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    湖北楓楊總黃酮對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的影響及機(jī)制研究

    2023-07-12 08:09:38侯孜明吳昊馮佳洪嵐張宗星劉道忠江露袁林
    中國中醫(yī)藥信息雜志 2023年7期
    關(guān)鍵詞:楓楊培養(yǎng)箱細(xì)胞周期

    侯孜明 ,吳昊 ,馮佳 洪嵐 ,張宗星 ,劉道忠 ,江露 ,袁林

    1.湖北民族大學(xué)風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 恩施 445000;

    2.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部,湖北 恩施 445000; 3.湖北恩施學(xué)院,湖北 恩施 445000

    肺癌是全球癌癥死亡的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì),2020年肺癌約占癌癥相關(guān)死亡總數(shù)的18%[1]。肺癌主要分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC),其中NSCLC占80%~85%。西醫(yī)主要采用放療、化療、靶向治療和免疫治療,但患者的五年生存率僅15%左右,且治療伴有嚴(yán)重不良反應(yīng),包括腎毒性、骨髓抑制及胃腸道反應(yīng),給患者帶來嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)和痛苦[2-3]。因此,探索治療NSCLC的新藥物具有重要意義。

    中藥對(duì)多種疾病具有良好的治療效果,能通過多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮作用。《中國植物志》記載楓楊屬Pterocarya Kunth植物包括湖北楓楊、楓楊、越南楓楊、水胡桃、華西楓楊、甘肅楓楊、云南楓楊7種[4],其中湖北楓楊、華西楓楊、甘肅楓楊和云南楓楊為我國特有。楓楊中含有豐富的黃酮類化合物[5]。藥理研究表明,楓楊具有抗菌、抗炎、抗糖尿病、抗腫瘤等作用[6-8]。本研究觀察湖北楓楊總黃酮對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖的影響,探討其可能的作用機(jī)制,為NSCLC治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 細(xì)胞

    人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞,購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。采用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素),于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.2 藥物及制備

    本研究使用楓楊樹皮采于湖北省恩施州,經(jīng)湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院李厚聰老師鑒定為湖北楓楊Pterocarya hupehensisSkan的干燥樹皮。采用超聲輔助提取總黃酮,D101大孔樹脂分離純化,獲得純化的湖北楓楊總黃酮,以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,測得總黃酮純度為78%。先用DMSO 溶解,使用時(shí)以培養(yǎng)基稀釋(DMSO終濃度不超過0.1%)。

    1.3 主要試劑及儀器

    RPMI 1640 培養(yǎng)基(批號(hào)8121319),美國Gibco公司;胎牛血清(批號(hào)2140301),上海逍鵬生物科技有限公司;青鏈霉素(批號(hào)1857816),美國Gibco公司;CCK-8 試劑盒(批號(hào)NQ646),日本同仁公司;DMSO(批號(hào)RNBJ9551),美國Sigma公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)2012008),廣州碩譜生物科技有限公司;D-101大孔吸附樹脂(批號(hào)20200916),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;PMSF 蛋白酶抑制劑(批號(hào)101321211021),碧云天生物技術(shù)有限公司;RIPA裂解液(批號(hào)CR2107001),武漢塞維爾生物科技有限公司;細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒(批號(hào)分別為A10523、A10431),杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;預(yù)染蛋白Marker(批號(hào)01081673),美國Thermo 公司;PVDF 膜、ECL 發(fā)光液(批號(hào)分別為R1BB06918、2106001),美國Millipore 公司;SDSPAGE凝膠配制試劑盒(批號(hào)MA0383-Nov-01G),大連美侖生物;Fas、Bax、Bcl-2、Cyclin D1、P27抗體(批號(hào)分別為0200390102、3560005119、3560219203、0003210101、4000000455),武漢愛博泰克生物科技有限公司;山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG、β-actin抗體(批 號(hào) 分 別 為20000311、20000275、10004156),Proteintech 公司;Cleaved Caspase-3 抗體(批號(hào)15z0096),維百奧(北京)生物科技有限公司。

    IX73 型倒置熒光顯微鏡(日本Olympus 公司),TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司),F(xiàn)D8-8真空冷凍干燥機(jī)(瑞士Buchi公司),TH-100BQX數(shù)控超聲儀(美國GOLO-SIM公司),311 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific 公司),ImageQuant LAS4000mini 生物分子成像儀(日本GE公司),Multiscan Go酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司),SH800流式細(xì)胞分選儀(日本SONY公司)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率

