湖北楓楊總黃酮對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的影響及機(jī)制研究

侯孜明 ，吳昊 ，馮佳 洪嵐 ，張宗星 ，劉道忠 ，江露 ，袁林

1.湖北民族大學(xué)風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；

2.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北 恩施 445000； 3.湖北恩施學(xué)院，湖北 恩施 445000

肺癌是全球癌癥死亡的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年肺癌約占癌癥相關(guān)死亡總數(shù)的18%[1]。肺癌主要分為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（SCLC），其中NSCLC占80%～85%。西醫(yī)主要采用放療、化療、靶向治療和免疫治療，但患者的五年生存率僅15%左右，且治療伴有嚴(yán)重不良反應(yīng)，包括腎毒性、骨髓抑制及胃腸道反應(yīng)，給患者帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)和痛苦[2-3]。因此，探索治療NSCLC的新藥物具有重要意義。

中藥對(duì)多種疾病具有良好的治療效果，能通過多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮作用。《中國植物志》記載楓楊屬Pterocarya Kunth植物包括湖北楓楊、楓楊、越南楓楊、水胡桃、華西楓楊、甘肅楓楊、云南楓楊7種[4]，其中湖北楓楊、華西楓楊、甘肅楓楊和云南楓楊為我國特有。楓楊中含有豐富的黃酮類化合物[5]。藥理研究表明，楓楊具有抗菌、抗炎、抗糖尿病、抗腫瘤等作用[6-8]。本研究觀察湖北楓楊總黃酮對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為NSCLC治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。采用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青鏈霉素），于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 藥物及制備

本研究使用楓楊樹皮采于湖北省恩施州，經(jīng)湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院李厚聰老師鑒定為湖北楓楊Pterocarya hupehensisSkan的干燥樹皮。采用超聲輔助提取總黃酮，D101大孔樹脂分離純化，獲得純化的湖北楓楊總黃酮，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，測得總黃酮純度為78%。先用DMSO 溶解，使用時(shí)以培養(yǎng)基稀釋（DMSO終濃度不超過0.1%）。

1.3 主要試劑及儀器

RPMI 1640 培養(yǎng)基（批號(hào)8121319），美國Gibco公司；胎牛血清（批號(hào)2140301），上海逍鵬生物科技有限公司；青鏈霉素（批號(hào)1857816），美國Gibco公司；CCK-8 試劑盒（批號(hào)NQ646），日本同仁公司；DMSO（批號(hào)RNBJ9551），美國Sigma公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)2012008），廣州碩譜生物科技有限公司；D-101大孔吸附樹脂（批號(hào)20200916），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PMSF 蛋白酶抑制劑（批號(hào)101321211021），碧云天生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液（批號(hào)CR2107001），武漢塞維爾生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒（批號(hào)分別為A10523、A10431），杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；預(yù)染蛋白Marker（批號(hào)01081673），美國Thermo 公司；PVDF 膜、ECL 發(fā)光液（批號(hào)分別為R1BB06918、2106001），美國Millipore 公司；SDSPAGE凝膠配制試劑盒（批號(hào)MA0383-Nov-01G），大連美侖生物；Fas、Bax、Bcl-2、Cyclin D1、P27抗體（批號(hào)分別為0200390102、3560005119、3560219203、0003210101、4000000455），武漢愛博泰克生物科技有限公司；山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG、β-actin抗體（批 號(hào) 分 別 為20000311、20000275、10004156），Proteintech 公司；Cleaved Caspase-3 抗體（批號(hào)15z0096），維百奧（北京）生物科技有限公司。

IX73 型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司），TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），F(xiàn)D8-8真空冷凍干燥機(jī)（瑞士Buchi公司），TH-100BQX數(shù)控超聲儀（美國GOLO-SIM公司），311 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司），ImageQuant LAS4000mini 生物分子成像儀（日本GE公司），Multiscan Go酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），SH800流式細(xì)胞分選儀（日本SONY公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后用RPMI 1640培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)整為5×104個(gè)/mL，接種于96孔板，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，加入0（對(duì)照組）、25、50、100、150、200 μg/mL湖北楓楊總黃酮，每組6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白組調(diào)零，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，每孔加入CCK-8工作液10 μL，放入培養(yǎng)箱孵育1 h，酶標(biāo)儀波長450 nm測定各孔吸光度（A值），計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值）÷（對(duì)照組A值-空白組A值）×100%。

