陳 耀,肖文濤,葉玉海,陳偉毅(湖南醫(yī)藥學(xué)院,湖南 懷化 418000)
食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一,全世界每年約有30萬人死于食管癌。我國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一,每年平均病死約15萬人[1]。化療是治療食管癌的主要方法之一,然而食管癌對化療并不敏感,且耐藥性很高。目前應(yīng)用的多種藥物總體療效評價均不理想[2]。因此,積極尋找新的抗食管癌藥物,對于改善食管癌的化療效果、提高臨床療效具有重要作用。
青藤堿為青風(fēng)藤及毛青藤的干燥藤莖中提取的生物堿單體,分子式為C19H23NO4。青藤堿具有抗炎、抗心律失常、抗血管新生等作用,主要用于治療心律失常和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病[3]。最近研究表明青藤堿具有抗腫瘤作用,可以抑制多種腫瘤生長,如乳腺癌、肝癌、肺癌等[4-6],但青藤堿對食管癌的作用尚未明確,相關(guān)報道甚少。故本研究擬探討青藤堿對人食管癌TE-1細(xì)胞增殖的影響,以期為青藤堿在臨床上應(yīng)用于抗食管癌治療提供依據(jù)。
1.1 儀器與試劑 CKX53型光學(xué)顯微鏡、Ti2型熒光顯微鏡(日本Nikon公司);Forma Steri-Cycle型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國賽默飛公司);EPOCH酶標(biāo)儀(美國BioTek公司);CytoFLEX型流式細(xì)胞儀(德國Beckman公司);1658033型聚丙烯酰胺垂直電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。
青藤堿(北京索萊寶科技有限公司,批號:SS8560);RPMI 1640(Thermo Fisher Scientific公司,批號:22400071);Hochest染色試劑(批號:CA1120)、DAPI染色試劑(批號:C0065)、ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(批號:CA1020)均購自北京索萊寶科技有限公司);LC3-Ⅰ抗體(批號:4599)、LC3-Ⅱ抗體(批號:2775)、Beclin-1抗體(批號:3738)、β-actin抗體(批號:4970)均購自美國CST公司;ERK1/2抗體(批號:ab201015)、p-ERK1/2抗體(批號:ab184699)、mTOR抗體(批號:ab109268)、p-mTOR抗體(批號:ab32028)均購自英國Abcam公司;HRP-labeled羊抗兔IgG(批號:A0201)、Cy3-labeled羊抗兔IgG(批號:A0516)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。
1.2 細(xì)胞 人食管癌TE-1細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫,批號:TCHu 89)。
1.3 方法
1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人食管癌TE-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,每隔48 h消化傳代后開展實(shí)驗(yàn)。
1.3.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)及分組 將處于對數(shù)生長期的食管癌TE-1細(xì)胞分為對照組、青藤堿50 mg/L組、青藤堿80 mg/L組、青藤堿100 mg/L組、青藤堿200 mg/L組、青藤堿300 mg/L組、青藤堿400 mg/L組、青藤堿800 mg/L組、青藤堿1 200 mg/L組,根據(jù)分組予以相應(yīng)濃度青藤堿作用24 h后,采用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞密度,發(fā)現(xiàn)青藤堿80 mg/L組和青藤堿100 mg/L組細(xì)胞密度與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),青藤堿1 200 mg/L組細(xì)胞密度明顯低于對照組(P<0.05),因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)將青藤堿濃度設(shè)置為200、400、800 mg/L。將TE-1細(xì)胞分成對照組、青藤堿200 mg/L組、青藤堿400 mg/L組、青藤堿800 mg/L組。
1.3.3 Hochest染色檢測活細(xì)胞數(shù) 將濃度為1×106個/mL的對數(shù)生長期TE-1細(xì)胞接種在6孔板中,2.5 mL/孔,待細(xì)胞鋪滿至板底約80%,根據(jù)分組予以相應(yīng)藥物處理24 h,吸去培養(yǎng)液,加入Hochest染色劑充分覆蓋細(xì)胞孵育5 min,吸去染色劑,PBS洗3次,熒光顯微鏡觀察并拍照。
1.3.4 CCK8檢測細(xì)胞抑制率 將濃度為1×106個/mL的對數(shù)生長期TE-1細(xì)胞接種在96孔板中,100 μL/孔,待細(xì)胞完全貼壁后根據(jù)分組予以相應(yīng)藥物處理24、48、72h后,每孔加入10μL CCK8試劑繼續(xù)孵育1 h,用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在450 nm處的吸光度(OD值),并計算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。
1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將濃度為1×106/mL的對數(shù)生長期TE-1細(xì)胞接種在6孔板中,2.5 mL/孔,待細(xì)胞鋪滿至板底約80%,根據(jù)分組予以相應(yīng)藥物處理24 h,胰酶消化收集細(xì)胞,Annexin V-FITC/PI雙染進(jìn)行染色標(biāo)記,采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況,以右下象限為細(xì)胞凋亡率。
1.3.6 透射電鏡觀察自噬小體形成 將濃度為5×106個/mL的對數(shù)生長期TE-1細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中,5 mL/瓶,待細(xì)胞鋪滿至瓶底80%時,根據(jù)分組予以相應(yīng)藥物處理24 h,吸去培養(yǎng)液,4 ℃戊二醛固定液固定30 min,收集細(xì)胞于1.5 mL的EP管中,離心、脫水、包埋、超薄切片后,在透射電鏡下觀察自噬小體形成情況。
