• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    青藤堿通過MAPK/ERK/mTOR通路誘導(dǎo)自噬抑制人食管癌TE-1細(xì)胞增殖*

    2023-07-12 03:29:34肖文濤葉玉海陳偉毅湖南醫(yī)藥學(xué)院湖南懷化418000
    中醫(yī)藥導(dǎo)報 2023年6期
    關(guān)鍵詞:研究

    陳 耀,肖文濤,葉玉海,陳偉毅(湖南醫(yī)藥學(xué)院,湖南 懷化 418000)

    食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一,全世界每年約有30萬人死于食管癌。我國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一,每年平均病死約15萬人[1]。化療是治療食管癌的主要方法之一,然而食管癌對化療并不敏感,且耐藥性很高。目前應(yīng)用的多種藥物總體療效評價均不理想[2]。因此,積極尋找新的抗食管癌藥物,對于改善食管癌的化療效果、提高臨床療效具有重要作用。

    青藤堿為青風(fēng)藤及毛青藤的干燥藤莖中提取的生物堿單體,分子式為C19H23NO4。青藤堿具有抗炎、抗心律失常、抗血管新生等作用,主要用于治療心律失常和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病[3]。最近研究表明青藤堿具有抗腫瘤作用,可以抑制多種腫瘤生長,如乳腺癌、肝癌、肺癌等[4-6],但青藤堿對食管癌的作用尚未明確,相關(guān)報道甚少。故本研究擬探討青藤堿對人食管癌TE-1細(xì)胞增殖的影響,以期為青藤堿在臨床上應(yīng)用于抗食管癌治療提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑 CKX53型光學(xué)顯微鏡、Ti2型熒光顯微鏡(日本Nikon公司);Forma Steri-Cycle型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國賽默飛公司);EPOCH酶標(biāo)儀(美國BioTek公司);CytoFLEX型流式細(xì)胞儀(德國Beckman公司);1658033型聚丙烯酰胺垂直電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

    青藤堿(北京索萊寶科技有限公司,批號:SS8560);RPMI 1640(Thermo Fisher Scientific公司,批號:22400071);Hochest染色試劑(批號:CA1120)、DAPI染色試劑(批號:C0065)、ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(批號:CA1020)均購自北京索萊寶科技有限公司);LC3-Ⅰ抗體(批號:4599)、LC3-Ⅱ抗體(批號:2775)、Beclin-1抗體(批號:3738)、β-actin抗體(批號:4970)均購自美國CST公司;ERK1/2抗體(批號:ab201015)、p-ERK1/2抗體(批號:ab184699)、mTOR抗體(批號:ab109268)、p-mTOR抗體(批號:ab32028)均購自英國Abcam公司;HRP-labeled羊抗兔IgG(批號:A0201)、Cy3-labeled羊抗兔IgG(批號:A0516)均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

    1.2 細(xì)胞 人食管癌TE-1細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫,批號:TCHu 89)。

    1.3 方法

    1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人食管癌TE-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中,每隔48 h消化傳代后開展實(shí)驗(yàn)。

    1.3.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)及分組 將處于對數(shù)生長期的食管癌TE-1細(xì)胞分為對照組、青藤堿50 mg/L組、青藤堿80 mg/L組、青藤堿100 mg/L組、青藤堿200 mg/L組、青藤堿300 mg/L組、青藤堿400 mg/L組、青藤堿800 mg/L組、青藤堿1 200 mg/L組,根據(jù)分組予以相應(yīng)濃度青藤堿作用24 h后,采用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞密度,發(fā)現(xiàn)青藤堿80 mg/L組和青藤堿100 mg/L組細(xì)胞密度與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),青藤堿1 200 mg/L組細(xì)胞密度明顯低于對照組(P<0.05),因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)將青藤堿濃度設(shè)置為200、400、800 mg/L。將TE-1細(xì)胞分成對照組、青藤堿200 mg/L組、青藤堿400 mg/L組、青藤堿800 mg/L組。

