響應(yīng)面法優(yōu)化玄參種芽超聲提取哈巴苷、哈巴俄苷工藝*

趙 元，黃晨存，黃詩怡，袁志鷹，許光明

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208）

玄參為玄參科植物玄參（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）的干燥根，且為藥食兩用的藥材。環(huán)烯醚萜類和苯丙素苷類是玄參屬植物的主要化學(xué)成分，藥理研究表明其具有降血壓、抗血小板聚集、增強免疫功能、降血糖、抗氧化和抗腫瘤等作用[1]。2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定玄參主要成分為哈巴苷、哈巴俄苷[2]。玄參目前的藥用部位是其塊根部分。玄參種芽為玄參生長的地下根芽，現(xiàn)作為繁育或栽培用的繁殖組織。玄參種芽的產(chǎn)量大，但用于繁育的量不多，造成了大量玄參種芽的資源浪費[3-4]。前期研究[5-8]發(fā)現(xiàn)，玄參種芽中的化學(xué)成分與市面流通的玄參藥材的藥用化學(xué)成分高度相似，故可從化學(xué)成分入手，對玄參種芽進行相關(guān)研究，開發(fā)玄參種芽資源。目前，市面上玄參中哈巴苷等有效成分的提取主要使用傳統(tǒng)的熱水煎煮法或回流提取[9-10]，該方法耗時長、需高溫處理且提取效率低，且哈巴俄苷具有熱不穩(wěn)定性[11-12]。因此，筆者擬采用超聲輔助提取玄參種芽的有效成分，參考文獻[13-14]選擇不同料液比、浸泡時間和提取液濃度采用單因素試驗結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化玄參種芽提取工藝，通過HPLC法測定其含量[15-16]，得出玄參種芽最佳提取工藝，從而提高玄參種芽的提取效率，為后續(xù)玄參種芽研究提供理論依據(jù)與基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）（瑞典Nouryon公司）；ISO9001型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；040SD型超聲波清洗機（深圳市超潔科技實業(yè)有限公司）；GM-0.33A型隔膜真空泵（上海申生科技有限公司）；WGL-125B型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 藥物與試劑 玄參種芽采自湖南新邵常春藤種植基地，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室周小江教授鑒定為玄參科植物玄參（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）；哈巴苷對照品（批號：DST220312-058，純度≥98%）、哈巴俄苷對照品（批號：DST220113-059，純度≥98%）均購自四川省維克奇生物科技有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、磷酸（分析純）均購于美國TEDIA公司；實驗用水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 哈巴苷、哈巴俄苷的含量測定

2.1.1 色譜條件 Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%磷酸水溶液（B）-乙腈（A），梯度洗脫，洗脫程序為0～5 min，5%A～20%A；5～10 min，20%A～25%A；10～20 min，25%A～33%A；20～25 min，33%A～50%A；25～30 min，50%A～80%A；30～35 min，80%A；35～40 min，80%A～95%A；40 ～50 min，95%A～5%A；體積流量為1 mL/min；檢測波長為210nm；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC 圖

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱定哈巴苷對照品、哈巴俄苷對照品適量，加入甲醇配制成哈巴苷、哈巴俄苷質(zhì)量濃度分別為0.500、0.340 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2.2 供試品溶液的制備 玄參種芽采收后洗凈表面泥沙，進行發(fā)汗處理，將處理過后的玄參種芽粉碎成粉，精密稱取1.000 0 g，置于具塞錐形瓶中，分別加入不同濃度甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，浸泡一定時間，超聲處理（功率：500 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 線性關(guān)系考察 取“2.1.2.1”項下的混合對照品溶液用甲醇稀釋至不同濃度梯度，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，取20 μL，按照“2.1.1”項色譜條件進樣分析，以濃度為橫坐標（x），對應(yīng)的高效液相色譜峰面積為縱坐標（y），繪制標準曲線。結(jié)果哈巴苷、哈巴俄苷的回歸方程分別為y=5 354 876x+37 356（r=0.999 6）、y=29 309 518x+2 563（r=0.999 6）。表明哈巴苷、哈巴俄苷分別在15.63～500.00 μg/mL、10.63～340.00 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度試驗 精密吸取供試品溶液20 μL，連續(xù)進樣6次，測定各對照品峰面積。結(jié)果哈巴苷、哈巴俄苷峰面積的RSD分別為0.80%、1.98%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、8、16、24 h按“2.1.1”項下色譜條件進行分析，測定各對照品峰面積。結(jié)果哈巴苷、哈巴俄苷峰面積的RSD分別為1.27%、1.87%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 平行制備6份供試品溶液，每次進樣20 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進行分析，測定各對照品峰面積。結(jié)果哈巴苷、哈巴俄苷峰面積RSD分別為1.05%、1.49%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗 分別取6份同一批已知含量樣品0.500 0 g，加入混合對照品溶液，按“2.1.2.2”項下方法制備，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。結(jié)果哈巴苷、哈巴俄苷平均回收率分別為100.24%、100.56%，RSD分別為1.98%、1.19%，表明方法準確度良好。（見表1）

