顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉肌肉蛋白差異表達(dá)分析

閆學(xué)春，張穎，欒培賢

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚(yú)類育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

同位素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation）技術(shù)（簡(jiǎn)稱iTRAQ）是美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（2004 年）推出的一項(xiàng)技術(shù)。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)可進(jìn)行多個(gè)樣品的蛋白質(zhì)組定量比較分析。由于對(duì)蛋白樣品的任何肽段都可以進(jìn)行標(biāo)記，可大幅度提高鑒定蛋白的覆蓋度和可信度[1-6]。目前，iTRAQ 技術(shù)已廣泛應(yīng)用于蛋白組學(xué)的定量研究[7-12]。而隨著鯉基因組計(jì)劃的完成，越來(lái)越多的鯉新基因已成功克隆，對(duì)于所獲得的大量未知基因的功能研究顯得日益重要。如今，生命科學(xué)已進(jìn)入了后基因組時(shí)代，系統(tǒng)生物學(xué)迅速發(fā)展，而蛋白組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要技術(shù)平臺(tái)，是從整體水平上認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的存在及活動(dòng)方式，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)則是進(jìn)行蛋白功能分析和基因表達(dá)調(diào)控的有力手段[13-15]。本研究依靠顯微介導(dǎo)遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)，將未經(jīng)遺傳修飾的中國(guó)對(duì)蝦總DNA 導(dǎo)入鯉（Cyprinus carpio）受精卵內(nèi)，以期通過(guò)這種基因組水平的遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)來(lái)改善鯉肌肉的品質(zhì)[16-18]。在測(cè)序前對(duì)顯微介導(dǎo)的中國(guó)對(duì)蝦基因鯉進(jìn)行AFLP檢測(cè)、產(chǎn)物凝膠測(cè)序和雙向蛋白電泳分析，通過(guò)確定供體基因片段以及肌肉營(yíng)養(yǎng)成分分析，最終篩選出高氨基酸含量的個(gè)體，再通過(guò)iTRAQ 技術(shù)對(duì)這些氨基酸含量高的個(gè)體進(jìn)行蛋白相對(duì)定量分析，找到了與氨基酸、脂肪酸密切相關(guān)的差異蛋白質(zhì)，并對(duì)這些差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO 功能注釋和KEGG 代謝通路分析[17]。這些研究結(jié)果，可為培育顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉的新品種提供科學(xué)依據(jù)。

鯉是我國(guó)及其他國(guó)家重要的淡水養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。它具有生長(zhǎng)速度快、抗寒能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但其肉質(zhì)欠佳[19,20]，而測(cè)定魚(yú)類肌肉營(yíng)養(yǎng)成分是了解魚(yú)類肉質(zhì)的最直接方法。目前對(duì)顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉肌肉品質(zhì)的研究多集中在肉質(zhì)指標(biāo)的常規(guī)研究上，而從轉(zhuǎn)錄和蛋白水平對(duì)顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉肌肉品質(zhì)的相關(guān)基因的研究還不夠深入。因此，有必要對(duì)顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉進(jìn)行深度測(cè)序和蛋白質(zhì)功能實(shí)驗(yàn)研究，利用現(xiàn)有的轉(zhuǎn)含鮮味氨基酸基因大片段DNA 基因鯉為基礎(chǔ)，利用蛋白質(zhì)譜定量技術(shù)，篩選顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉與正常鯉之間的差異蛋白，找出這些差異蛋白與哪些生物學(xué)功能相關(guān)，為培育出肉質(zhì)好的鯉新品種提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用魚(yú)為本課題組生產(chǎn)的1 齡顯微介導(dǎo)中國(guó)明對(duì)蝦基因鯉（黑龍江水產(chǎn)研究所生物技術(shù)室）和1 齡普通鯉（黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗(yàn)站）。測(cè)序前先通過(guò)普通SDS-PAGE 電泳檢測(cè)，確定了實(shí)驗(yàn)魚(yú)與對(duì)照魚(yú)有不同的帶型，說(shuō)明供體基因進(jìn)入到受體基因組的蛋白表達(dá)系統(tǒng)中后，再對(duì)這尾實(shí)驗(yàn)魚(yú)進(jìn)行定量蛋白質(zhì)測(cè)序分析。測(cè)序樣品為實(shí)驗(yàn)魚(yú)和對(duì)照魚(yú)各取1 尾，體質(zhì)量分別為228 g 和219 g。由華大基因公司完成測(cè)序。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)提取