    1.3.3 Hochest染色檢測活細(xì)胞數(shù) 將濃度為1×106個/mL的對數(shù)生長期TE-1細(xì)胞接種在6孔板中,2.5 mL/孔,待細(xì)胞鋪滿至板底約80%,根據(jù)分組予以相應(yīng)藥物處理24 h,吸去培養(yǎng)液,加入Hochest染色劑充分覆蓋細(xì)胞孵育5 min,吸去染色劑,PBS洗3次,熒光顯微鏡觀察并拍照。

    1.3.4 CCK8檢測細(xì)胞抑制率 將濃度為1×106個/mL的對數(shù)生長期TE-1細(xì)胞接種在96孔板中,100 μL/孔,待細(xì)胞完全貼壁后根據(jù)分組予以相應(yīng)藥物處理24、48、72h后,每孔加入10μL CCK8試劑繼續(xù)孵育1 h,用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在450 nm處的吸光度(OD值),并計算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%。

    1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將濃度為1×106/mL的對數(shù)生長期TE-1細(xì)胞接種在6孔板中,2.5 mL/孔,待細(xì)胞鋪滿至板底約80%,根據(jù)分組予以相應(yīng)藥物處理24 h,胰酶消化收集細(xì)胞,Annexin V-FITC/PI雙染進(jìn)行染色標(biāo)記,采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況,以右下象限為細(xì)胞凋亡率。

    1.3.6 透射電鏡觀察自噬小體形成 將濃度為5×106個/mL的對數(shù)生長期TE-1細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中,5 mL/瓶,待細(xì)胞鋪滿至瓶底80%時,根據(jù)分組予以相應(yīng)藥物處理24 h,吸去培養(yǎng)液,4 ℃戊二醛固定液固定30 min,收集細(xì)胞于1.5 mL的EP管中,離心、脫水、包埋、超薄切片后,在透射電鏡下觀察自噬小體形成情況。

    1.3.7 免疫熒光檢測LC3表達(dá) 在6孔板內(nèi)放入無菌蓋玻片,將對數(shù)生長期的TE-1細(xì)胞接種于蓋玻片上,根據(jù)分組予以相應(yīng)藥物處理24 h后,PBS洗3遍,多聚甲醛固定20 min,TritonX-100進(jìn)行細(xì)胞通透,封閉20 min,加入一抗4 ℃過夜,再加入二抗室溫孵育2 h,PBS洗3遍,加入DAPI染色5 min,封片,在熒光顯微鏡下觀察拍照。

    1.3.8 Western blotting檢測LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、ERK1/2、p-ERK1/2、mTOR、p-mTOR蛋白相對表達(dá)量 根據(jù)分組予以相應(yīng)藥物處理24 h,用含有PMSF的細(xì)胞裂解液提取處理后的各組細(xì)胞中的總蛋白,BCA法測蛋白的濃度,對各組溶液進(jìn)行定量處理,之后放在100 ℃金屬浴加熱10 min。配制5%的濃縮膠和12%的分離膠,將提取的蛋白加入SDS-PAGE膠樣孔內(nèi),先設(shè)置80 V的電壓待樣品跑出一定量后轉(zhuǎn)為120 V電泳;隨后用半干轉(zhuǎn)印儀以恒流1.5 A的條件轉(zhuǎn)膜30 min,將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,再使用5%脫脂奶粉進(jìn)行常溫封閉2 h,封閉結(jié)束后使用TBST洗膜分3次加入相應(yīng)一抗進(jìn)行孵育,孵育條件為4 ℃冰箱過夜,次日繼續(xù)洗膜3次,加入相應(yīng)二抗,在常溫孵育2 h后洗膜3次;吸取適量的超敏發(fā)光液滴加到PVDF膜蛋白條帶上,利用凝膠成像系統(tǒng)曝光,以β-actin為內(nèi)參,用Quantity one軟件進(jìn)行灰度值分析。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料以(±s)表示,經(jīng)檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布且方差齊性,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 青藤堿對TE-1細(xì)胞增殖的影響

