蒙藥石龍芮的質量標準研究*

李潤甜，渠 弼，蓮 花，牧 丹，那生桑，白文明

（內蒙古醫(yī)科大學，內蒙古 呼和浩特 010110）

蒙藥石龍芮為毛茛科植物石龍芮的全草，主要生長于潮濕地區(qū)、河（湖）邊，甚至水中，全國各地均有分布。石龍芮的蒙藥名稱為烏熱勒赫格-其其格，蒙醫(yī)藥古籍《認藥白晶鑒》[1]、《金光注釋集》[2]等均有記載。石龍芮具有破痞、調火、燥協(xié)日烏素、消腫、解毒等功效，主治消化不良、胃火衰敗、胸膈痞滿、蟲痞、協(xié)日烏素病、癰癤、瘰疬等病癥[3]。石龍芮含有毛茛苷、白頭翁素、原白頭翁素及黃酮類等多種活性成分[4-5]。經(jīng)現(xiàn)代藥理學研究證明，上述化學成分具有抗炎、鎮(zhèn)痛、殺菌、抗病毒及抗毒性等活性，如：石龍芮所含黃酮苷類、內酯類成分及毛茛總苷等具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用[6]，白頭翁素對葡萄球菌、鏈球菌、白喉桿菌、結核桿菌、大腸桿菌等具有較強的殺真菌活性的作用[7-8]，而且還具有一定的抗病毒及抗毒性作用[9]。石龍芮在蒙醫(yī)臨床上的廣泛應用已經(jīng)充分證明了石龍芮的藥用價值，但是由于石龍芮質量控制體系的不健全，很大程度上限制了藥材的正常流通和進一步研究開發(fā)工作。所以內蒙古自治區(qū)人民政府以內蒙古自治區(qū)科技廳和藥檢所為牽頭單位，依托內蒙古醫(yī)科大學的科研平臺設立了多個蒙藥材及炮制品質量標準研究項目，本研究為其中的重要組成部分。

目前石龍芮的質量控制標準研究基本處于空白階段，既無系統(tǒng)的質量標準又無科學的研究案例，質量評價主要是以外觀形狀作為判斷標準。為了提高石龍芮藥材質量控制的準確度，本研究將從性狀特征描述、顯微和薄層鑒別、水分和灰分（酸不溶性灰分）限度檢查、浸出物含量測定、藥效成分含量測定等方面進行分析研究，為建立科學評價石龍芮藥材藥用價值的質量標準體系提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

TU-1901型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；KSW-5-12型馬弗爐（天津市中環(huán)實驗電爐有限公司）；BX41-12P02型奧林巴斯生物顯微鏡（Olympus Corporation）；WD-9403E型紫外燈（北京六一生物科技有限公司）；DHG-9013A型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

蘆丁對照品（含量：92.6%，批號：100080-201610，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鹽酸均為市售分析純；水為自制去離子水。

7批石龍芮藥材為2016—2017年于內蒙古各地區(qū)采集獲得，經(jīng)內蒙古醫(yī)科大學藥學院生藥教研室渠弼副教授鑒定為毛茛科植物石龍芮Ranunculus sceleratus L.的全草。石龍芮藥材來源信息見表1。

表1 石龍芮藥材來源信息

2 方法及結果

2.1 性狀 本品長10～60 cm，根須狀，簇生，黃白色至黃棕色。莖扁圓柱形，直徑2～5 mm，表面黃白色至黃綠色，具細縱棱，被稀疏柔毛，質脆，斷面白色，纖維性，中空。葉多皺縮破碎，完整者葉片輪廓腎狀圓形，長1～4 cm，寬1.5～5 cm，3深裂或3全裂，表面黃綠色或綠色，疏生柔毛，葉柄基部膜質擴大抱莖。聚傘花序，花小，直徑4～8 mm，花冠5，黃色，花萼及花托被柔毛。聚合果矩圓形，長8～12 mm，瘦果卵圓形，稍扁，略偏斜，長約1 mm，表面具細皺紋，頂端具短喙，長約0.1～0.2 mm。氣微，味淡。（見圖1）

