黃肝煎液對(duì)膽汁淤積性肝損傷大鼠的保護(hù)作用及急性毒性研究*

雷亞亞，郝秀娟，王亞楠，馬學(xué)禮，趙玉娜，王紫燕，陳晶**

1寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院制劑中心，銀川 750004；2興慶區(qū)健康教育所，銀川750001

膽汁淤積是指各種原因造成膽汁形成、分泌和排泄障礙，膽汁不能正常流入十二指腸而進(jìn)入血液的病理狀態(tài)，臨床可表現(xiàn)為瘙癢、乏力、尿色加深和黃疸等。隨著病情進(jìn)展，患者可出現(xiàn)高膽紅素血癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致肝硬化肝衰竭甚至死亡[1]。熊去氧膽酸等傳統(tǒng)藥物能促進(jìn)膽汁酸從肝腸中清除，延緩疾病進(jìn)展，但仍存在一定局限性[2，3]。中醫(yī)藥基于整體論治體系以及多成分多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)在疾病綜合治療中獨(dú)具優(yōu)勢[4，5]。黃肝煎液作為本院特色中藥制劑（備案號(hào)：寧藥制備字Z20200 020000；規(guī)格：180 mL/袋），是根據(jù)傳統(tǒng)驗(yàn)方“茵陳蒿湯”加減化裁而來，具有清利濕熱、利膽退黃的功效，用于黃疸型肝炎及膽汁淤積治療時(shí)，口服，一次90 mL，一日2次。黃肝煎液臨床療效顯著，深受廣大醫(yī)患的歡迎，已成為寧夏及周邊地區(qū)肝病患者保肝利膽的區(qū)域特色藥物。然而，尚缺乏科學(xué)系統(tǒng)的藥效學(xué)評(píng)價(jià)及作用機(jī)制研究，從而限制相關(guān)制劑的開發(fā)。本研究通過α-萘異硫氰酸酯（α-naphthalene isothiocyanate，ANIT）構(gòu)建膽汁淤積性肝損傷大鼠模型，考察黃肝煎液對(duì)模型大鼠膽汁淤積性肝損傷的保護(hù)作用；并通過急性毒性試驗(yàn)評(píng)價(jià)制劑的安全性，進(jìn)而為其臨床安全使用、深層次機(jī)制研究及新制劑開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AU5800 型全自動(dòng)生化分析儀（美國Beckman Coulter 公司）；CLARIO star Plus 型多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；RM2016 病理切片機(jī)（德國Leica 公司）；HH-2 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；DM400B 型熒光顯微鏡（德國Leica 公司）。

1.2 試藥

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD 大鼠72只，體質(zhì)量為190～210 g，雌雄各半；KM 小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，雌雄各半，均由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（寧）2020-0001。分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。飼養(yǎng)環(huán)境干燥舒適，通風(fēng)良好，溫度21～25℃，濕度55%～65%。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行（2020-072），實(shí)驗(yàn)過程符合國家和單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用規(guī)定。

2 方法

2.1 黃肝煎液的制備及質(zhì)量檢查

2.1.1 制備 茵陳、黃芩、黃柏、當(dāng)歸及大黃等處方藥味，加適量水浸泡30 min，加熱煎煮2次，第一次2 h，第二次1 h，合并煎液，濾過，濾液加熱濃縮至濃度為0.815 g·mL-1，灌裝，滅菌，即得黃肝煎液制劑。

2.1.2 質(zhì)量檢查 依據(jù)《中國藥典》2020 年版pH 值測定法（通則0631）[6]，測定黃肝煎液pH 值應(yīng)為4.0～6.0；依據(jù)相對(duì)密度測定法（通則0601 比重瓶法），測定相對(duì)密度應(yīng)不低于1.02[7]；依據(jù)茵陳含量測定，采用高效液相色譜法測定綠原酸含量，每袋以綠原酸總量計(jì)，不得少于60 mg[8]。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)用藥液制備 按照黃肝煎液制劑配制工藝，依次煎制質(zhì)量濃度為0.407 5、0.815、1.63 g·mL-1的黃肝煎液，即為黃肝煎液低（HGYJ-L）、中（HGYJ-M）、高（HGYJ-H）劑量。

2.2 黃肝煎液對(duì)大鼠膽汁淤積性肝損傷保護(hù)作用研究

2.2.1 動(dòng)物造模與給藥 72 只SD 大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組、黃肝煎液低、中、高劑量組，每組12 只。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 天后，黃肝煎液低、中、高劑量組分別灌胃HGYJ-L（3.85 g·kg-1）、HGYJ-M（7.70 g·kg-1）、HGYJ-H（15.40 g·kg-1）；陽性對(duì)照組灌胃UDCA（63 mg·kg-1）；正常對(duì)照組和模型組灌胃等量生理鹽水，每天2次，連續(xù)給藥14 d。除正常對(duì)照組給予等量橄欖油外，其它組均于第12天灌胃ANIT（100 mg·kg-1）造模[9，10]。