2.2 細(xì)胞凋亡檢測

將A549細(xì)胞按1×105個(gè)/mL接種至6孔板，每孔2 mL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞分為對(duì)照組和楓楊總黃酮低、中、高劑量組，分別加入相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，預(yù)冷PBS 洗滌，收集細(xì)胞，加入1×binding buffer 500 μL 重懸細(xì)胞，每個(gè)樣本分別加入Annexin V-FITC 5 μL和碘化丙啶10 μL，渦旋混勻后，室溫避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，采用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

2.3 細(xì)胞周期檢測

將A549細(xì)胞按1×105個(gè)/mL接種至6孔板，每孔2 mL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞分為對(duì)照組和楓楊總黃酮低、中、高劑量組，分別加入相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，PBS洗滌，預(yù)冷無水乙醇-20 ℃固定過夜，將固定細(xì)胞洗滌、沉淀后，加入DNA 染色液1 mL，渦旋振蕩5～10 s混勻，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，采用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

2.4 Western blot檢測

將A549細(xì)胞按1×105個(gè)/mL接種至6孔板，每孔2 mL，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞分為對(duì)照組和楓楊總黃酮低、中、高劑量組，分別加入相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。加入含PMSF的RIPA裂解液冰上裂解，BCA法測定蛋白濃度并加熱使蛋白變性，進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST洗膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜3次（5 min/次），分別加入Fas、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Cyclin D1、P27 一抗（均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加入二抗（1∶10 000），室溫孵育2 h，多功能凝膠成像儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 湖北楓楊總黃酮對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

與對(duì)照組（0 μg/mL）比較，不同濃度（25、50、100、150、200 μg/mL）湖北楓楊總黃酮處理細(xì)胞24、48 h對(duì)細(xì)胞增殖有明顯抑制作用（P＜0.05，P＜0.01），結(jié)果見圖1。為避免藥物毒性對(duì)細(xì)胞的影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以100、150、200 μg/mL楓楊總黃酮作為低、中、高劑量處理A549細(xì)胞，作用時(shí)間24 h。

圖1 不同濃度湖北楓楊總黃酮對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響（±s，n=6）

4.2 湖北楓楊總黃酮對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響

對(duì)照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好，存活細(xì)胞數(shù)量多，細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞間隙較小、連接緊密，少見漂浮細(xì)胞；楓楊總黃酮各劑量組存活細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞排列松散，間隙明顯增寬，培養(yǎng)基中可見大量漂浮細(xì)胞，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞狀態(tài)變差更為明顯。見圖2。

圖2 各組A549細(xì)胞形態(tài)（×400）

4.3 湖北楓楊總黃酮對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，楓楊總黃酮各劑量組A549細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）。見表1、圖3。

表1 各組A549細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）

表1 各組A549細(xì)胞凋亡率比較（±s，%）

注：與對(duì)照組比較，**P＜0.01

凋亡率1.38±0.39 21.74±0.73**30.03±0.25**39.39±0.34**組別對(duì)照組楓楊總黃酮低劑量組楓楊總黃酮中劑量組楓楊總黃酮高劑量組n 3 3 3 3

圖3 各組A549細(xì)胞凋亡檢測流式圖

4.4 湖北楓楊總黃酮對(duì)A549細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，楓楊總黃酮各劑量組A549細(xì)胞G0/G1期比例明顯增加（P＜0.01），S期細(xì)胞比例明顯減少（P＜0.01）。見表2。

表2 各組A549細(xì)胞周期比較（±s，%）

表2 各組A549細(xì)胞周期比較（±s，%）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別對(duì)照組楓楊總黃酮低劑量組楓楊總黃酮中劑量組楓楊總黃酮高劑量組G2/M期12.19±1.69 12.11±1.79 10.13±2.19 8.28±1.05*n 3 3 3 3 G0/G1期56.62±1.56 62.28±0.87**67.74±1.49**73.13±1.92**S期31.19±1.86 25.64±1.20**22.13±0.71**18.60±0.89**

