006

銀翹解毒片收載于《中國(guó)藥典》2020 年版一部，由金銀花、連翹、薄荷、荊芥、淡豆豉、牛蒡子（炒）、桔梗、淡竹葉、甘草九味藥組成，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒的功效[1]?！吨袊?guó)藥典》2005 年版開(kāi)始將金銀花和山銀花分列為兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，金銀花為單一來(lái)源，即忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.）；山銀花有4種植物來(lái)源，分別為忍冬科植物灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.）、紅腺忍冬（Lonicera hypoglaucaMiq.）、華南忍冬（Lonicera confusaDC.）或黃褐毛忍冬（Lonicera fulvoto-mentosaHsu et S.C.Cheng）。金銀花和山銀花外觀性狀差異較大，但投料制成中成藥后卻難以辨別，由于山銀花較金銀花產(chǎn)量大、價(jià)格低，因此市場(chǎng)上金銀花中摻雜山銀花現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮。金銀花與山銀花為近緣植物，兩者都含有綠原酸，但作為藥用成分的木犀草苷，金銀花中含量較高，而山銀花中含量很少。此外，由于山銀花含有大量的皂苷類(lèi)成分，臨床上存在溶血致敏的風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，金銀花中摻偽山銀花的檢驗(yàn)方法有顯微特征鑒別[2]、薄層色譜法[3]、DNA 條形碼技術(shù)[4]、近紅外光譜技術(shù)[5]、高效液相色譜法[6，7]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法[8，9]等，本文擬通過(guò)優(yōu)化分析方法，建立科學(xué)準(zhǔn)確高效普及的檢驗(yàn)方法用于檢測(cè)銀翹解毒片中摻偽山銀花的成分。

1 儀器與試藥

Vanquish 型高效液相色譜儀（電噴霧檢測(cè)器，美國(guó)賽默飛公司）；BP211D 型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；1290-6470 Triple Quad 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；UV240型紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）。

灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品（批號(hào)111814-202106，含量96.1%），川斷續(xù)皂苷乙（批號(hào)111813-201804，含量96.8%），山銀花對(duì)照藥材（批號(hào)121595-201202），金銀花對(duì)照藥材（批號(hào)121060-201608）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；銀翹解毒片42 批（A 企業(yè)200201、200301、200401、210202、210801等，B 企業(yè)19910001、19910002、199910003，C 企業(yè) 1201001、1201002、1201003等，D 企業(yè)20210469、20210868等，E 企業(yè)21122922，F(xiàn) 企業(yè)410270、410320等，G 企業(yè)202101、202102、202103等，H 企業(yè)18005，I 企業(yè)200102等，J 企業(yè)190703、200602 等）；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純（德國(guó)Merk 公司）；純凈水由Milli-Q 純水儀制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

對(duì)照品溶液：取灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品約12 mg、川續(xù)斷皂苷乙對(duì)照品約10 mg，精密稱(chēng)定，置于100 mL 量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。

山銀花對(duì)照藥材溶液：取山銀花對(duì)照藥材約0.25 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，50%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

金銀花對(duì)照藥材溶液：取金銀花對(duì)照藥材約0.25 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，放冷，50%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

供試品溶液：取本品10片，研細(xì)，取約0.6 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，放冷，50%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

摻入3%山銀花、摻雜5%山銀花溶液：根據(jù)銀翹解毒片處方和制法，分別按3%、5%比例摻入山銀花投料，制成摻入不同投料比例山銀花的模擬樣品，按照“供試品溶液”制備。

2.2 色譜條件

色譜柱為Superiorex ODS C18（250mm×4.6 mm，5 μm），流速為1.0 mL·min-1，以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，行梯度洗脫：0～10.0 min，20%→30%A；10.0～25.0 min，30% A；25.0～36.0 min，30%→20%A，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。電噴霧檢測(cè)器條件：霧化器溫度45℃，采集頻率10 Hz，濾光片10.0 s；理論板數(shù)按灰氈毛忍冬皂苷乙峰計(jì)算應(yīng)不低于5000。

2.3 專(zhuān)屬性考察

分別取“2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液、山銀花對(duì)照藥材、金銀花對(duì)照藥材、供試品溶液按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（圖1）表明，在與灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品和川續(xù)斷皂苷乙對(duì)照品色譜保留時(shí)間相同的位置上，山銀花對(duì)照藥材檢出相應(yīng)色譜峰，而金銀花對(duì)照藥材未檢出相應(yīng)色譜峰，表明采用灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙作為區(qū)分山銀花與金銀花的特征成分是可行的。摻偽山銀花的銀翹解毒片色譜圖中檢出灰氈毛忍冬皂苷乙成分，而正常的銀翹解毒片色譜圖中未檢出灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙成分。