提取蛋白中所用的試劑為：1 mmol/L PMSF、10 mmol/LDTT、丙酮、2 mmol/LEDTA、0.5 mol/L TEAB。將適量的魚(yú)肌肉加入蛋白裂解液溶解，然后依次加入上述各個(gè)試劑，通過(guò)超聲、離心，然后取上清液用于定量分析。詳細(xì)的蛋白提取方法參照文獻(xiàn)[3]。

1.2.2 蛋白質(zhì)SDS 電泳及酶解

根據(jù)華大基因iTRAQ 定量分析報(bào)告中提供的方法。SDS 電泳：首先配置12%的SDS 聚丙烯酰胺凝膠，反應(yīng)條件為95℃5 min，在120 V 恒壓下電泳120 min，電泳前，點(diǎn)樣量為每個(gè)實(shí)驗(yàn)魚(yú)和對(duì)照魚(yú)的蛋白樣品各取30 μg，Marker 的點(diǎn)樣量為10 μg，電泳結(jié)束后，進(jìn)行染色和脫色。酶解：各取100 μg 實(shí)驗(yàn)魚(yú)和對(duì)照魚(yú)的蛋白于試管中，分別加入酶和Trypsin（按蛋白和酶20∶1 的比例），在37℃下酶解4 h（第二次酶解8 h）。

1.2.3 iTRAQ 標(biāo)記

根據(jù)華大基因iTRAQ 定量分析報(bào)告中提供的方法。將經(jīng)胰蛋白酶消化后的實(shí)驗(yàn)魚(yú)和對(duì)照魚(yú)蛋白質(zhì)樣品用真空離心泵抽干肽段，再?gòu)?fù)溶肽段（0.5 mol/L TEAB），按照手冊(cè)進(jìn)行iTRAQ 標(biāo)記。

1.2.4 SCX 分離

根據(jù)華大基因iTRAQ 定量分析報(bào)告中提供的方法。反應(yīng)試劑為buffer A（25 mmol/L NaH2PO4in 25%A CN，pH2.7）、buffer B（25 mmol/L NaH2PO4，1 mol/L KCl in 25%ACN，pH2.7）；儀 器 采 用 島 津LC-20AB 液相系統(tǒng)；UltremexSCX 柱型號(hào)為4.6×250 mm（分離柱）。反應(yīng)過(guò)程為：將經(jīng)iTRAQ 標(biāo)記后抽干的各組肽段混合，用buffer A 復(fù)溶，再用buffer B（5%、60%、100%）洗脫（214 nm 吸光度檢測(cè)），除鹽（StrataX 除鹽柱），最后冷凍抽干。

1.2.5 生物信息學(xué)分析

在生物信息分析中，質(zhì)譜原始文件需要轉(zhuǎn)換成mgf 格式（sample.mgf）后才能被使用，mgf 文件主要包含了二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）譜圖的信息。本研究中使用Mascot2.3.02 蛋白鑒定軟件。操作時(shí)以mgf 文件為原始文件，選擇已建立好的鯉全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，然后用Mascot 進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和鑒定，對(duì)鑒定出的蛋白質(zhì)用GO 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能注釋分析和分類，再用COG 和KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這些蛋白的功能做進(jìn)一步的分析。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)差異蛋白基因

將在-80℃冰箱保存的對(duì)照魚(yú)和顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉肌肉組織的總RNA 取出，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，選取4 個(gè)差異表達(dá)蛋白（2 個(gè)上調(diào)，2 個(gè)下調(diào)），設(shè)計(jì)引物，以cDNA 為模板，β-肌動(dòng)蛋白（beta-actin）作為內(nèi)參基因，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min；95℃10 s，60℃15 s，72℃20 s，共40 個(gè)循環(huán)。在AB7500 定量PCR 儀上進(jìn)行PCR 反應(yīng)，按照TB GreenTM premix EX TagTMⅡ（Tli RnaseH Plus）（TaKaRa）熒光定量PCR 試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每個(gè)試驗(yàn)樣品重復(fù)3 次，取平均值來(lái)比較不同樣品基因表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉的蛋白質(zhì)鑒定

分別對(duì)顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉和對(duì)照魚(yú)進(jìn)行總蛋白提取和iTRAQ 定量分析（圖1），橫坐標(biāo)為鑒定類別，縱坐標(biāo)為數(shù)量。結(jié)果表明，共鑒定得到999 個(gè)蛋白，3 760 個(gè)肽段，其中含3 280 個(gè)Unique肽段。

圖1 顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉蛋白質(zhì)鑒定基本信息統(tǒng)計(jì)圖Fig.1 Statistical summary of protein identified in common carp micro-injected with total DNA of Chinese shrimp