    2.1.1 各組細(xì)胞形態(tài)比較 與對照組比較,經(jīng)200、400、800 mg/L青藤堿作用24 h后,細(xì)胞皺縮、變圓,貼壁細(xì)胞不斷減少,漂浮細(xì)胞不斷增多,表明青藤堿抑制細(xì)胞增殖。(見圖1)

    圖1 青藤堿對TE-1 細(xì)胞增殖的影響 (×40,×400 截?。?/p>

    2.1.2 各組TE-1活細(xì)胞數(shù)比較 青藤堿200、400、800 mg/L組活細(xì)胞數(shù)比例顯著低于對照組(P<0.01),表明青藤堿能抑制TE-1細(xì)胞增殖。(見圖2~3)

    圖2 Hochest 染色 (×100)

    圖3 各組TE-1 活細(xì)胞數(shù)比較 (±s,n=3)

    2.1.3 各組TE-1細(xì)胞抑制率比較 青藤堿200、400、800 mg/L組TE-1細(xì)胞抑制率顯著高于對照組(P<0.01),表明青藤堿能抑制TE-1細(xì)胞增殖。(見圖4)

    圖4 各組TE-1 細(xì)胞抑制率比較 (±s,n=3)

    2.2 青藤堿對TE-1細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡的影響

    2.2.1 各組TE-1細(xì)胞凋亡率比較 青藤堿200、400、800 mg/L組TE-1細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.01),表明青藤堿能促進(jìn)TE-1細(xì)胞凋亡。(見圖5~6)

    圖5 各組細(xì)胞凋亡流式圖

    圖6 各組TE-1 細(xì)胞凋亡率比較 (±s,n=3)

    2.2.2 各組TE-1細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量比較 青藤堿200、400、800 mg/L組TE-1細(xì)胞內(nèi)自噬小體數(shù)量明顯多于對照組,表明青藤堿能誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞自噬。(見圖7)

    圖7 各組自噬小體形成情況

    2.2.3 各組TE-1細(xì)胞LC3表達(dá)比較 青藤堿200、400、800 mg/L組TE-1細(xì)胞LC3表達(dá)顯著高于對照組(P<0.01),表明青藤堿能誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞表達(dá)LC3。(見圖8~9)

    圖8 各組TE-1 細(xì)胞LC3 表達(dá) (免疫熒光檢測,×400)

    圖9 各組TE-1 細(xì)胞LC3 表達(dá)比較 (±s,n=3)

    2.2.4 各組TE-1細(xì)胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相對表達(dá)量比較 青藤堿200、400、800 mg/L組TE-1細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1蛋白相對表達(dá)量均顯著高于對照組(P<0.01),表明青藤堿誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞自噬蛋白表達(dá)。(見圖10~11)

    圖10 各組TE-1 細(xì)胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

    圖11 各組TE-1 細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1 蛋白相對表達(dá)量比較 (±s,n=3)

    2.3 各組TE-1細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2、mTOR、p-mTOR蛋白相對表達(dá)量比較 青藤堿200、400、800 mg/L組TE-1細(xì)胞p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR比值顯著低于對照組(P<0.01),表明青藤堿能抑制TE-1細(xì)胞MAPK/ERK/mTOR通路激活。(見圖12~13)

    圖12 各組TE-1 細(xì)胞ERK1/2、p-ERK1/2、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)Western blotting 圖

    圖13 各組TE-1 細(xì)胞p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR比值比較 (±s,n=3)

