基于中西醫(yī)臨床病證特點的低氧性肺動脈高壓動物模型分析

譚駿嵐 ，易健， ，曹閑雅 ，王飛英 ，李霞 ，萬佳婧 ，謝思琳 ，周靈靈 ，陳惠蓮 ，張超 ，戴愛國 ，

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院呼吸疾病研究室，湖南 長沙 410208； 2.血管生物學(xué)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)湖南省高校重點實驗室，湖南 長沙 410208； 3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新實驗中心，湖南 長沙 410021；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410021

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是一種嚴(yán)重的進(jìn)展性疾病，可導(dǎo)致肺血管阻力和肺血管壓力進(jìn)行性升高，從而發(fā)展為右心室肥厚，心力衰竭甚至死亡[1]。低氧性PH屬PH中的第三類，由慢性缺氧/肺部疾病引起[2-3]。目前，PH患病人數(shù)約為全球人口的1%，65歲人群的PH患病率為10%，在我國約有1 200萬PH患者[4]。因此，越來越多研究關(guān)注其發(fā)病機(jī)制及相關(guān)藥物研發(fā)。動物模型是醫(yī)學(xué)實驗研究的主要載體，制備符合中西醫(yī)臨床病證特點的低氧性PH動物模型是開展實驗研究的前提，故建立穩(wěn)定可靠的動物模型對低氧性PH發(fā)病機(jī)制及臨床防治研究意義重大。

本課題組長期專注于低氧性PH的中西醫(yī)結(jié)合防治研究，具備慢性低氧、野百合堿、慢性缺氧/SU5416等多種PH動物模型的制備經(jīng)驗[5-7]。本文對當(dāng)前低氧性PH動物模型進(jìn)行歸納總結(jié)，分析其造模機(jī)制及臨床吻合度，為構(gòu)建符合中西醫(yī)臨床特點的低氧性PH動物模型提供參考。

1 中西醫(yī)認(rèn)識

臨床上低氧性PH的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，是多因素、多環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果：環(huán)境因素如粉塵、高原缺氧環(huán)境、香煙煙霧刺激等[8]，原發(fā)肺病如慢性阻塞性肺病、肺纖維化、間質(zhì)性肺病等[9]。無論何種病因引起的低氧性PH，肺血管重塑均為其核心病理特點，其中內(nèi)膜新生、肺動脈叢狀病變被認(rèn)為是低氧性PH的特征性病理改變[10]。

根據(jù)低氧性PH臨床癥狀和體征可將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“肺脹”“胸痹”“喘證”等范疇，尤以“肺脹”論多見?！鹅`樞·脹論》“肺脹者，虛滿而喘咳”，指出肺脹乃虛實相兼之復(fù)雜證候。《諸病源候論·咳逆短氣候》有“肺虛為微寒所傷，則咳嗽。嗽則氣還于肺間，則肺脹”，提示外邪侵肺則咳，肺主氣，咳久則清氣不足，導(dǎo)致宗氣虧虛，為本病發(fā)病關(guān)鍵。肺朝百脈，宗氣虛損則推動津液血液之力不足，津液不運則生水飲，氣不化飲，久則生痰，血液不行則心、肺脈絡(luò)積瘀，肺動脈壓力升高?？芍?，由宗氣虧虛導(dǎo)致的水、痰、瘀互結(jié)是本病主要病機(jī)，病位主要在肺、心、腎三臟，與肝、脾密切相關(guān)。

2 病證診斷標(biāo)準(zhǔn)