2.2 顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉的差異蛋白質(zhì)鑒定

根據(jù)差異倍數(shù)>1.2 倍，P<0.05 的差異蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉和對(duì)照魚(yú)鑒定的總蛋白質(zhì)。結(jié)果表明，與正常組比較，篩選出差異蛋白92 個(gè)，表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)58 個(gè)，其中與脂肪酸有關(guān)的9 個(gè)，與氨基酸有關(guān)的2 個(gè)，與蛋白有關(guān)的1 個(gè)，與未知蛋白有關(guān)的1 個(gè)，與能量代謝有關(guān)的16 個(gè)，其他29 個(gè)；表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)有34 個(gè)，其中與蛋白有關(guān)的5 個(gè)，與核糖體有關(guān)的6 個(gè)，與氨基酸有關(guān)的2 個(gè)，有2 個(gè)與未知蛋白有關(guān)，其他19 個(gè)。

2.3 顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉的蛋白質(zhì)GO 功能分析

GO 主要分為細(xì)胞組分（Cellular Component）、分子功能（Molecular Function）和生物學(xué)過(guò)程（Biological Process）等3 個(gè)本體，在這3 個(gè)本體中共有53 個(gè)功能組，其中，細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過(guò)程分別含有16、14 和23 個(gè)功能組。在細(xì)胞組分分類功能中主要體現(xiàn)在細(xì)胞器（16.66%）、細(xì)胞器部分（11.49%）、細(xì)胞（20.30%）和細(xì)胞部分（20.30%）；在分子功能分類相關(guān)的蛋白質(zhì)功能主要是結(jié)合（44.99%）和催化活性（33.36%）兩部分；而在生物學(xué)過(guò)程分類中主要集中在細(xì)胞過(guò)程（14.80%）、單細(xì)胞過(guò)程（10.81%）和代謝過(guò)程（12.53%）（圖2）。

圖2 顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉蛋白質(zhì)的GO 分類Fig.2 Gene Ontology（GO）categories pattern of proteins in common carp micro-injected with total DNA of Chinese shrimp

2.4 顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉的蛋白質(zhì)COG 功能分析

COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins 蛋白相鄰類的聚簇）是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫(kù)。研究發(fā)現(xiàn)，COG 功能將667 個(gè)顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉肌肉蛋白分為22 類，數(shù)量最多的是預(yù)測(cè)僅有全局功能的101 個(gè)蛋白，并有76 個(gè)蛋白注釋為能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換功能，26 個(gè)蛋白注釋為氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝功能，10 個(gè)未知功能蛋白。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，功能序列在蛋白質(zhì)組表達(dá)中具有明顯的差異。圖3中的橫坐標(biāo)為COG 分類條目，縱坐標(biāo)為功能分類對(duì)應(yīng)的蛋白數(shù)量。

圖3 顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉COG 功能蛋白質(zhì)的統(tǒng)計(jì)數(shù)量分類圖Fig.3 COG classifications of unigenes in common carp micro-injected with total DNA of Chinese shrimp

2.5 顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉的差異蛋白的KEGG 代謝通路分析

通過(guò)對(duì)顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉的差異蛋白Pathway 富集分析表明，共有80 個(gè)差異蛋白富集于76 個(gè)代謝通路，顯著富集于代謝通路、亨廷頓病通路、帕金森氏癥通路、氧化磷酸化通路、脂肪酸代謝、蛋白質(zhì)消化吸收、賴氨酸降解、色氨酸代謝、核糖體、鈣信號(hào)通道、丙酮酸代謝及精氨酸和脯氨酸等12 個(gè)代謝通路。其中在精氨酸和脯氨酸代謝通路中，發(fā)現(xiàn)CL7255.Contig2_All（肌酸激酶，7.51 倍）發(fā)生了上調(diào)，在脂肪酸代謝通路中，發(fā)現(xiàn)CL4243.Contig1_All（線粒體三功能蛋白，0.59 倍）發(fā)生了下調(diào)。這兩種蛋白都可能對(duì)魚(yú)的肌肉發(fā)育和提高機(jī)體內(nèi)多種飽和與不飽和脂肪酸含量起重要作用。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證

選取CL7255（gi|4027929，肌酸激酶，creatine kinase，上調(diào)7.51 倍），U18791（gi|113951767，快速肌球蛋白結(jié)合蛋白，myosin binding protein，上調(diào)2.78倍），CL4243（gi|148224245，線粒體三功能蛋白，mitochondrial trifunctional protein,下調(diào)0.59 倍），U1232（gi|374463379，內(nèi)皮素，endolepine，下調(diào)0.67 倍）4個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證。結(jié)果顯示，圖4 中的2 個(gè)上調(diào)蛋白和圖5 中的兩個(gè)下調(diào)蛋白與iTRAQ 的結(jié)果一致。