    3 討論

    食管癌是我國常見惡性腫瘤之一,化療是針對中晚期食管癌的重要治療手段,但腫瘤耐藥嚴(yán)重影響了食管癌化療療效和患者預(yù)后[7]。因此急需尋找新的抗食管癌藥物提高臨床療效。青藤堿是從青風(fēng)藤及毛青藤的干燥藤莖中提取的一種生物堿,臨床多用于抗風(fēng)濕治療[8]。近年研究發(fā)現(xiàn),青藤堿可以抑制多種腫瘤細(xì)胞生長[9],具有較好的抗腫瘤作用。但青藤堿是否具有抗食管癌作用尚未明確。

    本研究發(fā)現(xiàn),青藤堿可以抑制TE-1細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞凋亡。此外,青藤堿可以誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞自噬,并抑制MAPK/ERK/mTOR通路激活。因此,青藤堿可以抑制TE-1細(xì)胞增殖,其機(jī)制與抑制MAPK/ERK/mTOR通路激活和誘導(dǎo)自噬有關(guān)。

    青藤堿的抗腫瘤作用已在多種癌癥中被證實(shí)。XU H等[10]研究表明,青藤堿可以通過下調(diào)LncRNA-HEIH表達(dá)來抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖。QU X等[11]研究發(fā)現(xiàn),青藤堿可以下調(diào)CDK1的表達(dá)來抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。BAI S等[12]研究表明,青藤堿可以負(fù)調(diào)節(jié)α7煙堿乙酰膽堿受體,抑制肺癌細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn),青藤堿可以抑制食管癌TE-1細(xì)胞增殖,與上述研究一致。

    細(xì)胞凋亡是各種因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞死亡過程,其特征為線粒體膜電位喪失、細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中及Caspase-9激活[13]。研究表明,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有助于抗腫瘤治療[14]。青藤堿可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡,如XU F等[15]研究表明青藤堿可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡;ZHENG X等[16]研究表明青藤堿可以誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡;前期研究[17]發(fā)現(xiàn)青藤堿可以誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),隨著青藤堿的濃度不斷升高,細(xì)胞凋亡率逐漸上升,表明青藤堿可以誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡。

    自噬是在相關(guān)基因的調(diào)控下,自噬細(xì)胞溶酶體依賴性地降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器及大分子物質(zhì)的過程。適度自噬有利于腫瘤細(xì)胞生存,而過度自噬會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)自噬性死亡[18]。研究發(fā)現(xiàn)多種中藥成分可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬性死亡起到抗腫瘤效果[19]。青藤堿可以誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[16]、黑色素瘤[20]、腎癌[21]等腫瘤自噬而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn),在青藤堿的作用下,食管癌TE-1細(xì)胞自噬水平及細(xì)胞凋亡率上升,表明青藤堿可能通過誘導(dǎo)自噬促進(jìn)TE-1細(xì)胞產(chǎn)生自噬性死亡,從而抑制其增殖。

    絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi),該信號通路可將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi),并引起細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等一系列生物學(xué)反應(yīng)[22]。MAPK/ERK/mTOR信號通路是MAPK信號通路中的主要信號通路,可激活mTOR,從而抑制自噬[23]。研究發(fā)現(xiàn)MAPK/ERK/mTOR通路在多種腫瘤中被異常激活,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥密切相關(guān)[24]。本研究發(fā)現(xiàn),青藤堿可以降低p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR比值,并促進(jìn)自噬水平上升,表明青藤堿可能通過抑制MAPK/ERK/mTOR通路激活,從而誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞自噬。

    綜上所述,青藤堿能抑制食管癌TE-1細(xì)胞增殖,其機(jī)制可能與抑制MAPK/ERK/mTOR通路激活誘導(dǎo)自噬有關(guān)。本研究為青藤堿應(yīng)用于抗食管癌治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),同時也為探討青藤堿的抗食管癌作用機(jī)制提供了一種新的思路。青藤堿作為一種中藥材提取的生物堿,具有來源廣泛、價格低廉、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn),因此其臨床應(yīng)用前景非常廣闊[25]。然而,本研究也存在不足,如:本研究只進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn),未進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究,同時并未使用MAPK/ERK/mTOR通路激活劑對其進(jìn)一步驗(yàn)證等。故后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步完善研究內(nèi)容。

