微流控芯片技術檢測蝦四種病原微生物方法的建立

劉洋，陳本龍，吳冬雪，黃晨，王乃福，李丹丹，王綏家，盧先東，劉艷紅

（1.天津海關動植物與食品檢測中心，天津 300451；2.中國人民共和國?？诤ｊP，海南 ?？?570311；3.寧波愛基因科技有限公司，浙江 寧波 315100）

近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)的迅猛增長，各種病害接踵而來，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失,水生動物疫病的預防監(jiān)控也更加重要?？焖?、準確、高通量的檢測技術成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迫切的需求。目前水生動物疫病檢測技術逐步趨向于多病原同時檢測方向發(fā)展，如同時檢測白斑綜合征病毒（White spot syndrome virus,WSSV）、傳染性表皮與造血組織壞死病毒（infectious hypodermal and haem atopoietic necrosis virus,IHHNV）、桃拉綜合征病毒（Taura syndrome virus，TSV）和黃頭病毒（Yellow head virus，YHV）等多重RT-PCR 檢測方法[1]。如WSSV、TSV 和YHV 同時檢測的液相芯片方法[2]。這些方法為提高檢測效率，加強水產(chǎn)養(yǎng)殖疫病防控發(fā)揮了重要作用。

WSSV、TSV 和YHV 是廣泛傳染并嚴重影響對蝦養(yǎng)殖的三種病毒，并稱為“影響世界對蝦養(yǎng)殖業(yè)的三大病害”[3]。引起的蝦白斑綜合征、桃拉綜合征和黃頭病均屬世界動物衛(wèi)生組織（Office International Des Epizooties,OIE）規(guī)定的必需上報的疫病，給國內養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失。蝦血細胞虹彩病毒（Shrilnp hemocyte iridescent virus，SHIV）和紅螯螯蝦虹彩病毒（Cherax quadricarinatus iridovius，CQIV）是近年報道的虹彩病毒科中，可感染甲殼類的2 種新發(fā)病毒，嚴重威脅蝦類養(yǎng)殖業(yè)。這兩種病毒基因組同源性99.97%，2019 年國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）將二者作為2 個病毒株，統(tǒng)一命名為十足目虹彩病毒1（Decapod iridescent virus,DIV1）[4,5]。我國浙江省、廣東省、山東省和河北省均有較高DIV1 檢出率。這表明，DIV1 已成為對蝦類養(yǎng)殖面臨的巨大威脅[6]，嚴重阻礙了蝦類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。2020 年我國農業(yè)農村部和海關總署也正式將DIV1 列位二類疫病。

環(huán)介導等溫擴增技術（LAMP）是由日本研究人員Notomi[7]及其團隊與2000 年首次提出。其主要具有以下特點：（1）特異性高，靶基因上的六個區(qū)域被四條特異性LAMP 引物嚴格識別，因此，體系中的基質基本不會干擾到整個LAMP 反應過程，特異性增強，非特異性擴增減少[8]；（2）靈敏度高，通常LAMP反應的靈敏度比傳統(tǒng)PCR 方法高100～1 000 倍，與熒光定量PCR 相比可以持平或更高[9]，有相關報道表明，最低可檢出10 個基因拷貝或更低檢測限[10,11]，比常規(guī)方法敏感性更強[12]；（3）反應時間短，因為整個擴增過程省去了DNA 變性步驟[13]和溫度變化的過程，大大減少了反應時間[14]，Nagamine[15]等提出通過加入環(huán)形引物，可以有效提高擴增效率[16]。

微流控芯片技術[17]具有樣品消耗少、檢測快速、易于實現(xiàn)自動化等特點，在臨床醫(yī)學檢驗、分析化學、分子生物學等研究領域的應用越來越多[18]。微流控芯片不僅能將同一試驗的多個步驟集成到一步完成，還能將多個試驗集成到一個試驗中完成[19]，在微生物檢測中凸顯優(yōu)勢[20-22]。將其與LAMP相結合，形成一種高通量快速核酸檢測技術[23]，本研究利用微流控芯片檢測技術，建立了一種同時檢測WSSV、TSV、YHV、DIV1 的方法，對方法的敏感性、特異性、重復性進行了驗證，并在臨床檢測中初步應用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

