青藤堿通過MAPK/ERK/mTOR通路誘導(dǎo)自噬抑制人食管癌TE-1細(xì)胞增殖*

陳 耀，肖文濤，葉玉海，陳偉毅（湖南醫(yī)藥學(xué)院，湖南 懷化 418000）

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，全世界每年約有30萬人死于食管癌。我國(guó)是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一，每年平均病死約15萬人[1]。化療是治療食管癌的主要方法之一，然而食管癌對(duì)化療并不敏感，且耐藥性很高。目前應(yīng)用的多種藥物總體療效評(píng)價(jià)均不理想[2]。因此，積極尋找新的抗食管癌藥物，對(duì)于改善食管癌的化療效果、提高臨床療效具有重要作用。

青藤堿為青風(fēng)藤及毛青藤的干燥藤莖中提取的生物堿單體，分子式為C19H23NO4。青藤堿具有抗炎、抗心律失常、抗血管新生等作用，主要用于治療心律失常和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病[3]。最近研究表明青藤堿具有抗腫瘤作用，可以抑制多種腫瘤生長(zhǎng)，如乳腺癌、肝癌、肺癌等[4-6]，但青藤堿對(duì)食管癌的作用尚未明確，相關(guān)報(bào)道甚少。故本研究擬探討青藤堿對(duì)人食管癌TE-1細(xì)胞增殖的影響，以期為青藤堿在臨床上應(yīng)用于抗食管癌治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 CKX53型光學(xué)顯微鏡、Ti2型熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；Forma Steri-Cycle型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)賽默飛公司）；EPOCH酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；CytoFLEX型流式細(xì)胞儀（德國(guó)Beckman公司）；1658033型聚丙烯酰胺垂直電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

青藤堿（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：SS8560）；RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：22400071）；Hochest染色試劑（批號(hào)：CA1120）、DAPI染色試劑（批號(hào)：C0065）、ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：CA1020）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司）；LC3-Ⅰ抗體（批號(hào)：4599）、LC3-Ⅱ抗體（批號(hào)：2775）、Beclin-1抗體（批號(hào)：3738）、β-actin抗體（批號(hào)：4970）均購(gòu)自美國(guó)CST公司；ERK1/2抗體（批號(hào)：ab201015）、p-ERK1/2抗體（批號(hào)：ab184699）、mTOR抗體（批號(hào)：ab109268）、p-mTOR抗體（批號(hào)：ab32028）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；HRP-labeled羊抗兔IgG（批號(hào)：A0201）、Cy3-labeled羊抗兔IgG（批號(hào)：A0516）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞 人食管癌TE-1細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，批號(hào)：TCHu 89）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人食管癌TE-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每隔48 h消化傳代后開展實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)及分組 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的食管癌TE-1細(xì)胞分為對(duì)照組、青藤堿50 mg/L組、青藤堿80 mg/L組、青藤堿100 mg/L組、青藤堿200 mg/L組、青藤堿300 mg/L組、青藤堿400 mg/L組、青藤堿800 mg/L組、青藤堿1 200 mg/L組，根據(jù)分組予以相應(yīng)濃度青藤堿作用24 h后，采用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞密度，發(fā)現(xiàn)青藤堿80 mg/L組和青藤堿100 mg/L組細(xì)胞密度與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），青藤堿1 200 mg/L組細(xì)胞密度明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)將青藤堿濃度設(shè)置為200、400、800 mg/L。將TE-1細(xì)胞分成對(duì)照組、青藤堿200 mg/L組、青藤堿400 mg/L組、青藤堿800 mg/L組。

1.3.3 Hochest染色檢測(cè)活細(xì)胞數(shù) 將濃度為1×106個(gè)/mL的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期TE-1細(xì)胞接種在6孔板中，2.5 mL/孔，待細(xì)胞鋪滿至板底約80%，根據(jù)分組予以相應(yīng)藥物處理24 h，吸去培養(yǎng)液，加入Hochest染色劑充分覆蓋細(xì)胞孵育5 min，吸去染色劑，PBS洗3次，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3.4 CCK8檢測(cè)細(xì)胞抑制率 將濃度為1×106個(gè)/mL的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期TE-1細(xì)胞接種在96孔板中，100 μL/孔，待細(xì)胞完全貼壁后根據(jù)分組予以相應(yīng)藥物處理24、48、72h后，每孔加入10μL CCK8試劑繼續(xù)孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在450 nm處的吸光度（OD值），并計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）]×100%。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將濃度為1×106/mL的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期TE-1細(xì)胞接種在6孔板中，2.5 mL/孔，待細(xì)胞鋪滿至板底約80%，根據(jù)分組予以相應(yīng)藥物處理24 h，胰酶消化收集細(xì)胞，Annexin V-FITC/PI雙染進(jìn)行染色標(biāo)記，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，以右下象限為細(xì)胞凋亡率。