    取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化后用RPMI 1640培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)整為5×104個(gè)/mL,接種于96孔板,每孔100 μL,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜,加入0(對(duì)照組)、25、50、100、150、200 μg/mL湖北楓楊總黃酮,每組6個(gè)復(fù)孔,另設(shè)空白組調(diào)零,繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h,每孔加入CCK-8工作液10 μL,放入培養(yǎng)箱孵育1 h,酶標(biāo)儀波長450 nm測定各孔吸光度(A值),計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)÷(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%。

    2.2 細(xì)胞凋亡檢測

    將A549細(xì)胞按1×105個(gè)/mL接種至6孔板,每孔2 mL,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞分為對(duì)照組和楓楊總黃酮低、中、高劑量組,分別加入相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,預(yù)冷PBS 洗滌,收集細(xì)胞,加入1×binding buffer 500 μL 重懸細(xì)胞,每個(gè)樣本分別加入Annexin V-FITC 5 μL和碘化丙啶10 μL,渦旋混勻后,室溫避光孵育5 min,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測,采用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

    2.3 細(xì)胞周期檢測

    將A549細(xì)胞按1×105個(gè)/mL接種至6孔板,每孔2 mL,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞分為對(duì)照組和楓楊總黃酮低、中、高劑量組,分別加入相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞,PBS洗滌,預(yù)冷無水乙醇-20 ℃固定過夜,將固定細(xì)胞洗滌、沉淀后,加入DNA 染色液1 mL,渦旋振蕩5~10 s混勻,室溫避光孵育30 min,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測,采用FlowJo軟件進(jìn)行分析。

    2.4 Western blot檢測

    將A549細(xì)胞按1×105個(gè)/mL接種至6孔板,每孔2 mL,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞分為對(duì)照組和楓楊總黃酮低、中、高劑量組,分別加入相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。加入含PMSF的RIPA裂解液冰上裂解,BCA法測定蛋白濃度并加熱使蛋白變性,進(jìn)行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)至PVDF膜,TBST洗膜,用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,TBST洗膜3次(5 min/次),分別加入Fas、Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Cyclin D1、P27 一抗(均為1∶1 000),4 ℃孵育過夜,TBST洗膜,加入二抗(1∶10 000),室溫孵育2 h,多功能凝膠成像儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影,采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    4 結(jié)果

    4.1 湖北楓楊總黃酮對(duì)A549細(xì)胞存活率的影響

    與對(duì)照組(0 μg/mL)比較,不同濃度(25、50、100、150、200 μg/mL)湖北楓楊總黃酮處理細(xì)胞24、48 h對(duì)細(xì)胞增殖有明顯抑制作用(P<0.05,P<0.01),結(jié)果見圖1。為避免藥物毒性對(duì)細(xì)胞的影響,后續(xù)實(shí)驗(yàn)以100、150、200 μg/mL楓楊總黃酮作為低、中、高劑量處理A549細(xì)胞,作用時(shí)間24 h。

    圖1 不同濃度湖北楓楊總黃酮對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響(±s,n=6)

    4.2 湖北楓楊總黃酮對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響

    對(duì)照組細(xì)胞生長狀態(tài)良好,存活細(xì)胞數(shù)量多,細(xì)胞呈梭形,細(xì)胞間隙較小、連接緊密,少見漂浮細(xì)胞;楓楊總黃酮各劑量組存活細(xì)胞數(shù)量明顯減少,細(xì)胞排列松散,間隙明顯增寬,培養(yǎng)基中可見大量漂浮細(xì)胞,隨著藥物濃度增加,細(xì)胞狀態(tài)變差更為明顯。見圖2。

    圖2 各組A549細(xì)胞形態(tài)(×400)

    4.3 湖北楓楊總黃酮對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響

    流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,楓楊總黃酮各劑量組A549細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)。見表1、圖3。

    表1 各組A549細(xì)胞凋亡率比較(±s,%)

    表1 各組A549細(xì)胞凋亡率比較(±s,%)

    注:與對(duì)照組比較,**P<0.01

    凋亡率1.38±0.39 21.74±0.73**30.03±0.25**39.39±0.34**組別對(duì)照組楓楊總黃酮低劑量組楓楊總黃酮中劑量組楓楊總黃酮高劑量組n 3 3 3 3

    圖3 各組A549細(xì)胞凋亡檢測流式圖

    4.4 湖北楓楊總黃酮對(duì)A549細(xì)胞周期的影響

    流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,楓楊總黃酮各劑量組A549細(xì)胞G0/G1期比例明顯增加(P<0.01),S期細(xì)胞比例明顯減少(P<0.01)。見表2。

    表2 各組A549細(xì)胞周期比較(±s,%)

    表2 各組A549細(xì)胞周期比較(±s,%)