4.5 湖北楓楊總黃酮對(duì)A549細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，楓楊總黃酮各劑量組細(xì)胞Fas、Bax、Cleaved Caspase-3、P27蛋白表達(dá)明顯升高，Cyclin D1 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），楓楊總黃酮中、高劑量組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組A549細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s，n=3）

5 討論

細(xì)胞增殖和凋亡失調(diào)與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，細(xì)胞凋亡在細(xì)胞生長發(fā)育中起重要作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為癌癥治療的一種策略[9-10]。細(xì)胞凋亡主要存在內(nèi)在（線粒體）途徑和外在死亡受體途徑[11]。Bcl-2家族蛋白是內(nèi)在途徑的中心調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)cyt-c和其他凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)改變線粒體膜通透性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[12-13]，主要由促凋亡蛋白（如Bax）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2）組成，Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平是決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡途徑的關(guān)鍵因素[14-15]；在外源性死亡受體通路中，F(xiàn)as是一種細(xì)胞表面蛋白，是重要的死亡受體之一[16]，通過與抗體或Fas配體（FasL）交聯(lián)可介導(dǎo)快速凋亡[17]。有研究表明，F(xiàn)as在包括肺癌在內(nèi)的各種癌癥中表達(dá)下調(diào)[18]。以上2種途徑最終會(huì)導(dǎo)致Caspase家族蛋白激活，特別是作為關(guān)鍵效應(yīng)因子的Caspase-3[19]。在正常情況下，Caspase-3以無活性前體存在于細(xì)胞中，在應(yīng)激條件下被切割以產(chǎn)生介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性片段，Caspase-3激活是細(xì)胞進(jìn)入不可逆凋亡階段的標(biāo)志[20-22]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測楓楊總黃酮對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且可以上調(diào)死亡受體蛋白Fas、促凋亡蛋白Bax表達(dá)，降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)Caspase-3活化，上調(diào)Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。提示湖北楓楊總黃酮可能通過激活內(nèi)在途徑和外在途徑促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。

除細(xì)胞凋亡外，細(xì)胞周期停滯是抑制癌細(xì)胞增殖的另一作用機(jī)制[23]。在細(xì)胞周期進(jìn)程中，主要由細(xì)胞周期蛋白Cyclins、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（Cdks）及Cdks抑制劑共同協(xié)調(diào)發(fā)揮作用。Cdks本質(zhì)上是無活性的催化亞基，需要與激活伴侶細(xì)胞周期蛋白（關(guān)聯(lián)的調(diào)節(jié)亞基）結(jié)合，形成Cyclin-Cdk復(fù)合物以發(fā)揮在細(xì)胞增殖中的作用。另外，Cyclin-Cdk復(fù)合物可以與Cdks抑制劑結(jié)合，從而抑制激酶活性并阻止細(xì)胞周期進(jìn)程[24-25]。因此，細(xì)胞周期受特定周期相關(guān)蛋白的正向調(diào)節(jié)，并受某些Cdks抑制因子的負(fù)向調(diào)節(jié)。Cyclin D1是調(diào)節(jié)G1期最重要的蛋白，P27是一種Cdks抑制劑，主要抑制從G1期到S期轉(zhuǎn)變的Cdks[26-27]。本研究結(jié)果表明，湖北楓楊總黃酮可以調(diào)節(jié)A549細(xì)胞Cyclin D1和P27蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)A549細(xì)胞G0/G1期阻滯，即湖北楓楊總黃酮作用A549細(xì)胞后可能干擾DNA的合成，并可能在此階段抑制A549細(xì)胞增殖。

綜上所述，湖北楓楊總黃酮能抑制A549細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與激活線粒體和Fas介導(dǎo)的死亡受體通路以誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡、促進(jìn)A549細(xì)胞G0/G1期阻滯有關(guān)。