圖4 顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉相關(guān)基因的定量PCR 驗(yàn)證（上調(diào)蛋白）Fig.4 Validation of differentially expressed gene in common carp micro-injected with total DNA of Chinese shrimp（down-regulated protein）by qPCR

圖5 顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉相關(guān)基因的定量PCR 驗(yàn)證（下調(diào)蛋白）Fig.5 Validation of differentially expressed gene in common carp micro -injected with total DNA of Chinese shrimp（down-regulated protein）by qPCR

3 討論

蛋白質(zhì)是魚(yú)肌肉中的主要組成成分，也是構(gòu)成魚(yú)肉組織結(jié)構(gòu)的主要物質(zhì)。它不僅含有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且蛋白質(zhì)的變化也會(huì)影響魚(yú)肉品質(zhì)，因此利用iTRAQ 技術(shù)對(duì)顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉的蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)序研究，希望能找出與魚(yú)肉品質(zhì)相關(guān)的標(biāo)記蛋白質(zhì)，這對(duì)了解魚(yú)肉蛋白質(zhì)組成特性和結(jié)構(gòu)特性，及鑒定和控制魚(yú)肉的品質(zhì)具有重要意義[21,22]。雖然將iTRAQ 技術(shù)用于顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉蛋白組研究還未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道，但該技術(shù)已成功用于其他魚(yú)類蛋白相關(guān)的研究中。如向玉婷[23]利用iTRAQ 技術(shù)首次對(duì)牙鲆（Paralichthys olivaceus）性腺中表達(dá)的蛋白進(jìn)行了測(cè)序，鑒定出了1 444 個(gè)蛋白，其中上調(diào)蛋白118 個(gè)，下調(diào)蛋白73 個(gè)，通過(guò)GO和Pathway 分析，鑒定出了牙鲆中的FMR1、CALB2和WDR1 三種蛋白相應(yīng)的基因，同時(shí)進(jìn)行了Western blot 和熒光定量PCR 檢驗(yàn)了上述三個(gè)蛋白，二者驗(yàn)證結(jié)果一致；陳金濤[24]對(duì)長(zhǎng)臀（Cranoglanis bouderius）中的未成熟和成熟的精子中蛋白組進(jìn)行iTRAQ 測(cè)序比較，鑒定出了1 941 個(gè)可信蛋白質(zhì)，找到了4 個(gè)對(duì)精子的發(fā)生有重要作用的差異表達(dá)蛋白，即PLCγ、PAK、Raf 和GSK-3。Ge 等[25]研究了利用iTRAQ 技術(shù)對(duì)斑馬魚(yú)（Barchydanio rerio var）的卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中蛋白質(zhì)譜的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有190 個(gè)蛋白質(zhì)在成熟卵母細(xì)胞與未成熟卵母細(xì)胞中發(fā)生明顯變化。Kohn 等[26]對(duì)長(zhǎng)體多鋸鱸（Polyprion oxygeneion）早期胚胎蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，發(fā)現(xiàn)了7 種可能作為生物標(biāo)志的蛋白質(zhì)。Yihe等[27]利用iTRAQ 技術(shù)去分析經(jīng)鹽度馴化的鰻魚(yú)鰓中蛋白質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)在鹽度為2.5%時(shí)，有336 個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，67 個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)，在鹽度為1%時(shí)，有33 個(gè)蛋白上調(diào)，32 個(gè)蛋白下調(diào)，并指出了在滲透調(diào)節(jié)中這些差異蛋白有可能存在著相互作用。iTRAQ 技術(shù)還在魚(yú)類分子免疫學(xué)研究[28,29]、硬骨魚(yú)肌間骨骼和肋骨發(fā)育的研究[30]和魚(yú)類感染菌病的免疫機(jī)制[31]等都有很強(qiáng)的應(yīng)用性。由此可見(jiàn)，利用iTRAQ 技術(shù)對(duì)魚(yú)類進(jìn)行差異蛋白分析與篩選，已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[32]。本研究利用iTRAQ 技術(shù)，定量分析了顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉和對(duì)照魚(yú)的蛋白質(zhì)差異，通過(guò)差異蛋白Pathway 富集分析表明，顯著富集于脂肪酸和氨基酸等代謝通路上的差異蛋白有13 個(gè)，其中在精氨酸和脯氨酸代謝通路中發(fā)現(xiàn)的上調(diào)7.51 倍的肌酸激酶（creatine kinase），在魚(yú)類中有促進(jìn)肌肉發(fā)育的作用；而在脂肪酸代謝通路中發(fā)現(xiàn)的下調(diào)0.59 倍的線粒體三功能蛋白（mitochondrial trifunctional protein），有提高魚(yú)體內(nèi)多種飽和與不飽和脂肪酸的作用[33-35]。