圖1 石龍芮藥材圖

2.2 鑒別

2.2.1 顯微鑒別 按照2020年版《中華人民共和國藥典》（通則2001）顯微鑒別法進行試驗。

本品入藥部位主要為莖、葉等器官，具體顯微特征均在粉末片中可察見，故將本品粉末特征列入標準。本品莖下部黃白色，上部黃綠色，葉為綠色，隨貯藏時間延長，顏色有所變淺，故粉末顏色暫定為黃綠色或灰綠色。

取本品不同批次的藥材粉末，制作粉末片，置顯微鏡下觀察，各批次結構基本一致。本品粉末黃綠色至灰綠色，上表皮細胞的細胞壁平直，下表皮細胞的細胞壁彎曲，氣孔不定式，副衛(wèi)細胞4～6個。非腺毛單細胞，稍彎曲?；ǚ哿ｎ惽蛐?，表面具顆粒狀雕紋，萌發(fā)孔3個，直徑23～31 μm。木纖維直徑12～20 μm，壁厚微木化。導管為螺紋、網(wǎng)紋、孔紋導管。不同批次的樣品均呈陽性，所以將上述顯微特征規(guī)定為石龍芮質量標準的顯微鑒別標準。（見圖2）

圖2 石龍芮藥材粉末的顯微鑒別圖

2.2.2 薄層鑒別 本品黃酮類化合物的含量較高且具有明顯的藥理活性，所以本研究選擇黃酮類物質蘆丁作為對照品，基于蘆丁與三氯化鋁的顯色反應建立薄層鑒別方法。

取本品粉末2 g，加稀乙醇50 mL，加熱回流1.5 h，放冷，濾過，濾液蒸至無醇味，加水10 mL，用石油醚（30～60 ℃）洗滌2次，每次20 mL，棄去石油醚液，水液加乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯，蒸干，殘渣加乙醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取蘆丁對照品適量，加乙醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。按照2020年版《中華人民共和國藥典》（通則0502）薄層色譜法進行試驗，吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點于同一聚酰胺薄膜，以乙醇-丙酮-水（7∶5∶6）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，熱風吹干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，斑點分離清晰，鑒別效果滿意。不同批次的樣品均呈陽性，故將上述方法規(guī)定為石龍芮的薄層鑒別法。（見圖3）

圖3 蘆丁鑒別的薄層色譜圖

2.3 檢查

2.3.1 水分 取各批次石龍芮粉末約3.0 g，精密稱定，按照2020年版《中華人民共和國藥典》（四部）（通則0832）水分測定法的第二法（烘干法）進行測定，每批樣品重復測定3次，計算平均值。結果：7批次石龍芮的水分含量范圍為8.28%～10.9%，平均含量為9.53%。（見表2）

表2 7 批次石龍芮中水分、水溶性浸出物、總灰分和酸不溶性灰分含量測定結果

2.3.2 總灰分、酸不溶性灰分 取各批次石龍芮粉末約3.0 g，精密稱定，按照2020年版《中華人民共和國藥典》（四部）（通則2302）灰分測定法進行測定，每批樣品重復測定3次，計算平均值。結果：7批次石龍芮中總灰分含量范圍為7.85%～10.30%，平均含量為9.09%，酸不溶性灰分含量范圍為1.95%～4.16%，平均含量為3.13%。（見表2）

2.4 浸出物含量 取各批次石龍芮粉末約4.0 g，精密稱定，本研究按照2020年版《中華人民共和國藥典》（通則2201）浸出物測定法（冷浸法）對各批次石龍芮藥材的浸出物進行測定，每批樣品重復測定3次，計算平均值。結果：7批樣品浸出物含量在19.64%～25.04%，平均含量為21.84%。（見表2）