    猜你喜歡
    研究
    FMS與YBT相關(guān)性的實(shí)證研究
    2020年國內(nèi)翻譯研究述評
    遼代千人邑研究述論
    視錯覺在平面設(shè)計中的應(yīng)用與研究
    科技傳播(2019年22期)2020-01-14 03:06:54
    關(guān)于遼朝“一國兩制”研究的回顧與思考
    EMA伺服控制系統(tǒng)研究
    基于聲、光、磁、觸摸多功能控制的研究
    電子制作(2018年11期)2018-08-04 03:26:04
    新版C-NCAP側(cè)面碰撞假人損傷研究
    關(guān)于反傾銷會計研究的思考
    焊接膜層脫落的攻關(guān)研究
    電子制作(2017年23期)2017-02-02 07:17:19
    最近2019中文字幕mv第一页| 国产精品二区激情视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 成人国语在线视频| 欧美久久黑人一区二区| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲人成网站在线观看播放| 男的添女的下面高潮视频| 桃花免费在线播放| 日韩欧美精品免费久久| 午夜福利视频在线观看免费| 精品免费久久久久久久清纯 | 哪个播放器可以免费观看大片| 男女高潮啪啪啪动态图| 欧美成人午夜精品| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲成人免费av在线播放| 国产探花极品一区二区| 国产精品偷伦视频观看了| 色综合欧美亚洲国产小说| 咕卡用的链子| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲在久久综合| 国产精品国产三级专区第一集| 夫妻午夜视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲欧美成人精品一区二区| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品欧美亚洲77777| a级毛片黄视频| 免费少妇av软件| 欧美日韩综合久久久久久| 视频区图区小说| 久久国产亚洲av麻豆专区| 美女视频免费永久观看网站| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲欧洲国产日韩| netflix在线观看网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美人与善性xxx| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产 精品1| 欧美97在线视频| 欧美xxⅹ黑人| 一级毛片电影观看| 在线观看www视频免费| 午夜免费男女啪啪视频观看| 人成视频在线观看免费观看| 国产视频首页在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| kizo精华| 国产精品偷伦视频观看了| 9色porny在线观看| 丝袜在线中文字幕| videosex国产| 亚洲成国产人片在线观看| 好男人视频免费观看在线| 国产爽快片一区二区三区| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲美女黄色视频免费看| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲三区欧美一区| 九草在线视频观看| 99热网站在线观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美日韩综合久久久久久| 99热网站在线观看| av女优亚洲男人天堂| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 欧美精品av麻豆av| 青春草国产在线视频| 尾随美女入室| 99香蕉大伊视频| 一区二区三区四区激情视频| 涩涩av久久男人的天堂| 人成视频在线观看免费观看| 久久ye,这里只有精品| 日韩一区二区三区影片| 国产在线视频一区二区| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 亚洲国产最新在线播放| 午夜影院在线不卡| 国产精品成人在线| 天美传媒精品一区二区| 97在线人人人人妻| 男女边摸边吃奶| 搡老乐熟女国产| 99热全是精品| 看十八女毛片水多多多| 精品一区二区免费观看| www日本在线高清视频| 久久狼人影院| 色精品久久人妻99蜜桃| 一区二区三区四区激情视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产精品欧美亚洲77777| 99热全是精品| 伦理电影大哥的女人| 日韩制服骚丝袜av| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产亚洲精品第一综合不卡| 美女大奶头黄色视频| 国产片内射在线| 亚洲三区欧美一区| 色网站视频免费| 各种免费的搞黄视频| 成年人午夜在线观看视频| 国产又爽黄色视频| 国产黄频视频在线观看| 9191精品国产免费久久| 国产午夜精品一二区理论片| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 大片免费播放器 马上看| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲七黄色美女视频| 午夜久久久在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 中文欧美无线码| 中文字幕av电影在线播放| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品av久久久久免费| 国产一区亚洲一区在线观看| 一区二区三区激情视频| 99国产综合亚洲精品| 中文天堂在线官网| 在线观看国产h片| 婷婷成人精品国产| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲av成人精品一二三区| 一区二区三区乱码不卡18| 涩涩av久久男人的天堂| 久久免费观看电影| 久久韩国三级中文字幕| 欧美变态另类bdsm刘玥| 电影成人av| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 