2.1 西醫(yī)診斷

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要通過對患者病史、臨床表現(xiàn)、超聲心動圖檢查、右心導(dǎo)管檢查、肺功能及血氣分析、影像學(xué)檢查、實驗室檢查等多項指標(biāo)進(jìn)行綜合診斷，其中右心導(dǎo)管檢查是診斷PH的“金標(biāo)準(zhǔn)”，超聲心動圖檢查對于臨床診斷低氧性PH極其重要。根據(jù)《中國肺動脈高壓診斷與治療指南（2021版）》[11]，診斷標(biāo)準(zhǔn)包括：①平均肺動脈壓≥25 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）；②超聲心動圖發(fā)現(xiàn)PH特征性改變；③胸部X線、CT、肺動脈造影、磁共振成像等發(fā)現(xiàn)PH特征性影像學(xué)改變；④慢性肺部疾病如慢性阻塞性肺疾?。–OPD）、肺纖維化等病史；⑤限制性通氣功能障礙及肺彌散功能下降；⑥活動后氣短、疲倦乏力、胸悶、呼吸困難、胸痛，踝部、下肢甚至腹部、全身水腫等癥狀；⑦體格檢查：桶狀胸、杵狀指等；⑧外周血腦鈉肽（BNP）或N端腦鈉肽前體（NT-proBNP）升高。

2.2 中醫(yī)辨證分型

低氧性PH的中醫(yī)辨證分型參照《中醫(yī)內(nèi)科臨床診療指南·肺動脈高壓分冊》[12]擬定，見表1。

表1 低氧性PH中醫(yī)辨證分型

3 動物模型分析

3.1 模型動物選擇及評價

目前用于制備低氧性PH模型的動物有小鼠、大鼠、豚鼠、豬、牛、羊等[13-14]。由于雌激素是臨床PH的發(fā)病因素之一[15-16]，進(jìn)行PH模型復(fù)制時一般選擇雄性動物，從而排除雌激素對實驗的干擾。動物類別常用鼠類，以大鼠最為多見。大鼠與人類基因同源程度較高，且價格低、造模操作簡單、飼養(yǎng)方便，易于采用右心導(dǎo)管法測肺動脈壓力；經(jīng)典的低氧性PH模型常用單純慢性低氧或低氧聯(lián)合SU5416造模，小鼠體積小，方便置于低氧艙大批量造模，但其不便采用經(jīng)頸外靜脈右心導(dǎo)管法評估右心室收縮壓及肺動脈壓力。因此，進(jìn)行低氧性PH相關(guān)實驗時可根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的實驗動物。

低氧性PH動物模型評價主要采用右心導(dǎo)管法測量右心室收縮壓及平均肺動脈壓，判斷模型是否制備成功。超聲心動圖及右心肥厚指數(shù)常用于評價右心功能。HE 染色用于評估肺血管重塑程度。此外，也常用Masson三色染色評估肺及心臟的纖維化程度。

3.2 常見動物模型與臨床吻合度

低氧性PH動物模型的造模方法主要包括慢性低氧、SU5416/慢性低氧、香煙煙霧誘導(dǎo)、博來霉素誘導(dǎo)、野百合堿/慢性低氧，不同方法各有優(yōu)缺點，尚未形成統(tǒng)一的中西病證評價標(biāo)準(zhǔn)。本研究基于西醫(yī)診斷及中醫(yī)辨證分型的標(biāo)準(zhǔn)綜合評估低氧性PH動物模型的臨床吻合度[17]，見表2。

表2 低氧性PH常見動物模型及評價

4 討論

目前中西醫(yī)結(jié)合治療低氧性PH在臨床應(yīng)用廣泛。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為低氧性PH病機(jī)虛實夾雜，以肺氣不足導(dǎo)致的宗氣虧虛為本，水、痰、瘀等病理因素互結(jié)為標(biāo)，中藥可多靶點、多環(huán)節(jié)、多層次治療低氧性PH。已有研究者對PH病證結(jié)合模型進(jìn)行初探，戴姣等[30]采用多因素整合誘導(dǎo)構(gòu)建PH氣虛血瘀證病證結(jié)合大鼠模型，通過觀察大鼠的行為學(xué)改變及舌象進(jìn)行模型辨證及評價。但目前仍缺乏對低氧性PH大鼠中醫(yī)證候及其辨證機(jī)制的深入研究。本文通過歸納常見低氧性PH動物模型，根據(jù)西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)和中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)包括的癥狀特點對模型進(jìn)行評價，注重低氧性PH與中醫(yī)證候的關(guān)聯(lián)性，為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。