表1 加樣回收率試驗結(jié)果 （n=6）

2.2 單因素試驗 固定料液比為1∶50（g/mL），浸泡時間為30 min，考察不同甲醇濃度（30%、40%、50%、60%、70%）對玄參種芽提取的影響，篩選出最佳甲醇濃度；然后將其作為最佳條件固定，再分別考察料液比[1∶25、1∶50、1∶75、1∶100、1∶125（g/mL）]、浸泡時間（10、20、30、40、50 min）對玄參種芽提取的影響。每次改變1個因素，考察完1個因素后，將其最佳條件作為下1個因素的固定條件，直至完成全部單因素試驗。

2.2.1 甲醇濃度對提取的影響 經(jīng)不同濃度甲醇提取后，哈巴苷、哈巴俄苷的含量隨甲醇濃度的升高均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，且分別在40%甲醇、60%甲醇時達到最高值；哈巴苷與哈巴俄苷總含量隨甲醇濃度的升高也呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，并在40%甲醇時達到最高值。故選擇35%、40%、45%甲醇進行響應(yīng)面試驗。（見圖2A）

圖2 甲醇濃度（A）、料液比（B）及浸泡時間（C）對提取的影響圖

2.2.2 料液比對提取的影響 經(jīng)不同體積甲醇提取后，哈巴苷、哈巴俄苷的含量分別在料液比1∶25、1∶50時達到最高值；哈巴苷與哈巴俄苷總含量隨料液比的升高呈現(xiàn)先升高后降低再升高的變化趨勢，即1∶50＞1∶25＞1∶125＞1∶100＞1∶75，故選擇1∶40、1∶50、1∶60料液比（g/mL）進行響應(yīng)面試驗。（見圖2B）

2.2.3 浸泡時間對提取的影響 經(jīng)不同時間浸泡提取后，哈巴苷、哈巴俄苷的含量分別在20 min、30 min達到最高值；哈巴苷與哈巴俄苷總含量隨料液比的增加呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，即30 min＞20 min＞10 min＞40 min＞50 min，故選擇浸泡時間25、30、35 min進行響應(yīng)面試驗。（見圖2C）

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計 根據(jù)響應(yīng)面試驗設(shè)計（Box-Behnken design，BBD）原理，在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Design Expert 10設(shè)計實驗，以料液比（A）、甲醇濃度（B）、浸泡時間（C）作為自變量，以哈巴苷、哈巴俄苷總含量為考察指標，建立3因素3水平共17個實驗組合響應(yīng)面分析試驗數(shù)學(xué)模型對玄參種芽超聲提取工藝進行優(yōu)化[18]。設(shè)計因素與水平見表2，Box-Behnken結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken 設(shè)計因素水平

表3 Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

2.3.2 模型擬合及分析 運用Design Expert軟件對以上結(jié)果進行方差分析，得回歸方程：Y=1.72+0.069A+0.071B-0.063C+0.22AB-0.061AC+0.14BC-0.11A2-0.20B2+0.029C2，r=0.983 8。模型的方差分析結(jié)果見表4。線性模型F=23.53，P=0.000 2，表明該回歸方程差異性顯著。失擬項P=0.582 8，說明該實驗設(shè)計數(shù)據(jù)可靠。方差分析結(jié)果表明，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，按照對哈巴苷、哈巴俄苷總含量影響大小排序為A＞C＞B，除C2外，均達到顯著水平，其中甲醇濃度和浸泡時間為極顯著。