1.3.7 免疫熒光檢測LC3表達(dá) 在6孔板內(nèi)放入無菌蓋玻片,將對數(shù)生長期的TE-1細(xì)胞接種于蓋玻片上,根據(jù)分組予以相應(yīng)藥物處理24 h后,PBS洗3遍,多聚甲醛固定20 min,TritonX-100進(jìn)行細(xì)胞通透,封閉20 min,加入一抗4 ℃過夜,再加入二抗室溫孵育2 h,PBS洗3遍,加入DAPI染色5 min,封片,在熒光顯微鏡下觀察拍照。
1.3.8 Western blotting檢測LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、ERK1/2、p-ERK1/2、mTOR、p-mTOR蛋白相對表達(dá)量 根據(jù)分組予以相應(yīng)藥物處理24 h,用含有PMSF的細(xì)胞裂解液提取處理后的各組細(xì)胞中的總蛋白,BCA法測蛋白的濃度,對各組溶液進(jìn)行定量處理,之后放在100 ℃金屬浴加熱10 min。配制5%的濃縮膠和12%的分離膠,將提取的蛋白加入SDS-PAGE膠樣孔內(nèi),先設(shè)置80 V的電壓待樣品跑出一定量后轉(zhuǎn)為120 V電泳;隨后用半干轉(zhuǎn)印儀以恒流1.5 A的條件轉(zhuǎn)膜30 min,將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,再使用5%脫脂奶粉進(jìn)行常溫封閉2 h,封閉結(jié)束后使用TBST洗膜分3次加入相應(yīng)一抗進(jìn)行孵育,孵育條件為4 ℃冰箱過夜,次日繼續(xù)洗膜3次,加入相應(yīng)二抗,在常溫孵育2 h后洗膜3次;吸取適量的超敏發(fā)光液滴加到PVDF膜蛋白條帶上,利用凝膠成像系統(tǒng)曝光,以β-actin為內(nèi)參,用Quantity one軟件進(jìn)行灰度值分析。
1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料以(±s)表示,經(jīng)檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布且方差齊性,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 青藤堿對TE-1細(xì)胞增殖的影響
2.1.1 各組細(xì)胞形態(tài)比較 與對照組比較,經(jīng)200、400、800 mg/L青藤堿作用24 h后,細(xì)胞皺縮、變圓,貼壁細(xì)胞不斷減少,漂浮細(xì)胞不斷增多,表明青藤堿抑制細(xì)胞增殖。(見圖1)
圖1 青藤堿對TE-1 細(xì)胞增殖的影響 (×40,×400 截?。?/p>
2.1.2 各組TE-1活細(xì)胞數(shù)比較 青藤堿200、400、800 mg/L組活細(xì)胞數(shù)比例顯著低于對照組(P<0.01),表明青藤堿能抑制TE-1細(xì)胞增殖。(見圖2~3)
圖2 Hochest 染色 (×100)
圖3 各組TE-1 活細(xì)胞數(shù)比較 (±s,n=3)
2.1.3 各組TE-1細(xì)胞抑制率比較 青藤堿200、400、800 mg/L組TE-1細(xì)胞抑制率顯著高于對照組(P<0.01),表明青藤堿能抑制TE-1細(xì)胞增殖。(見圖4)
圖4 各組TE-1 細(xì)胞抑制率比較 (±s,n=3)
2.2 青藤堿對TE-1細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡的影響
2.2.1 各組TE-1細(xì)胞凋亡率比較 青藤堿200、400、800 mg/L組TE-1細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.01),表明青藤堿能促進(jìn)TE-1細(xì)胞凋亡。(見圖5~6)
圖5 各組細(xì)胞凋亡流式圖
圖6 各組TE-1 細(xì)胞凋亡率比較 (±s,n=3)
2.2.2 各組TE-1細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量比較 青藤堿200、400、800 mg/L組TE-1細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量明顯多于對照組,表明青藤堿能誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞自噬。(見圖7)
圖7 各組自噬小體形成情況
2.2.3 各組TE-1細(xì)胞LC3表達(dá)比較 青藤堿200、400、800 mg/L組TE-1細(xì)胞LC3表達(dá)顯著高于對照組(P<0.01),表明青藤堿能誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞表達(dá)LC3。(見圖8~9)
圖8 各組TE-1 細(xì)胞LC3 表達(dá) (免疫熒光檢測,×400)
圖9 各組TE-1 細(xì)胞LC3 表達(dá)比較 (±s,n=3)
2.2.4 各組TE-1細(xì)胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相對表達(dá)量比較 青藤堿200、400、800 mg/L組TE-1細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1蛋白相對表達(dá)量均顯著高于對照組(P<0.01),表明青藤堿誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)。(見圖10~11)
圖10 各組TE-1 細(xì)胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白表達(dá)Western blotting 圖
圖11 各組TE-1 細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1 蛋白相對表達(dá)量比較 (±s,n=3)
2.3 各組TE-1細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2、mTOR、p-mTOR蛋白相對表達(dá)量比較 青藤堿200、400、800 mg/L組TE-1細(xì)胞p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR比值顯著低于對照組(P<0.01),表明青藤堿能抑制TE-1細(xì)胞MAPK/ERK/mTOR通路激活。(見圖12~13)
圖12 各組TE-1 細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)Western blotting 圖