寧波愛基因科技有限公司生產(chǎn)的預混液rTaq酶、dNTP 水購自Takara 公司；MA2000 型微流控芯片檢測儀購自寧波愛基因科技有限公司；YHV 使用的陽性質粒，由寧波愛基因科技有限公司合成，病毒總核酸抽提試劑盒購自麥諾迪（上海）生物科技有限公司。

1.2 陽性質粒和臨床樣品

本研究使用的DIV1、EHP 陽性質粒由寧波愛基因科技有限公司合成。WSSV、TSV、YHV 毒株和陽性病料為本實驗室保存，陽性質粒由本實驗室通過PCR 擴增并連接到pMD19-T 載體制備。臨床樣品來自本實驗室2021 年收集的天津進境蝦產(chǎn)品。用剪刀剪取蝦的部分肝胰腺、胃、腸和肌肉，碎混勻后將采集的樣品，按每克樣品加入1 mL TN 緩沖液，勻漿。勻漿液轉移至1.5 mL 離心管中，4℃2 000 r/min 離心5 min，吸取上清液備用。

1.3 核酸提取和cDNA 模板制備

RNA 提取及cDNA 合成：取200 μL 上清液,加入1.5 mL 離心管中，按照核酸提取試劑盒說明書操作提取，所得RNA 溶液保存于-70℃。取15 μL RNA 溶液，加10 倍逆轉錄酶濃縮緩沖液2 μL、dNTP 0.5 μL、引物（144R）0.5 μL、RNA 酶抑制劑1 μL、逆轉錄酶1 μL?；靹蚝螅肞CR 儀上經(jīng)42℃40 min、70℃10 min，即得cDNA 模板。

DNA 提?。喝?00 μL 上清液，按照試劑盒說明書的操作方法提取核酸DNA 作為PCR 反應模板。

1.4 LAMP 引物設計與合成

查詢美國國立生物信息技術中心得到已公布的WSSV、DIV1、TSV 和YHV 四種病毒的基因,結合相關文獻報道，確定四種病毒特異性靶基因。用DNA Star V7.1 生物學軟件進行對比，找出病毒基因保守序列，在線導入Primer Explorer 5.0 軟件（http://primere xplorer.jp/e/），分別設計四種病毒LAMP 引物（表1）。所有引物均由寧波愛基因科技有限公司合成。

表1 四種蝦病毒LAMP 引物序列Tab.1 LAMP primer sequences of four shrimp viruses

1.5 微流控芯片制作

微流控芯片整體是由四個單元組成，外形為圓盤狀，每個單元有內環(huán)兩個加樣孔和外環(huán)8 個反應孔組成。每個加樣孔分別與四個反應孔相連接，加樣孔之間、反應孔之間相互隔絕。在每個反應孔中加入45 μL 混合液，包括預混液R（由聚合酶緩沖液、熒光染料和不同引物組成）36 μL、Taq 酶2 μL、dNTP 水7 μL。在每個加樣孔加入待檢模板20 μL。用透明膜將反應孔和加樣孔封閉，反復刮膜確保密封性。將芯片固定在儀器托盤上，蓋上儀器蓋。反應條件設定為：低速運行1 600 r/min，運行10 s；高速4 000 r/min 運行30 s；63.5℃下孵育1 h，熒光通道選擇FAM。反應結束后，查看熒光擴增曲線判定結果。