最近手机中文字幕大全| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 最黄视频免费看| 精品少妇久久久久久888优播| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 深夜精品福利| 国产一区二区三区av在线| 日日爽夜夜爽网站| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 午夜福利在线免费观看网站| 成人国产av品久久久| 日韩精品有码人妻一区| 丰满乱子伦码专区| av电影中文网址| 97在线人人人人妻| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产成人91sexporn| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 下体分泌物呈黄色| 高清在线视频一区二区三区| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲精品自拍成人| 亚洲综合色网址| 精品国产国语对白av| 国产成人欧美| 亚洲欧美成人精品一区二区| av网站免费在线观看视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 色播在线永久视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 一区福利在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲少妇的诱惑av| 色网站视频免费| 国产成人免费观看mmmm| 国产一级毛片在线| 男女之事视频高清在线观看 | av国产精品久久久久影院| 丁香六月天网| 大香蕉久久成人网| 老司机亚洲免费影院| 免费在线观看完整版高清| 国产成人免费观看mmmm| 久久人人爽人人片av| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲精品一区蜜桃| 日本色播在线视频| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲精品一二三| 午夜老司机福利片| 青春草国产在线视频| 久久国产精品大桥未久av| 欧美中文综合在线视频| 国产乱人偷精品视频| a级毛片在线看网站| 美女福利国产在线| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲国产成人一精品久久久| 这个男人来自地球电影免费观看 | 日韩人妻精品一区2区三区| 黄色怎么调成土黄色| 欧美av亚洲av综合av国产av | 亚洲伊人色综图| 久久免费观看电影| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 高清视频免费观看一区二区| 美女扒开内裤让男人捅视频| 高清在线视频一区二区三区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 丰满少妇做爰视频| 高清视频免费观看一区二区| 国产精品 欧美亚洲| 18禁观看日本| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲精品美女久久av网站| 国产男女内射视频| tube8黄色片| 欧美日韩视频精品一区| 九色亚洲精品在线播放| 男女之事视频高清在线观看 | 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲人成77777在线视频| 男女国产视频网站| 亚洲第一av免费看| 久久久久精品久久久久真实原创| 久久精品久久久久久久性| 亚洲欧美精品自产自拍| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 人妻 亚洲 视频| 少妇人妻 视频| 最近的中文字幕免费完整| 波野结衣二区三区在线| 9色porny在线观看| 精品人妻在线不人妻| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美成人精品欧美一级黄| 高清黄色对白视频在线免费看| 中文字幕av电影在线播放| 午夜福利一区二区在线看| 国产一区二区在线观看av| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产av码专区亚洲av| 日韩成人av中文字幕在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 看非洲黑人一级黄片| a 毛片基地| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲,一卡二卡三卡| 热99久久久久精品小说推荐| 午夜激情久久久久久久| 丝瓜视频免费看黄片| 成人手机av| 曰老女人黄片| 色网站视频免费| 我的亚洲天堂| a级片在线免费高清观看视频| 最新在线观看一区二区三区 | 亚洲少妇的诱惑av| 少妇人妻 视频| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 日日爽夜夜爽网站| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲欧美一区二区三区久久| 人妻一区二区av| av网站在线播放免费| www.自偷自拍.com| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲av综合色区一区| 中文天堂在线官网| 成年人午夜在线观看视频| 国产男女超爽视频在线观看| 久久青草综合色| 久久久欧美国产精品| 色婷婷av一区二区三区视频| 免费黄网站久久成人精品| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 少妇人妻 视频| 日韩中文字幕欧美一区二区 | av一本久久久久| 一级爰片在线观看| 国产97色在线日韩免费| 国产在线一区二区三区精| 亚洲人成电影观看| 韩国av在线不卡| 国产成人精品无人区| 一区二区三区乱码不卡18| 黄色视频不卡| 啦啦啦在线免费观看视频4| 熟女av电影| 色综合欧美亚洲国产小说| 精品人妻一区二区三区麻豆| 午夜老司机福利片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 