2.5 總黃酮含量測定

2.5.1 供試品溶液的制備 取本品粗粉約1.0 g，精密稱定，置索氏提取器中，加乙醚適量，加熱回流至提取液無色（10 min虹吸1次，約需要2 h），放冷，棄去乙醚液。再加甲醇90 mL，加熱回流至提取液無色，轉移至100 mL量瓶中，用甲醇少量洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取3.0 mL，置25 mL量瓶中，加水至7.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，即得。

2.5.2 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品25 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇適量，置水浴上微熱使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取10 mL，置50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含蘆丁0.2 mg）。

2.5.3 線性關系考察 精密量取“2.5.2”項下對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分別置25.0 mL量瓶中，各加水至7.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10.0 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在508 nm波長處依次測定蘆丁標準溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結果，標準工作曲線的線性回歸系數(shù)r=0.999 7，回歸方程為Y=99.97X-0.536 7，表明總黃酮含量在0.00～57.57 μg/mL范圍內，呈良好的線性關系。

2.5.4 精密度試驗 按照“2.5.1”方法制得供試品溶液1份，依法連續(xù)測定6次，測得吸光度值。結果顯示，吸光度值的RSD為0.64%，表明儀器精密度良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗 按照“2.5.1”方法制得供試品溶液1份，分別于制得的0、1、2、4、6、8 h后，依法進行測定。結果顯示，吸光度值的RSD為0.48%，表明供試品溶液在8 h內穩(wěn)定。

2.5.6 重復性試驗 稱取同一批次（批號：20170608）樣品粉末6份，每份約1 g，精密稱定，按照供試品溶液制備方法制得供試品溶液，依法分別測定其吸光度值，采用標準曲線法計算總黃酮含量。結果顯示，總黃酮的平均含量為36.8 mg/g，RSD為1.68%，表明此法重復性良好。

2.5.7 加樣回收率試驗 稱取同一批次樣品（批號：20170608）粉末6份，每份約0.5g，精密稱定，按蘆丁對照品加入量與所取供試品中總黃酮含量之比1.5∶1.0、1.0∶1.0、0.5∶1.0加入蘆丁對照品，每一個比例平行2份，按照供試品溶液制備方法制得供試品溶液，依法測定其吸光度并計算加樣回收率。結果顯示，高、中、低比例供試品溶液中總黃酮的平均加樣回收率分別為97.69%、96.87%、98.48%，RSD分別為4.06%、0.66%、0.47%（n=3），表明此方法的準確度良好。（見表3）

表3 加樣回收率試驗結果 （n=2）

2.5.8 各批次樣品的總黃酮含量測定 取各批次樣品，按照“2.5.1”方法分別制得供試品溶液3份，依法測定總黃酮含量，分別計算各批次樣品總黃酮含量的平均值。結果顯示，編號1～7的石龍芮樣品的平均總黃酮含量分別為36.8、37.0、36.0、35.9、35.2、36.8、38.2 mg/g。

3 討論

3.1 藥材性狀、顯微鑒別與檢查 本研究于不同產(chǎn)地、不同年度采集獲得7批次石龍芮樣品。各批次樣品間外觀、形狀無明顯差異，各項植物性狀特征與蒙醫(yī)藥典籍[3]所描述的一致?，F(xiàn)行的石龍芮藥材鑒別手段主要是基于外觀性狀特征的分析方法，不僅方法專屬性弱而且對鑒別人員的專業(yè)知識儲備和經(jīng)驗要求較高，不適合于大范圍普及。本研究在系統(tǒng)歸納總結7批次石龍芮藥材莖、葉等器官的植物組織顯微特征的基礎上，制定了科學合理的顯微鑒別標準。