2 結果與分析

2.1 微流控芯片檢測的靈敏度實驗

將絕對定量的106copies/μL 四種病毒的陽性質粒分別進行10 倍系列稀釋，得到106、105、104、103、102、101和100的稀釋液，將各濃度的質粒分別作為模板，加入芯片加樣孔中，用于檢測反應體系的靈敏度。擴增結果如圖1～圖4。本研究建立的微流控檢測法對WSSV 的檢測限為102copies/μL，TSV 的檢測限為103copies/μL，YHV 的檢測限為102copies/μL，DIV1 的檢測限為102copies/μL。

圖1 微流控芯片檢測WSSD 的敏感性試驗Fig.1 Sensitivity test of microfluidic chip for detection of WSSD

圖2 微流控芯片檢測TSV 的敏感性試驗Fig.2 Sensitivity test of microfluidic chip for detection of TSV

圖3 微流控芯片檢測YHV 的敏感性試驗Fig.3 Sensitivity test of microfluidic chip for detection of YHV

圖4 微流控芯片檢測DIV1 的敏感性試驗Fig.4 Sensitivity test of microfluidic chip for detection of DIV1

2.2 微流控芯片檢測的特異性實驗

為驗證本研究的特異性效果，將白斑綜合癥病毒（WSSV）、對蝦桃拉綜合癥病毒（TSV）、黃頭病毒（YHV）和十足目虹彩病毒（DIV1）四種病毒優(yōu)化后的LAMP 反應體系分別點制在不同反應孔中，然后將WSSV、TSV、YHV、DIV1 的核酸樣本分別加入不同反應加樣孔內，并將EHP 和健康蝦核酸樣本的反應孔標記為陰性對照，檢測特異性。圖5～圖8 擴增結果顯示，經(jīng)過30 min 反應后，不同病毒樣本的反應孔均出現(xiàn)單一的、相應擴增曲線，無其他擴增信號，證明分別建立的四種蝦病檢測方法與其他病毒無交叉反應。

圖5 微流控芯片檢測WSSD 的特異性試驗Fig.5 Specific test of microfluidic chip for detection of WSSD

圖6 微流控芯片檢測TSV 的特異性試驗Fig.6 Specific test of microfluidic chip for detection of TSV

圖7 微流控芯片檢測YHV 的特異性試驗Fig.7 Specific test of microfluidic chip for detection of YHV

圖8 微流控芯片檢測DIV1 的特異性試驗Fig.8 Specific test of microfluidic chip for detection of DIV1

2.3 微流控芯片檢測方法的重復性實驗

驗證本研究設計的微流控芯片檢測方法的重復性時，將濃度為104copies/μL 的陽性質粒模板分別加入到5 個加樣孔中，檢測結果見表2。WSSV、TSV、YHV 和DIV1 的 變 異 系 數(shù)CV 值 分 別 為2.41%、2.41%、3.01%,和3.79%，均小于5%，本研究建立的微流控芯片方法檢測WSSV、TSV、YHV、DIV1 重復性良好。

表2 微流控芯片檢測YHV 病毒的重復性Tab.2 Repeatability of YHV detected by microfluidic chip

2.4 臨床樣本檢測

取5 份健康蝦的部分肝胰腺、胃、腸和肌肉用剪刀剪碎混勻，轉移至1.5 mL 離心管中，加入10 μL 104copies/μL 的DIV1 陽性質粒，勻漿機研磨后作為DIV1 臨床陽性樣本。本實驗室保存的WSSV、TSV、YHV 陽性樣本各取5 份作為臨床陽性樣本待檢?？傆嫏z測了20 份陽性樣本，30 份健康樣本。檢出WSSV 陽性5 份，TSV 陽性5 份，YHV 陽性5 份，DIV1 陽性5 份，30 份健康樣本未出現(xiàn)熒光擴增曲線。所有檢出陽性樣本均為單一檢測項目陽性，未出現(xiàn)同時檢出2 種或多種檢測指標同為陽性情況，證明本方法特異性較好，檢測結果與實驗室用熒光PCR 檢測結果一致。