2.2.2 標(biāo)本采集與處理 大鼠末次給藥后禁食12 h，用3%戊巴比妥（40 mg·kg-1）麻醉，仰臥位固定，開腹，膽管插管并固定，自膽汁流出開始計(jì)時(shí)，收集0～15 min、15～30 min、30～45 min、45～60 min 的膽汁；膽汁收集結(jié)束后，腹主動(dòng)脈取血，3000 r·min-1離心10 min，分離血清；處死大鼠，取肝組織備用。

2.2.3 膽汁流量測定 根據(jù)公式膽汁流量（μL·min-1·kg-1）=膽汁質(zhì)量/體質(zhì)量×15[11]計(jì)算膽汁流量。

應(yīng)收賬款是企業(yè)流動(dòng)資產(chǎn)的重要組成部分，對(duì)應(yīng)收賬款的管理也尤為重要，很多企業(yè)通過賒銷將商品迅速銷售出去，擴(kuò)大企業(yè)的市場，卻不重視應(yīng)收賬款的管理，一些企業(yè)在賒銷時(shí)并沒有規(guī)定應(yīng)收賬款的還款期限，企業(yè)并不能控制資金的收回日期，在賒銷中由主動(dòng)方變成了被動(dòng)方，加大了應(yīng)收賬款的不確定性。企業(yè)缺少對(duì)應(yīng)收賬款管理的規(guī)章制度，沒有及時(shí)對(duì)應(yīng)收賬款計(jì)提壞賬準(zhǔn)備，忽視了應(yīng)收賬款所帶來的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致應(yīng)收賬款的回收、壞賬準(zhǔn)備等指標(biāo)不準(zhǔn)確，會(huì)計(jì)監(jiān)督?jīng)]有達(dá)到效果。企業(yè)這種只在乎眼前利益而不重視事后管理的行為就會(huì)導(dǎo)致企業(yè)應(yīng)收賬款回收的困難，降低企業(yè)資金周轉(zhuǎn)的速度，企業(yè)的生產(chǎn)經(jīng)營將會(huì)更加困難。

2.2.4 肝臟指數(shù)測定 根據(jù)公式肝臟系數(shù)（%）=肝質(zhì)量/體質(zhì)量×100%計(jì)算肝臟指數(shù)。

2.2.5 血清肝功能相關(guān)指標(biāo)測定 使用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清肝功能指標(biāo)（ALT、AST、ALP 和Hyp）及黃疸指標(biāo)（TBIL 和TBA）水平。

2.2.6 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察肝組織病理學(xué)改變 取大鼠肝組織，于4%多聚甲醛中固定后取出，依次進(jìn)行脫水、石蠟包埋及切片處理，制備5 μm 切片。進(jìn)一步脫蠟處理，經(jīng)HE染色后，脫水、封片。將處理后的切片置于顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)變化[12]。

2.3 急性毒性試驗(yàn)[13,14]

2.3.1 急性毒性預(yù)實(shí)驗(yàn) 30 只KM 小鼠，隨機(jī)分為3組，每組10只，雌雄各半。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，各組小鼠分別灌胃給予質(zhì)量濃度為1.63、0.815、0.4075 g·mL-1的黃肝煎液，灌胃體積為40 mL·kg-1，24 h 內(nèi)給藥3次，給藥劑量分別為195.6、97.8、48.9 g·kg-1·d-1。連續(xù)觀察14 d，記錄小鼠體重、中毒及死亡數(shù)，計(jì)算半數(shù)致死量（LD50）。

2.3.2 最大給藥劑量試驗(yàn) 40 只KM 小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和黃肝煎液組，雌雄各半。適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后，黃肝煎液組以最大給藥濃度1.63 g·mL-1和最大給藥體積40 mL·kg-1灌胃給予黃肝煎液，24 h 內(nèi)給藥3次，對(duì)照組灌胃給予等量生理鹽水。觀察并記錄給藥后14 d 內(nèi)小鼠的急性毒性反應(yīng)。

2.3.3 指標(biāo)檢測 小鼠急性毒性反應(yīng)觀察結(jié)束，眼眶取血，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測相關(guān)生化指標(biāo)；處死小鼠，取心、肝、脾、肺和腎稱定質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 黃肝煎液制劑質(zhì)量檢查

黃肝煎液制劑pH 值為4.87，相對(duì)密度為1.051，每袋含綠原酸為92.7 mg，符合制劑標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 黃肝煎液對(duì)大鼠膽汁淤積性肝損傷保護(hù)作用