本研究中，在蛋白質(zhì)測(cè)序中篩選到的肌酸激酶（又稱肌酸磷酸激酶，CK）是呱基磷酸轉(zhuǎn)移酶家族的一員。它是催化某種生化反應(yīng)發(fā)生的酶類，是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮和ATP 再生有直接關(guān)系的重要激酶[36]。肌酸激酶是一種促進(jìn)ATP 生成的酶，能夠?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用儲(chǔ)存能量，能可逆地催化肌酸和三磷酸腺苷生成磷酸肌酸和二磷酸腺苷的反應(yīng)，在pH 中性條件下，以ATP 生成為主，以保證組織細(xì)胞的供能，正向反應(yīng)利于線粒體內(nèi)氧化磷酸化生成的ATP，以磷酸肌酸的形式進(jìn)入細(xì)胞液，滿足細(xì)胞生理活動(dòng)之需要，促進(jìn)細(xì)胞和組織的快速生長(zhǎng)和發(fā)育[37]。在正常的生理狀態(tài)下，CK 在細(xì)胞內(nèi)的功能是在肌酸分子上加一個(gè)磷酸基因，使肌酸轉(zhuǎn)化為高能分子磷酸肌酸，為細(xì)胞活動(dòng)提供能量，磷酸肌酸在心肌、骨骼肌及大腦中含量豐富，這個(gè)反應(yīng)由肌酸激酶催化。CK 廣泛存在于骨骼肌、心肌和腦組織中，在脊椎動(dòng)物中，肌酸與ATP 反應(yīng)可逆地生成磷酸肌酸，并儲(chǔ)存ATP 的高能磷酸鍵[38]。而魚(yú)類CK 的表達(dá)上升使催化產(chǎn)生大量的膦酸肌酸，為組織生長(zhǎng)提供能量，促進(jìn)肌肉發(fā)育[33]。

本實(shí)驗(yàn)中篩選的另一個(gè)蛋白是線粒體三功能蛋白（Mitochondrial trifunctional protein，MTP），在脂肪酸代謝通路中是下調(diào)蛋白。MTP 是一種線粒體內(nèi)膜上的蛋白質(zhì)，催化脂肪酸β-氧化四個(gè)步驟循環(huán)中的2-烯酰CoA 的水合、長(zhǎng)鏈-3-羥基脂酰CoA的脫氫和β-酮脂酰CoA 硫解的三個(gè)步驟，可增加脂肪酸合成的原料，使脂肪酸合成增加[39]。它是由四個(gè)α 亞基（HADHA）和四個(gè)β 亞基（HADHB）組成，其α 亞單位上有長(zhǎng)鏈三羥?；o酶A 脫氫酶，是催化脂肪酸氧化的主要代謝酶，因此其表達(dá)下調(diào)可抑制脂肪酸代謝，使其產(chǎn)生積累，可提高機(jī)體內(nèi)多種飽和與不飽和脂肪酸含量[34,35]。

綜上所述，從差異蛋白中尋找可能與含鮮味基因表達(dá)的相關(guān)蛋白，也就是要把一個(gè)基因組表達(dá)的絕大多數(shù)蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的定量和篩選，從而闡明性狀（高氨基酸）是如何從遺傳證據(jù)中產(chǎn)生的原因，這對(duì)提高鯉品質(zhì)的研究具有重要作用，有助于用作新靶點(diǎn)在鯉中發(fā)揮重要作用。當(dāng)然，對(duì)這些蛋白的進(jìn)一步深入研究，需要大量的后續(xù)分析及表達(dá)、功能水平的驗(yàn)證。相信隨著分析鑒定工作及功能基因?qū)W研究的進(jìn)一步發(fā)展，將會(huì)發(fā)現(xiàn)更多與品質(zhì)有關(guān)的信號(hào)和代謝途徑。iTRAQ 的測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步表明，鯉胚胎導(dǎo)入顯微介導(dǎo)中國(guó)明對(duì)蝦全基因組后，肌肉中氨基酸及脂肪酸代謝均發(fā)生變化。該技術(shù)可應(yīng)用于結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育優(yōu)質(zhì)的鯉新品種。