又大又爽又粗| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 午夜激情av网站| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 高清视频免费观看一区二区| 人人澡人人妻人| 久久久精品免费免费高清| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 午夜激情久久久久久久| 男人添女人高潮全过程视频| 2018国产大陆天天弄谢| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 欧美另类一区| 午夜福利乱码中文字幕| 多毛熟女@视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲精品第二区| 成人毛片60女人毛片免费| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品少妇黑人巨大在线播放| 观看美女的网站| 蜜桃在线观看..| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产日韩欧美亚洲二区| 日韩大片免费观看网站| 国产乱人偷精品视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 99热全是精品| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产片特级美女逼逼视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久97久久精品| 亚洲视频免费观看视频| 男女国产视频网站| 欧美黑人精品巨大| 国产亚洲最大av| 久久久精品免费免费高清| 日韩av免费高清视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 性少妇av在线| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲伊人久久精品综合| 精品亚洲成a人片在线观看| 精品一区二区免费观看| 亚洲国产精品国产精品| 99久久精品国产亚洲精品| 久久精品国产a三级三级三级| 成人国产麻豆网| 欧美成人精品欧美一级黄| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲精品国产av蜜桃| 一区在线观看完整版| 亚洲精品中文字幕在线视频| 婷婷色综合大香蕉| 999久久久国产精品视频| av福利片在线| 熟妇人妻不卡中文字幕| 免费不卡黄色视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲国产看品久久| 欧美中文综合在线视频| 1024香蕉在线观看| 天美传媒精品一区二区| 国产精品.久久久| 啦啦啦在线免费观看视频4| 黄色视频不卡| netflix在线观看网站| 黑丝袜美女国产一区| 一级毛片我不卡| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 在线 av 中文字幕| a级毛片在线看网站| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 国产成人av激情在线播放| 欧美黄色片欧美黄色片| 天堂8中文在线网| 国产在线视频一区二区| 嫩草影院入口| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 不卡av一区二区三区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 大香蕉久久成人网| 午夜精品国产一区二区电影| 国产国语露脸激情在线看| 久久精品国产a三级三级三级| 免费不卡黄色视频| 男人添女人高潮全过程视频| 国产亚洲最大av| 免费在线观看完整版高清| 午夜免费鲁丝| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 大片免费播放器 马上看| 大陆偷拍与自拍| av电影中文网址| 大话2 男鬼变身卡| 一级a爱视频在线免费观看| 国产极品天堂在线| 久久久久久人人人人人| 性少妇av在线| 青春草视频在线免费观看| 免费av中文字幕在线| 亚洲人成网站在线观看播放| 日本av手机在线免费观看| 国产欧美亚洲国产| av国产久精品久网站免费入址| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲国产精品成人久久小说| 一区二区三区精品91| 婷婷色av中文字幕| 亚洲欧洲国产日韩| 搡老岳熟女国产| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品二区激情视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 97人妻天天添夜夜摸| 视频在线观看一区二区三区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲国产av影院在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲成人国产一区在线观看 | 午夜精品国产一区二区电影| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲国产看品久久| 亚洲情色 制服丝袜| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲精品国产av成人精品| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 欧美日韩av久久| 又大又爽又粗| 国产爽快片一区二区三区| 日韩大片免费观看网站| 国产精品国产av在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 国产精品.