3.2.1 大鼠一般狀態(tài)觀察 造模前各組大鼠精神狀態(tài)良好，體毛光滑，飲水及進(jìn)食正常；給予ANIT造模后，模型組大鼠精神萎靡，體毛變粗糙，活動(dòng)減少，飲水及進(jìn)食減少，尿液出現(xiàn)黃褐色；HGJY-L 組大鼠活動(dòng)略有減弱，而HGJY-M、HGJY-H 組和陽性對(duì)照組精神狀態(tài)較好，體毛順滑，活動(dòng)、飲水和進(jìn)食基本正常。

3.2.2 黃肝煎液對(duì)膽汁流量影響 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠膽汁流量明顯減少；與模型組比較，黃肝煎液各組膽汁流量均有所增加，其中中、高劑量組膽汁流量升高尤為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖1 及表1。結(jié)果表明，黃肝煎液可以顯著提高ANIT 誘導(dǎo)膽汁淤積肝損傷大鼠的膽汁流量。

表1 黃肝煎液對(duì)ANIT 誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷大鼠膽汁流量、臟器指數(shù)及血清生化標(biāo)志物指標(biāo)影響（n=12，）

表1 黃肝煎液對(duì)ANIT 誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷大鼠膽汁流量、臟器指數(shù)及血清生化標(biāo)志物指標(biāo)影響（n=12，）

圖1 黃肝煎液對(duì)ANIT 誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷大鼠膽汁流量的影響

3.2.3 黃肝煎液對(duì)大鼠肝臟指數(shù)的影響 表1 顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組與HGJY-L 組大鼠肝臟指數(shù)較顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），而HGJY-M、HGJY-H 組及陽性對(duì)照組肝臟指數(shù)未發(fā)生明顯變化；與模型組比較，HGJY-M、HGJY-H 組及陽性對(duì)照組肝臟指數(shù)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

3.2.4 黃肝煎液對(duì)大鼠血清生化指標(biāo)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中肝功能指標(biāo)（ALT、AST、ALP 和Hyp）與黃疸指標(biāo)（TBA 和TBIL）均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)合肝臟組織形態(tài)病理改變，表明ANIT 誘導(dǎo)的膽汁淤積肝損傷大鼠模型成功建立。與模型組比較，黃肝煎液組與陽性對(duì)照組血清肝功能指標(biāo)和黃疸指標(biāo)均顯著降低，其中HGJY-M 組血清中ALT、AST、ALP 分別下降33.23%、58.00%、42.60%，TBA 和TBIL 分別下降25.53%、37.34%；HGJY-H 組血清中ALT、AST、ALP 分別下降49.73%、69.64%、45.97%，TBA 和TBIL 分別下降47.65%、45.57%，且HGJYH 組對(duì)肝損傷指標(biāo)下調(diào)作用接近陽性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)果表明，黃肝煎液可以顯著改善ANIT 誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷。同時(shí)顯示對(duì)比模型組，HGJY-M、HGJY-H 組Hyp 顯著下降（P<0.05），提示黃肝煎液對(duì)膽汁淤積所致的肝纖維化有一定的改善作用。

3.2.5 黃肝煎液對(duì)膽汁淤積性肝損傷大鼠肝組織病理學(xué)的影響 HE 染色結(jié)果（圖2）顯示，正常對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞大致呈放射狀排列，無變性壞死，未見明顯炎性癥狀，血管及膽管結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠肝臟靜脈周圍以及小葉內(nèi)肝細(xì)胞腫脹變性，胞質(zhì)疏松至空泡化，匯管區(qū)膽管增生（黑色箭頭），中央靜脈周圍和匯管區(qū)可見大量炎細(xì)胞浸潤（黃色箭頭）；與模型組比較，黃肝煎液低劑量組大鼠肝組織炎性細(xì)胞浸潤略減少，而HGJYM、HGJY-H 組及陽性對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，大鼠肝組織病理損傷顯著改善。

圖2 正常對(duì)照組（A）；模型組（B）；陽性對(duì)照組（C）；黃肝煎液低（D）、中（E）、高劑量組（F）大鼠肝組織形態(tài)（×200）

3.3 小鼠急性毒性試驗(yàn)

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除部分小鼠拉稀便、體質(zhì)量降低外，其余小鼠行為活動(dòng)未見明顯異常，無急性中毒癥狀，無法獲得LD50值。因此，以最大給藥劑量法進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。

最大給藥劑量試驗(yàn)中，對(duì)照組小鼠的外觀狀態(tài)、飲食、行為活動(dòng)、排泄物等均正常，黃肝煎液組活動(dòng)稍遲緩，飲食稍減少，部分小鼠拉稀便，3 h 后恢復(fù)正常。連續(xù)觀察14 d，各組小鼠皮毛光滑，活動(dòng)自如，一般狀況良好，未出現(xiàn)死亡。黃肝煎液組與對(duì)照組小鼠體質(zhì)量增長、各臟器指數(shù)及生化指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），見表2～4。