1.3.6 透射電鏡觀察自噬小體形成 將濃度為5×106個(gè)/mL的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期TE-1細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中，5 mL/瓶，待細(xì)胞鋪滿至瓶底80%時(shí)，根據(jù)分組予以相應(yīng)藥物處理24 h，吸去培養(yǎng)液，4 ℃戊二醛固定液固定30 min，收集細(xì)胞于1.5 mL的EP管中，離心、脫水、包埋、超薄切片后，在透射電鏡下觀察自噬小體形成情況。

1.3.7 免疫熒光檢測(cè)LC3表達(dá) 在6孔板內(nèi)放入無菌蓋玻片，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TE-1細(xì)胞接種于蓋玻片上，根據(jù)分組予以相應(yīng)藥物處理24 h后，PBS洗3遍，多聚甲醛固定20 min，TritonX-100進(jìn)行細(xì)胞通透，封閉20 min，加入一抗4 ℃過夜，再加入二抗室溫孵育2 h，PBS洗3遍，加入DAPI染色5 min，封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.8 Western blotting檢測(cè)LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、ERK1/2、p-ERK1/2、mTOR、p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量 根據(jù)分組予以相應(yīng)藥物處理24 h，用含有PMSF的細(xì)胞裂解液提取處理后的各組細(xì)胞中的總蛋白，BCA法測(cè)蛋白的濃度，對(duì)各組溶液進(jìn)行定量處理，之后放在100 ℃金屬浴加熱10 min。配制5%的濃縮膠和12%的分離膠，將提取的蛋白加入SDS-PAGE膠樣孔內(nèi)，先設(shè)置80 V的電壓待樣品跑出一定量后轉(zhuǎn)為120 V電泳；隨后用半干轉(zhuǎn)印儀以恒流1.5 A的條件轉(zhuǎn)膜30 min，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，再使用5%脫脂奶粉進(jìn)行常溫封閉2 h，封閉結(jié)束后使用TBST洗膜分3次加入相應(yīng)一抗進(jìn)行孵育，孵育條件為4 ℃冰箱過夜，次日繼續(xù)洗膜3次，加入相應(yīng)二抗，在常溫孵育2 h后洗膜3次；吸取適量的超敏發(fā)光液滴加到PVDF膜蛋白條帶上，利用凝膠成像系統(tǒng)曝光，以β-actin為內(nèi)參，用Quantity one軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，經(jīng)檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布且方差齊性，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青藤堿對(duì)TE-1細(xì)胞增殖的影響

2.1.1 各組細(xì)胞形態(tài)比較 與對(duì)照組比較，經(jīng)200、400、800 mg/L青藤堿作用24 h后，細(xì)胞皺縮、變圓，貼壁細(xì)胞不斷減少，漂浮細(xì)胞不斷增多，表明青藤堿抑制細(xì)胞增殖。（見圖1）

圖1 青藤堿對(duì)TE-1 細(xì)胞增殖的影響 （×40，×400 截?。?/p>

2.1.2 各組TE-1活細(xì)胞數(shù)比較 青藤堿200、400、800 mg/L組活細(xì)胞數(shù)比例顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），表明青藤堿能抑制TE-1細(xì)胞增殖。（見圖2～3）

圖2 Hochest 染色 （×100）

圖3 各組TE-1 活細(xì)胞數(shù)比較 （±s，n=3）

2.1.3 各組TE-1細(xì)胞抑制率比較 青藤堿200、400、800 mg/L組TE-1細(xì)胞抑制率顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），表明青藤堿能抑制TE-1細(xì)胞增殖。（見圖4）

圖4 各組TE-1 細(xì)胞抑制率比較 （±s，n=3）

2.2 青藤堿對(duì)TE-1細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡的影響

2.2.1 各組TE-1細(xì)胞凋亡率比較 青藤堿200、400、800 mg/L組TE-1細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），表明青藤堿能促進(jìn)TE-1細(xì)胞凋亡。（見圖5～6）

圖5 各組細(xì)胞凋亡流式圖

圖6 各組TE-1 細(xì)胞凋亡率比較 （±s，n=3）

2.2.2 各組TE-1細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量比較 青藤堿200、400、800 mg/L組TE-1細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量明顯多于對(duì)照組，表明青藤堿能誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞自噬。（見圖7）

圖7 各組自噬小體形成情況

2.2.3 各組TE-1細(xì)胞LC3表達(dá)比較 青藤堿200、400、800 mg/L組TE-1細(xì)胞LC3表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），表明青藤堿能誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞表達(dá)LC3。（見圖8～9）