圖1 山銀花對(duì)照藥材（A）、金銀花對(duì)照藥材（B）、混合對(duì)照品（C）、摻偽樣品（D）及正常樣品（E）HPLC-CAD 色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液2、5、10、15、20、30、60 μL，依次進(jìn)樣分析，記錄峰面積，以進(jìn)樣量（μg）的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以峰面積的常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，灰氈毛忍冬皂苷乙的回歸方程為：Y1=1.598 5X1+4.587 2，r=0.999 2；川續(xù)斷皂苷乙的回歸方程為：Y2=2.260 8X2+1.806 9，r=0.999 3；結(jié)果表明：灰氈毛忍冬皂苷乙在0.239～7.158 μg、川續(xù)斷皂苷乙在0.202～6.066 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

取線性關(guān)系中間濃度的對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙峰面積的RSD 分別為0.86%和1.02%（n=6）。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取摻偽樣品（廠家A，批號(hào)200201），按“2.1”項(xiàng)下方法平行制備6份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙含量，結(jié)果其濃度的RSD 分別為0.98%和1.15%（n=6）。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.6”項(xiàng)下供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，結(jié)果灰氈毛忍冬皂苷乙和川斷續(xù)皂苷乙峰面積的RSD 為1.27%和1.33%（n=6）。

2.8 耐用性試驗(yàn)

取“2.6”項(xiàng)下供試品溶液，分別選擇3 根長(zhǎng)度和粒徑均為250 mm 和5 μm 不同廠家色譜柱（Superiorex ODS C18、Phenomenex Luna C18、Welch Ultimate XB-C18），按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，結(jié)果灰氈毛忍冬皂苷乙保留時(shí)間和峰面積的RSD 分別為0.41%和1.03%，川續(xù)斷皂苷乙保留時(shí)間和峰面積的RSD 分別為0.56%和1.48%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

稱(chēng)取已知含量的摻偽樣品（廠家A，批號(hào)200201）約0.6 g 9份，分別加入灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品和川續(xù)斷皂苷乙對(duì)照品適量，按“2.1”項(xiàng)下方法制備，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1～2。

表1 灰氈毛忍冬皂苷乙回收率試驗(yàn)

表2 川續(xù)斷皂苷乙回收率試驗(yàn)

3 樣品含量測(cè)定

取3 批摻偽樣品（廠家A，批號(hào)200201、210202、210801），按“2.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定：結(jié)果測(cè)得灰氈毛忍冬皂苷乙含量分別為8.412、6.978、7.491 mg·g-1；川續(xù)斷皂苷乙含量分別為0.742 7、0.701 6、0.712 2 mg·g-1。

4 質(zhì)譜確認(rèn)

對(duì)檢出的11 批摻偽樣品做質(zhì)譜確認(rèn)，通過(guò)ESI+掃描，灰氈毛忍冬皂苷乙一級(jí)質(zhì)譜m/z 為1 397.66，以m/z 1 397.66 為母離子的二級(jí)質(zhì)譜有1 073.55、911.48，見(jiàn)圖2A～D；川續(xù)斷皂苷乙一級(jí)質(zhì)譜m/z 為1 057.66，以m/z 1 057.666 為母離子的二級(jí)質(zhì)譜有619.41、455.35，見(jiàn)圖2E～H。

圖2 灰氈毛忍冬皂苷乙對(duì)照品一級(jí)（A）、二級(jí)（B），樣品一級(jí)（C）、二級(jí)（D）質(zhì)譜圖；川續(xù)斷皂苷乙對(duì)照品一級(jí)（E）、二級(jí)（F），樣品一級(jí)（G）、二級(jí)（H）質(zhì)譜圖

5 討論

流動(dòng)相曾摸索過(guò)0.1%甲酸-乙腈、0.1%三氟乙酸-乙腈、水-乙腈，三者專(zhuān)屬性一樣，從環(huán)境考慮，選擇水-乙腈系統(tǒng)。供試品提取方法曾摸索過(guò)甲醇、乙腈、50%甲醇、乙醇等，采用超聲和加熱回流兩種方式，時(shí)間選擇10、30 和60 min，最終確定50%甲醇超聲30 min 最為合適。摻入3%山銀花和摻入5%山銀花作為正常樣品和摻偽樣品的判定依據(jù)，《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版四部通則0212 藥材和飲片檢定通則中規(guī)定：藥屑及雜質(zhì)不得過(guò)3%，基于中成藥的處方和工藝，本文分別考察摻入3%山銀花和5%山銀花供試品中灰氈毛忍冬皂苷乙的檢測(cè)限，結(jié)果摻入3%山銀花供試品未檢出，摻入5%山銀花供試品檢出，在42 批樣品中檢出11 批摻偽成分。同時(shí)，與HPLC-ELSD 法相比，HPLC-CAD 法檢測(cè)的響應(yīng)值和靈敏度更優(yōu)。

選擇四級(jí)桿飛行質(zhì)譜串聯(lián)，在定性鑒別上分辨率高，專(zhuān)屬性強(qiáng)，一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜的質(zhì)荷比（m/z）可精確到小數(shù)點(diǎn)后4 位。