石龍芮藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物含量可作為檢查項對藥材儲存保管、運輸流通過程中雜質混入和摻假等問題進行有效的監(jiān)控[10]，但至今未見任何有關文獻報道，所以本研究對石龍芮藥材中的上述檢查項進行了測定。結果顯示，7批次石龍芮樣品中平均水分含量為9.53%，平均總灰分含量為9.09%，平均酸不溶性灰分含量為3.13%，平均水溶性浸出物含量為21.84%。制定上述檢查項限度值的過程中，需結合不同地區(qū)的自然環(huán)境、行業(yè)需求等制定出符合實際情況的質量標準。

3.2 薄層鑒別與含量測定 藥效或指標成分的理化鑒別和含量測定是在上述鑒別和檢查手段的基礎上進一步保證藥材品質的重要質量控制環(huán)節(jié)。黃酮類化合物是石龍芮藥材的重要次生代謝產(chǎn)物，經(jīng)現(xiàn)代藥理學研究證明黃酮類化合物具有抗炎、抑菌、抗腫瘤、降血糖、抗氧化等多種藥理作用[11-13]。石龍芮中含有的黃酮類化合物種類多且含量變化范圍寬，是石龍芮藥材發(fā)揮藥效的物質基礎。所以，石龍芮總黃酮的含量測定對保證藥材品質和臨床療效有重要的意義。蘆丁分子含有兩個共軛體系，是黃酮類化合物的典型結構，即鄰苯二酚，可作為石龍芮藥材質量控制環(huán)節(jié)中重要的指標成分[14-17]。本研究在參考毛茛科其他藥材的文獻報道和藥典收載的薄層鑒別和總黃酮含量測定方法的基礎上，經(jīng)實驗研究建立了基于蘆丁的薄層色譜鑒別方法和總黃酮含量測定方法。

本研究經(jīng)實驗研究確定了薄層色譜鑒別方法的提取工藝、展開劑種類及配比、顯色條件等，并對各批次樣品進行了薄層鑒別分析。7批次石龍芮樣品的供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，均顯示相同顏色的斑點。在對總黃酮含量進行測定時，雖然黃酮類成分在紫外區(qū)有吸收，但是石龍芮的化學成分復雜，會對總黃酮的測定產(chǎn)生干擾，所以本研究采用具有較高選擇性的顯色方法，即先用亞硝酸鈉還原黃酮類成分，再加硝酸鋁與之絡合，最后加氫氧化鈉溶液使黃酮類成分開環(huán)，生成2-羥基查爾酮從而顯色，顯色后對總黃酮含量進行定量分析。

在確定了供試品溶液和對照品溶液制備方法的基礎上，經(jīng)方法學考察試驗證明總黃酮含量測定方法在0.00～57.57μg/mL范圍內回歸系數(shù)r=0.999 7，連續(xù)測量6次的吸光度RSD=0.64%，供試品溶液制備后8 h內吸光度的RSD=0.48%，平行取樣6份測得的總黃酮含量的RSD=1.68%，3種不同比例加樣回收試驗的平均加樣回收率分別為97.69%、96.89%、98.48%，表明此方法可用于對石龍芮中總黃酮含量進行含量測定。按所建立的含量測定方法對7批次石龍芮藥材進行了總黃酮含量測定，結果顯示各批次石龍芮藥材中總黃酮含量無明顯差異，平均含量為36.6 mg/g。在制定含量標準時，應充分考慮不同自然環(huán)境、生長年份、采摘季節(jié)等因素的影響，制定出符合實際需求的質量標準。

現(xiàn)代分析測試技術在傳統(tǒng)蒙藥材質量標準中的應用研究不僅能提高藥材質量控制的準確度和精密度，同時也是提高蒙藥相關產(chǎn)品質量控制現(xiàn)代化程度的技術基礎。本研究建立的石龍芮質量標準快速簡便，且準確度高，可作為藥材流通或制劑過程中質量控制的標準方法。本標準的建立不僅對完善蒙藥石龍芮的質量標準體系具有重要的理論指導意義，也可以為其他植物類藥物質量標準的建立提供參考。