4.1 模型吻合度

長期慢性缺氧是低氧性PH 最關(guān)鍵的發(fā)病因素。目前大部分低氧性PH模型造模方法在一定程度上可反映其基本臨床癥狀。由表2 可知，SU5416/慢性低氧、香煙煙霧誘導(dǎo)模型吻合度較高，野百合堿/慢性低氧、博來霉素誘導(dǎo)模型吻合度中，慢性低氧模型吻合度低。相較于慢性低氧誘導(dǎo)的模型，香煙煙霧誘導(dǎo)模型及博來霉素誘導(dǎo)模型與中醫(yī)氣虛血瘀痰阻證吻合度更高，其中香煙煙霧誘導(dǎo)模型更適用于COPD并發(fā)PH研究，博來霉素誘導(dǎo)模型更適用于肺纖維化并發(fā)PH研究。SU5416/慢性低氧模型與低氧性PH病理改變吻合度高，適合于中醫(yī)陽虛水泛證研究。野百合堿/慢性低氧模型也適用于中醫(yī)陽虛水泛證研究，但動物死亡率較高。目前常見的動物模型中尚缺乏與瘀阻肺絡(luò)證較吻合的模型，整體而言動物模型與西醫(yī)診斷吻合度高，與中醫(yī)辨證分型吻合度偏低。

臨床吻合度高的模型可在中藥新藥評價中發(fā)揮作用。劉敏等[31]采用香煙煙霧誘導(dǎo)PH大鼠模型，發(fā)現(xiàn)復(fù)方葶藶子湯能通過抑制NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡改善肺血管重塑，降低平均肺動脈壓。Kurosawa等[32]發(fā)現(xiàn)雷公藤主要活性成分雷公藤紅素能降低SU5416/慢性低氧模型大鼠的肺血管重塑及平均肺動脈壓，并改善右心功能。但以上動物模型仍存在局限性，如SU5416/慢性低氧模型雖與臨床低氧性PH吻合度高，能模擬嚴(yán)重叢狀病變形，但其造模周期長、成本較高。香煙煙霧誘導(dǎo)模型雖能較好模擬臨床上慢性肺病如COPD及并發(fā)PH的病理改變過程，但造模周期長且模型穩(wěn)定性欠佳。慢性低氧模型雖吻合度低，但因其造模方法簡便、重復(fù)性高、成本低廉，目前在低氧性PH發(fā)病機(jī)制及相關(guān)藥理研究中廣泛應(yīng)用。

4.2 存在的問題

當(dāng)前低氧性PH動物模型造模方法皆以西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)中肺動脈壓升高為主要標(biāo)準(zhǔn)，均基于臨床的主要癥狀進(jìn)行復(fù)制，在一定程度上可模擬低氧性PH的西醫(yī)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，但在一定程度上缺乏中醫(yī)診療指標(biāo)。目前病證結(jié)合的低氧性PH動物模型研究較少，究其原因主要為：①中醫(yī)證候難以在動物上體現(xiàn)，尤其是舌象與脈象，這是構(gòu)建病證結(jié)合動物模型的難點。②病與證的模型構(gòu)建順序存在較大爭議。中醫(yī)病證結(jié)合動物模型無論“先病后證”“先證后病”還是“病證同施”都存在局限性，與中醫(yī)證候的臨床實際有一定差別。同時，病的模型、證的模型及病證結(jié)合模型難以區(qū)別，因為疾病模型本身就會出現(xiàn)證型變化，而證的模型也可能導(dǎo)致疾病發(fā)生。③低氧性PH疾病模型構(gòu)建方法造成的局限性。長期慢性低氧需將動物放置低氧艙每天規(guī)律低氧，這一過程極大限制了對模型證的因素干預(yù)。并且在低氧性PH復(fù)合模型基礎(chǔ)上添加證的施加因素，可能進(jìn)一步提高動物的死亡率，導(dǎo)致造模失敗。