久久久| 又黄又粗又硬又大视频| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲国产成人一精品久久久| 狂野欧美激情性xxxx| 人妻 亚洲 视频| 精品少妇久久久久久888优播| 国产精品人妻久久久影院| 另类精品久久| 在线观看免费日韩欧美大片| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产成人免费观看mmmm| 秋霞伦理黄片| 黄色怎么调成土黄色| 老司机影院毛片| 热99国产精品久久久久久7| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产一级毛片在线| 日韩大片免费观看网站| 亚洲视频免费观看视频| 毛片一级片免费看久久久久| 国产成人精品久久久久久| 国产乱来视频区| 欧美日韩福利视频一区二区| av在线老鸭窝| av天堂久久9| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲专区中文字幕在线 | 国产精品国产av在线观看| 久久97久久精品| 国产伦人伦偷精品视频| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲国产av新网站| 考比视频在线观看| 久久韩国三级中文字幕| 欧美精品一区二区大全| 国产精品久久久久久精品古装| 日日撸夜夜添| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产av国产精品国产| 香蕉丝袜av| 韩国av在线不卡| 午夜老司机福利片| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产精品成人在线| 男女午夜视频在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| 国产精品.久久久| 男人爽女人下面视频在线观看| 青草久久国产| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久久久精品国产欧美久久久 | 久久精品国产a三级三级三级| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 欧美黄色片欧美黄色片| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲精品,欧美精品| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产视频首页在线观看| 老司机影院毛片| 少妇 在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品少妇内射三级| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久精品国产a三级三级三级| svipshipincom国产片| 在线天堂中文资源库| 色婷婷久久久亚洲欧美| 观看av在线不卡| 精品一区二区三卡| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 无限看片的www在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 一边亲一边摸免费视频| 精品视频人人做人人爽| 亚洲国产欧美在线一区| 丝袜喷水一区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲成国产人片在线观看| 丝袜喷水一区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久久久久久国产电影| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 亚洲精品国产色婷婷电影| 免费在线观看完整版高清| 久久青草综合色| 老司机影院毛片| av不卡在线播放| 男女之事视频高清在线观看 | 伊人久久国产一区二区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 99精国产麻豆久久婷婷| 妹子高潮喷水视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 黄色视频不卡| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲av男天堂| 91精品三级在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲天堂av无毛| 久久婷婷青草| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 一区二区三区精品91| 亚洲欧美色中文字幕在线| 久久精品久久精品一区二区三区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| svipshipincom国产片| 黑丝袜美女国产一区| 性色av一级| 午夜激情久久久久久久| 久久精品人人爽人人爽视色| 麻豆乱淫一区二区| 大码成人一级视频| 女性生殖器流出的白浆| 麻豆乱淫一区二区| 精品久久蜜臀av无| 女人久久www免费人成看片| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日日撸夜夜添| 老汉色av国产亚洲站长工具| 黄色视频在线播放观看不卡| 免费不卡黄色视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 日本vs欧美在线观看视频| 国产精品二区激情视频| 9热在线视频观看99| 国产成人91sexporn| 亚洲久久久国产精品| 久久久久网色| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美黄色片欧美黄色片| av女优亚洲男人天堂| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 欧美人与善性xxx| 下体分泌物呈黄色| av片东京热男人的天堂| 亚洲精品美女久久av网站| 少妇 在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 女性生殖器流出的白浆| 韩国高清视频一区二区三区| 精品午夜福利在线看| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲五月色婷婷综合| 午夜av观看不卡| 欧美97在线视频| av卡一久久| 午夜av观看不卡| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲自偷自拍图片 自拍| bbb黄色大片| 高清视频免费观看一区二区| 水蜜桃什么品种好| 亚洲精品乱久久久久久|