    注:與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01

    組別對(duì)照組楓楊總黃酮低劑量組楓楊總黃酮中劑量組楓楊總黃酮高劑量組G2/M期12.19±1.69 12.11±1.79 10.13±2.19 8.28±1.05*n 3 3 3 3 G0/G1期56.62±1.56 62.28±0.87**67.74±1.49**73.13±1.92**S期31.19±1.86 25.64±1.20**22.13±0.71**18.60±0.89**

    4.5 湖北楓楊總黃酮對(duì)A549細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

    Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,楓楊總黃酮各劑量組細(xì)胞Fas、Bax、Cleaved Caspase-3、P27蛋白表達(dá)明顯升高,Cyclin D1 蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05,P<0.01),楓楊總黃酮中、高劑量組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。見圖4。

    圖4 各組A549細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)蛋白表達(dá)比較(±s,n=3)

    5 討論

    細(xì)胞增殖和凋亡失調(diào)與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān),細(xì)胞凋亡在細(xì)胞生長發(fā)育中起重要作用,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為癌癥治療的一種策略[9-10]。細(xì)胞凋亡主要存在內(nèi)在(線粒體)途徑和外在死亡受體途徑[11]。Bcl-2家族蛋白是內(nèi)在途徑的中心調(diào)節(jié)因子,通過調(diào)節(jié)cyt-c和其他凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)改變線粒體膜通透性,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[12-13],主要由促凋亡蛋白(如Bax)和抗凋亡蛋白(如Bcl-2)組成,Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平是決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡途徑的關(guān)鍵因素[14-15];在外源性死亡受體通路中,F(xiàn)as是一種細(xì)胞表面蛋白,是重要的死亡受體之一[16],通過與抗體或Fas配體(FasL)交聯(lián)可介導(dǎo)快速凋亡[17]。有研究表明,F(xiàn)as在包括肺癌在內(nèi)的各種癌癥中表達(dá)下調(diào)[18]。以上2種途徑最終會(huì)導(dǎo)致Caspase家族蛋白激活,特別是作為關(guān)鍵效應(yīng)因子的Caspase-3[19]。在正常情況下,Caspase-3以無活性前體存在于細(xì)胞中,在應(yīng)激條件下被切割以產(chǎn)生介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性片段,Caspase-3激活是細(xì)胞進(jìn)入不可逆凋亡階段的標(biāo)志[20-22]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測楓楊總黃酮對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并且可以上調(diào)死亡受體蛋白Fas、促凋亡蛋白Bax表達(dá),降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá),促進(jìn)Caspase-3活化,上調(diào)Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)(P<0.05,P<0.01)。提示湖北楓楊總黃酮可能通過激活內(nèi)在途徑和外在途徑促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡。

    除細(xì)胞凋亡外,細(xì)胞周期停滯是抑制癌細(xì)胞增殖的另一作用機(jī)制[23]。在細(xì)胞周期進(jìn)程中,主要由細(xì)胞周期蛋白Cyclins、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(Cdks)及Cdks抑制劑共同協(xié)調(diào)發(fā)揮作用。Cdks本質(zhì)上是無活性的催化亞基,需要與激活伴侶細(xì)胞周期蛋白(關(guān)聯(lián)的調(diào)節(jié)亞基)結(jié)合,形成Cyclin-Cdk復(fù)合物以發(fā)揮在細(xì)胞增殖中的作用。另外,Cyclin-Cdk復(fù)合物可以與Cdks抑制劑結(jié)合,從而抑制激酶活性并阻止細(xì)胞周期進(jìn)程[24-25]。因此,細(xì)胞周期受特定周期相關(guān)蛋白的正向調(diào)節(jié),并受某些Cdks抑制因子的負(fù)向調(diào)節(jié)。Cyclin D1是調(diào)節(jié)G1期最重要的蛋白,P27是一種Cdks抑制劑,主要抑制從G1期到S期轉(zhuǎn)變的Cdks[26-27]。本研究結(jié)果表明,湖北楓楊總黃酮可以調(diào)節(jié)A549細(xì)胞Cyclin D1和P27蛋白表達(dá),誘導(dǎo)A549細(xì)胞G0/G1期阻滯,即湖北楓楊總黃酮作用A549細(xì)胞后可能干擾DNA的合成,并可能在此階段抑制A549細(xì)胞增殖。

    綜上所述,湖北楓楊總黃酮能抑制A549細(xì)胞增殖,其機(jī)制可能與激活線粒體和Fas介導(dǎo)的死亡受體通路以誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡、促進(jìn)A549細(xì)胞G0/G1期阻滯有關(guān)。

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