表4 模型方差分析

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果 通過Design Expert 12.0軟件繪制各指標與響應(yīng)值交互項的響應(yīng)面圖，可直觀評價各因素對玄參種芽中哈巴苷、哈巴俄苷總含量的影響。結(jié)果顯示隨著各因素的增加哈巴苷、哈巴俄苷總含量均呈現(xiàn)先增加后逐漸減少的趨勢。甲醇濃度和浸泡時間的曲面較陡峭，提示甲醇濃度和浸泡時間對哈巴苷、哈巴俄苷總含量影響較明顯。這與二次回歸模型中的方差分析結(jié)果一致。（見圖3～5）

圖4 甲醇濃度與浸泡時間的交互作用響應(yīng)面圖

圖5 料液比與浸泡時間的交互作用響應(yīng)面圖

2.3.4 驗證試驗 通過響應(yīng)面模型分析，預(yù)測最優(yōu)玄參種芽提取工藝為甲醇濃度44.34%、料液比1∶51、浸泡時間25.41 min，哈巴苷、哈巴俄苷總含量為1.84%。

為檢驗以上響應(yīng)面分析數(shù)據(jù)的可靠性，同時為了操作方便，本研究參數(shù)采用甲醇濃度44%、料液比1:50、浸泡時間25 min，進行3組平行試驗。結(jié)果實際測得哈巴苷、哈巴俄苷總含量分別為1.81%、1.86%、1.78%，RSD均小于2%。提示應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化得到的玄參種芽最佳提取條件準確、可靠，提取工藝具有良好的可行性及重復(fù)性。

3 討論

玄參具有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結(jié)之效，并在四妙勇安湯、增液承氣湯、清營湯等多個方劑中有重要應(yīng)用。玄參種芽產(chǎn)量高，僅用于繁育，資源浪費嚴重，極具開發(fā)價值。本課題組在玄參種芽與玄參化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上，對玄參種芽提取工藝進行研究。

單因素試驗可以看出：哈巴苷、哈巴俄苷總含量在甲醇濃度40%時達到最大值。環(huán)烯醚萜類成分在40%的甲醇溶液中的溶解性最好。當料液比較小時，玄參種芽提取不完全，這在一定程度上降低了哈巴苷、哈巴俄苷的含量；而料液比過大時，由于傳質(zhì)阻力，過量的溶劑不再起到提取的作用，反而會降低哈巴苷、哈巴俄苷的含量。隨著浸泡時間的延長，哈巴苷、哈巴俄苷總含量呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢；當浸泡30 min時，超聲提取所得的哈巴苷、哈巴俄苷總含量最高；隨著浸泡時間的延長，哈巴苷、哈巴俄苷總含量下降，如浸泡50 min后哈巴苷、哈巴俄苷總含量為最高總含量的90%左右。這可能是由于浸泡時間過短，玄參種芽粉末不能很好地分散，甚至聚集在溶劑中，因接觸面積的減少而影響了哈巴苷、哈巴俄苷的含量；浸泡時間過長會使玄參粉末中的糖類、蛋白質(zhì)等擴散出來，形成膠團依附于粉末表面，阻礙了環(huán)烯醚萜類的溶出，導(dǎo)致哈巴苷、哈巴俄苷含量降低。

本研究以玄參種芽為研究對象，以2020年版《中華人民共和國藥典》[2]規(guī)定玄參主要成分哈巴苷、哈巴俄苷含量為指標，在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken設(shè)計試驗方案[18-19]研究3個影響因素間的交互作用，再進行回歸分析[20-21]，從而得到影響因素的最佳組合與響應(yīng)值的最優(yōu)值[22-23]。玄參種芽哈巴苷、哈巴俄苷最佳提取工藝為甲醇濃度44%、料液比1∶51、浸泡25 min。該工藝穩(wěn)定可靠，有助于玄參種芽的提取，從中獲取哈巴苷、哈巴俄苷等有效成分，可為玄參種芽資源開發(fā)提供理論依據(jù)[24-25]。