3 討論

LAMP 技術和微流控芯片技術均為新興的快速檢測技術，受到普遍關注。但將二者結合起來的相關文獻報道較少[24]。本研究將兩種技術相結合，建立可同時檢測多種水生病毒，為疫病的預防和口岸檢測工作提供一種快速、準確的檢測方法。

WSSV、TSV、YHV、DIV1 四種病毒均是目前嚴重影響我國蝦類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的病原。WSSV 是對蝦養(yǎng)殖危害最大的一種病毒[25]。WSSV 傳染力極強，其主要傳播途徑為水平傳播和垂直傳播[26]。感染后病程很短，一般蝦池發(fā)病后7～10 d 內死亡率可達100%。不僅感染對蝦，對淡水和海水中甲殼類動物也有感染的危害[27]。TSV 可引起桃拉綜合征，感染后死亡率40%～90%，幸存的感染蝦終身帶毒，是影響蝦類養(yǎng)殖最為嚴重的病原之一[28]。YHV 能使大多數(shù)養(yǎng)殖蝦感染，急性感染的病蝦在2～4 d 即出現(xiàn)停食等癥狀，死亡率很高，尤其對仔蝦和50～70 日齡幼蝦的死亡威脅更大，死亡率高80%～90%[29]。感染DIV1 的病蝦呈現(xiàn)活力減弱、胃腸空癟等臨床癥狀，被感染的脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）和羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）的臨床癥狀還表現(xiàn)為額劍基部造血組織發(fā)白，即“白頭”癥狀[30]，死亡率可達50%以上[5]。

實驗結果表明，本研究建立的檢測方法具有以下特點：（1）特異性方面。與傳統(tǒng)PCR 方法相比，LAMP 技術同時針對靶基因6 個區(qū)域4 條特異性引物識別，特異性增強，體系中的基質基本不影響整個反應，降低了對實驗操作的要求。本方法檢測的四種病毒樣本，反應孔均出現(xiàn)單一的，相應的擴增曲線，并無其他擴增信號。（2）靈敏度方面。對WSSV、YHV、DIV1 的靈敏度達到102copies/μL，TSV的靈敏度為103copies/μL。在對35 份臨床樣品的檢測中，本方法的檢測結果與實驗室日常使用熒光PCR 檢測方法結果完全一致。（3）通量高，檢測時間短。四種病毒可同時進行檢測，30 min 內即可完成核酸擴增檢測。與傳統(tǒng)PCR 方法相比，極大地減少了檢測時間，解決了每次只能針對單一病毒檢測的問題，提高了檢測效率。（4）重復性方面。四種病毒各自對應的重復試驗的CV 值均小于5%，表明該方法重復性良好。（5）對實驗過程實時動態(tài)監(jiān)測。通過儀器對反應體系熒光的收集，可對擴增情況進行實時動態(tài)監(jiān)測。與普通PCR 和熒光PCR 方法相比，不需要電泳儀，凝膠成像分析系統(tǒng)，熒光PCR 儀等設備，大大降低了檢測成本。因此，本研究方法可用于四種蝦病毒的快速檢測。

本研究建立的微流控LAMP 芯片法，有檢測速度快，靈敏性高，特異性強，高通量的特點。常規(guī)的檢測方法實驗步驟繁雜，儀器體積較大，只限于實驗室操作。微流控芯片檢測儀本身體積較小，重量較輕便于攜帶，方便現(xiàn)場檢驗，可滿足相關檢測機構快檢快放的需求。雖然本研究中未出現(xiàn)多種病毒交叉感染的情況，但早先已有相關報道[31]，混合感染增加了防控病害的難度，快速簡便的檢測技術，對病害的防控起到積極的作用，這也說明能同時將多種病毒快速聯(lián)檢的技術會成為未來的發(fā)展方向。本研究方法在利用微流控LAMP 芯片技術檢測其他疫病方面也有一定的參考價值。