表2 黃肝煎液對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（n=20，）

表2 黃肝煎液對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（n=20，）

表3 黃肝煎液對(duì)臟器指數(shù)的影響（n=20，）

表3 黃肝煎液對(duì)臟器指數(shù)的影響（n=20，）

表4 黃肝煎液對(duì)小鼠生化指標(biāo)的影響（n=20，）

表4 黃肝煎液對(duì)小鼠生化指標(biāo)的影響（n=20，）

4 討論

膽汁淤積性肝損傷屬中醫(yī)“黃疸”“積聚”等范疇，根據(jù)古代醫(yī)書記載，濕、熱、瘀、毒作為黃疸主要病機(jī)，其多由濕熱之邪蘊(yùn)結(jié)肝膽，脈道不通，瘀阻血絡(luò)而導(dǎo)致膽汁排泄不暢，液溢肌膚而發(fā)[15]。膽汁淤積性肝病臨床常見且發(fā)病率逐年上升，主要表現(xiàn)為膽汁代謝紊亂和膽汁酸在肝臟過度蓄積。當(dāng)膽汁酸正常代謝過程受阻時(shí)，疏水性膽酸鹽等毒性成分在肝細(xì)胞內(nèi)大量蓄積，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞損傷[16，17]?，F(xiàn)代研究表明，體內(nèi)膽汁酸主要經(jīng)限速酶-膽固醇7-羥化酶調(diào)控合成，再經(jīng)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶等代謝，然后經(jīng)膽鹽輸出泵和多藥耐藥相關(guān)蛋白等外排轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)經(jīng)膽道排泄，在牛磺膽酸鈉共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽等作用下重吸收回到肝臟。因此，影響膽汁酸吸收、排出的因素都與肝損傷密切相關(guān)[18]。

中醫(yī)藥治療疾病遵從辨證論治，結(jié)合中藥的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑特點(diǎn)，在膽汁淤積治療方面具有顯著優(yōu)勢。黃肝煎液由茵陳、當(dāng)歸、黃芩、黃柏、大黃及龍膽等方藥組成，方中重用茵陳清熱利濕、退黃疸，配黃芩、黃柏清熱燥濕而解毒疫，佐大黃疏肝利膽，祛除濕熱毒邪。山藥、川楝子行氣補(bǔ)脾虛證；龍膽草、茯苓，前者苦寒直泄，后者平甘滲濕，兩藥合用，瀉肝膽實(shí)火，利水滲濕，除下焦?jié)駸幔挥艚鹦袣馍⒏斡?，利膽退黃。諸藥合用，具有清熱利濕、利膽退黃之功效，切中“膽汁淤積”的病機(jī)。

本研究使用ANIT 誘導(dǎo)大鼠后，膽汁流量明顯減少，血清膽汁重要成分TBA 和TBIL 水平顯著上升，肝損傷指標(biāo)ALT、AST、ALP 及Hyp 含量明顯升高；HE 染色結(jié)果亦提示肝臟組織大量炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞脂肪變性、脂肪空泡、壞死明顯，均表明肝內(nèi)膽汁淤積肝損傷大鼠模型成功建立。黃肝煎液能夠逆轉(zhuǎn)ANIT 誘導(dǎo)的血清ALT、AST 和ALP 升高，降低血清TBA、TBIL 水平，提高膽汁流量，明顯改善肝臟病理改變，表明其對(duì)ANIT 誘導(dǎo)的膽汁淤積肝損傷具有一定保護(hù)作用，但其對(duì)膽汁酸合成、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)及排泄相關(guān)環(huán)節(jié)的影響及具體作用機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。

本研究進(jìn)一步通過小鼠急性毒性試驗(yàn)觀察黃肝煎液的用藥安全性。黃肝煎液臨床成人日用劑量是2.445 g·kg-1，而在本急性毒性試驗(yàn)中，以最大給藥濃度1.63 g·mL-1，最大給藥體積40 mL·kg-1灌胃小鼠，24 h 內(nèi)給予黃肝煎液3次，最大日給藥量為195.6 g·kg-1（相當(dāng)于臨床成人日用劑量的80 倍）時(shí)，連續(xù)觀察14天，除部分小鼠體質(zhì)量降低、稀便軟便外，其余小鼠均未出現(xiàn)死亡和明顯的急性毒性反應(yīng)。提示該制劑在本研究最大給藥劑量條件下，短期給藥無明顯毒性，但后期還應(yīng)結(jié)合長期毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)其安全進(jìn)行性評(píng)價(jià)，以全面保證臨床用藥的安全性。

綜上所述，本研究明確了黃肝煎液對(duì)膽汁淤積性肝損傷的保護(hù)作用及初步安全性評(píng)價(jià)，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。