圖13 各組TE-1 細(xì)胞p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR比值比較 (±s,n=3)
食管癌是我國常見惡性腫瘤之一,化療是針對中晚期食管癌的重要治療手段,但腫瘤耐藥嚴(yán)重影響了食管癌化療療效和患者預(yù)后[7]。因此急需尋找新的抗食管癌藥物提高臨床療效。青藤堿是從青風(fēng)藤及毛青藤的干燥藤莖中提取的一種生物堿,臨床多用于抗風(fēng)濕治療[8]。近年研究發(fā)現(xiàn),青藤堿可以抑制多種腫瘤細(xì)胞生長[9],具有較好的抗腫瘤作用。但青藤堿是否具有抗食管癌作用尚未明確。
本研究發(fā)現(xiàn),青藤堿可以抑制TE-1細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞凋亡。此外,青藤堿可以誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞自噬,并抑制MAPK/ERK/mTOR通路激活。因此,青藤堿可以抑制TE-1細(xì)胞增殖,其機(jī)制與抑制MAPK/ERK/mTOR通路激活和誘導(dǎo)自噬有關(guān)。
青藤堿的抗腫瘤作用已在多種癌癥中被證實(shí)。XU H等[10]研究表明,青藤堿可以通過下調(diào)LncRNA-HEIH表達(dá)來抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖。QU X等[11]研究發(fā)現(xiàn),青藤堿可以下調(diào)CDK1的表達(dá)來抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。BAI S等[12]研究表明,青藤堿可以負(fù)調(diào)節(jié)α7煙堿乙酰膽堿受體,抑制肺癌細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn),青藤堿可以抑制食管癌TE-1細(xì)胞增殖,與上述研究一致。
細(xì)胞凋亡是各種因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過程,其特征為線粒體膜電位喪失、細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中及Caspase-9激活[13]。研究表明,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有助于抗腫瘤治療[14]。青藤堿可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡,如XU F等[15]研究表明青藤堿可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡;ZHENG X等[16]研究表明青藤堿可以誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡;前期研究[17]發(fā)現(xiàn)青藤堿可以誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),隨著青藤堿的濃度不斷升高,細(xì)胞凋亡率逐漸上升,表明青藤堿可以誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡。
自噬是在相關(guān)基因的調(diào)控下,自噬細(xì)胞溶酶體依賴性地降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及大分子物質(zhì)的過程。適度自噬有利于腫瘤細(xì)胞生存,而過度自噬會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)自噬性死亡[18]。研究發(fā)現(xiàn)多種中藥成分可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬性死亡起到抗腫瘤效果[19]。青藤堿可以誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[16]、黑色素瘤[20]、腎癌[21]等腫瘤自噬而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn),在青藤堿的作用下,食管癌TE-1細(xì)胞自噬水平及細(xì)胞凋亡率上升,表明青藤堿可能通過誘導(dǎo)自噬促進(jìn)TE-1細(xì)胞產(chǎn)生自噬性死亡,從而抑制其增殖。
絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi),該信號通路可將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi),并引起細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等一系列生物學(xué)反應(yīng)[22]。MAPK/ERK/mTOR信號通路是MAPK信號通路中的主要信號通路,可激活mTOR,從而抑制自噬[23]。研究發(fā)現(xiàn)MAPK/ERK/mTOR通路在多種腫瘤中被異常激活,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)[24]。本研究發(fā)現(xiàn),青藤堿可以降低p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR比值,并促進(jìn)自噬水平上升,表明青藤堿可能通過抑制MAPK/ERK/mTOR通路激活,從而誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞自噬。
綜上所述,青藤堿能抑制食管癌TE-1細(xì)胞增殖,其機(jī)制可能與抑制MAPK/ERK/mTOR通路激活誘導(dǎo)自噬有關(guān)。本研究為青藤堿應(yīng)用于抗食管癌治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時也為探討青藤堿的抗食管癌作用機(jī)制提供了一種新的思路。青藤堿作為一種中藥材提取的生物堿,具有來源廣泛、價格低廉、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn),因此其臨床應(yīng)用前景非常廣闊[25]。然而,本研究也存在不足,如:本研究只進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn),未進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究,同時并未使用MAPK/ERK/mTOR通路激活劑對其進(jìn)一步驗(yàn)證等。故后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步完善研究內(nèi)容。