圖8 各組TE-1 細(xì)胞LC3 表達(dá) （免疫熒光檢測(cè)，×400）

圖9 各組TE-1 細(xì)胞LC3 表達(dá)比較 （±s，n=3）

2.2.4 各組TE-1細(xì)胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 青藤堿200、400、800 mg/L組TE-1細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），表明青藤堿誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)。（見圖10～11）

圖10 各組TE-1 細(xì)胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

圖11 各組TE-1 細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s，n=3）

2.3 各組TE-1細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2、mTOR、p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 青藤堿200、400、800 mg/L組TE-1細(xì)胞p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR比值顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），表明青藤堿能抑制TE-1細(xì)胞MAPK/ERK/mTOR通路激活。（見圖12～13）

圖12 各組TE-1 細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)Western blotting 圖

圖13 各組TE-1 細(xì)胞p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR比值比較 （±s，n=3）

3 討論

食管癌是我國(guó)常見惡性腫瘤之一，化療是針對(duì)中晚期食管癌的重要治療手段，但腫瘤耐藥嚴(yán)重影響了食管癌化療療效和患者預(yù)后[7]。因此急需尋找新的抗食管癌藥物提高臨床療效。青藤堿是從青風(fēng)藤及毛青藤的干燥藤莖中提取的一種生物堿，臨床多用于抗風(fēng)濕治療[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可以抑制多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[9]，具有較好的抗腫瘤作用。但青藤堿是否具有抗食管癌作用尚未明確。

本研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可以抑制TE-1細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞凋亡。此外，青藤堿可以誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞自噬，并抑制MAPK/ERK/mTOR通路激活。因此，青藤堿可以抑制TE-1細(xì)胞增殖，其機(jī)制與抑制MAPK/ERK/mTOR通路激活和誘導(dǎo)自噬有關(guān)。

青藤堿的抗腫瘤作用已在多種癌癥中被證實(shí)。XU H等[10]研究表明，青藤堿可以通過下調(diào)LncRNA-HEIH表達(dá)來抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖。QU X等[11]研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可以下調(diào)CDK1的表達(dá)來抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。BAI S等[12]研究表明，青藤堿可以負(fù)調(diào)節(jié)α7煙堿乙酰膽堿受體，抑制肺癌細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可以抑制食管癌TE-1細(xì)胞增殖，與上述研究一致。

細(xì)胞凋亡是各種因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過程，其特征為線粒體膜電位喪失、細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中及Caspase-9激活[13]。研究表明，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有助于抗腫瘤治療[14]。青藤堿可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，如XU F等[15]研究表明青藤堿可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡；ZHENG X等[16]研究表明青藤堿可以誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡；前期研究[17]發(fā)現(xiàn)青藤堿可以誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著青藤堿的濃度不斷升高，細(xì)胞凋亡率逐漸上升，表明青藤堿可以誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡。

自噬是在相關(guān)基因的調(diào)控下，自噬細(xì)胞溶酶體依賴性地降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及大分子物質(zhì)的過程。適度自噬有利于腫瘤細(xì)胞生存，而過度自噬會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)自噬性死亡[18]。研究發(fā)現(xiàn)多種中藥成分可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬性死亡起到抗腫瘤效果[19]。青藤堿可以誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[16]、黑色素瘤[20]、腎癌[21]等腫瘤自噬而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在青藤堿的作用下，食管癌TE-1細(xì)胞自噬水平及細(xì)胞凋亡率上升，表明青藤堿可能通過誘導(dǎo)自噬促進(jìn)TE-1細(xì)胞產(chǎn)生自噬性死亡，從而抑制其增殖。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，該信號(hào)通路可將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等一系列生物學(xué)反應(yīng)[22]。MAPK/ERK/mTOR信號(hào)通路是MAPK信號(hào)通路中的主要信號(hào)通路，可激活mTOR，從而抑制自噬[23]。研究發(fā)現(xiàn)MAPK/ERK/mTOR通路在多種腫瘤中被異常激活，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可以降低p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR比值，并促進(jìn)自噬水平上升，表明青藤堿可能通過抑制MAPK/ERK/mTOR通路激活，從而誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞自噬。

綜上所述，青藤堿能抑制食管癌TE-1細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與抑制MAPK/ERK/mTOR通路激活誘導(dǎo)自噬有關(guān)。本研究為青藤堿應(yīng)用于抗食管癌治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)也為探討青藤堿的抗食管癌作用機(jī)制提供了一種新的思路。青藤堿作為一種中藥材提取的生物堿，具有來源廣泛、價(jià)格低廉、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，因此其臨床應(yīng)用前景非常廣闊[25]。然而，本研究也存在不足，如：本研究只進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究，同時(shí)并未使用MAPK/ERK/mTOR通路激活劑對(duì)其進(jìn)一步驗(yàn)證等。故后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步完善研究?jī)?nèi)容。