4.3 發(fā)展思路

4.3.1 動態(tài)收集動物模型的中醫(yī)證候信息

研究需轉(zhuǎn)變觀念，以目標(biāo)為導(dǎo)向，以疾病模型為基礎(chǔ)，在病的模型基礎(chǔ)上，以四診為主，動態(tài)觀察模式動物的宏觀表征，大樣本收集動物的中醫(yī)證候信息。通過仔細(xì)觀察大鼠、小鼠的爪和尾部來充分獲取證候信息。動物的脈診常無法有效實現(xiàn)，可通過心電圖與心律的監(jiān)測在一定程度上補(bǔ)充。在低氧性PH的發(fā)病過程中，存在中醫(yī)證候發(fā)展與演變過程，因而需結(jié)合中醫(yī)證候評價標(biāo)準(zhǔn)，采取全程動態(tài)方式觀察實驗動物的癥狀表現(xiàn)，全面獲取模式動物的中醫(yī)證候信息。

4.3.2 量化證候診斷標(biāo)準(zhǔn)

采用現(xiàn)代生物技術(shù)如代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等檢測相關(guān)證候的標(biāo)志性微觀物質(zhì)，進(jìn)一步量化對模型動物證候的判斷。周曼麗等[33]發(fā)現(xiàn)，冠心病心血瘀阻證大鼠心肌代謝產(chǎn)物主要涉及氨基酸代謝、脂類代謝和嘌呤代謝等多個層面，其中L-苯丙氨酸、L-異亮氨酸、?；撬徇@3種代謝物有望作為標(biāo)志物單獨或者聯(lián)合用于冠心病心血瘀阻證的早期診斷。呂李飛等[34]發(fā)現(xiàn)慢性心力衰竭氣虛血瘀證模型大鼠糖脂代謝、膽汁酸代謝及氨基酸代謝等代謝途徑發(fā)生異常。于婉晨等[35]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，虛寒模型大鼠出現(xiàn)以刺激、防御應(yīng)答為代表的多種免疫應(yīng)答相關(guān)基因表達(dá)的下調(diào)，影響機(jī)體的免疫應(yīng)答功能。這些研究可為探究低氧性PH動物模型相關(guān)證候的標(biāo)志性微觀物質(zhì)提供參考。

4.3.3 完善動物模型的中醫(yī)證候評價體系

借鑒已經(jīng)建立的證候診斷標(biāo)準(zhǔn)對動物“四診”信息進(jìn)行參數(shù)提取，并進(jìn)一步進(jìn)行證候判定，得出證名，建設(shè)中醫(yī)證候體系，完善中醫(yī)低氧性PH動物模型評價標(biāo)準(zhǔn)。納入“以方測證”評價體系?！耙苑綔y證”是根據(jù)方證對應(yīng)的原理，利用特定方劑治療后的效果反證模型所屬中醫(yī)證候類型。目前，可對現(xiàn)有低氧性PH動物模型予以補(bǔ)陽還五湯等湯劑干預(yù)，根據(jù)療效推測其中醫(yī)證型。將動物的行為學(xué)表現(xiàn)轉(zhuǎn)化為中醫(yī)證候判斷，從而完善中醫(yī)證候動物行為評價指標(biāo)。如出現(xiàn)血瘀證的動物可能表現(xiàn)為爪甲發(fā)紫、體毛枯疏失去光澤、易激惹。

5 結(jié)語

綜上所述，目前低氧性PH動物模型吻合度高的模型為SU5416/慢性低氧、香煙煙霧誘導(dǎo)模型，但吻合度低的慢性低氧模型因其造模優(yōu)勢同樣應(yīng)用廣泛，具有較大應(yīng)用價值。本文通過歸納常見的低氧性PH動物模型，根據(jù)西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)和中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)對模型進(jìn)行評價，找出吻合中西醫(yī)病證特點的低氧性PH動物模型發(fā)展受限的主要原因，并提出動態(tài)收集動物模型中醫(yī)證候信息、量化證候診斷標(biāo)準(zhǔn)、完善動物模型中醫(yī)證候評價體系的發(fā)展思路，以期為后續(xù)研究貼合臨床實際的病證結(jié)合動物模型提供參考。