肌球蛋白輕鏈激酶在腸梗阻發(fā)生及腸黏膜屏障損傷中的作用

王 玉,莊 波,陳曉俊,楊儀暉

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金華醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科;2.普外科,浙江 金華 321000;3.金華市第二醫(yī)院 老年科,浙江 金華 321000;4.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金華醫(yī)院 病理科,浙江 金華 321000)

腸梗阻是任何原因引起的腸內(nèi)容物通過(guò)障礙,是外科常見(jiàn)的急腹癥之一,死亡率一般為5%～10%。敗血癥是腸梗阻死亡的主要原因[1],腸道上皮黏膜屏障的破壞,緊密連接(tightjunction,TJ)的打開(kāi)是敗血癥發(fā)生的重要原因之一[2-3]。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)可以使肌球蛋白輕鏈磷酸化(myosin light chain phosphorylation,pMLC),促使肌動(dòng)蛋白收縮,從而使腸道平滑肌收縮,增加TJ和細(xì)胞表面的張力,破壞細(xì)胞間的緊密連接,開(kāi)放TJ[4-5]。國(guó)內(nèi)外許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[6-7]證實(shí),MLCK在腸道中起著至關(guān)重要的作用。本研究比較腸梗阻患者的病變組織和正常組織的組織結(jié)構(gòu)改變和細(xì)胞凋亡的差異,腸組織肌層和黏膜層MLCK和pMLC的表達(dá)差異,緊密連接蛋白(zonula occludens-1,ZO-1)的表達(dá)差異,以及腸梗阻患者手術(shù)前后血液中MLCK含量的變化,探究MLCK和pMLC在腸梗阻患者腸道及腸黏膜屏障中的作用,檢測(cè)血液中MLCK的含量對(duì)于判斷腸黏膜屏障損傷的意義。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2020年3月在金華市中心醫(yī)院因腸梗阻進(jìn)行手術(shù)的患者28例為觀察組,另選取同期年齡性別相仿的健康體檢者30例為對(duì)照組。觀察組中男18例、女10例,平均年齡(57.28±6.98)歲,小腸段梗阻22例、回腸段梗阻6例。所有病例術(shù)中均見(jiàn)梗阻腸近段擴(kuò)張,遠(yuǎn)端狹窄,為梗阻表現(xiàn);術(shù)后病理診斷符合腸梗阻表現(xiàn);排除因腫瘤、單純狹窄、腸套疊、寄生蟲(chóng)等非動(dòng)力原因引起的梗阻。組織標(biāo)本選取患者的狹窄部腸段和正常無(wú)變化腸段。對(duì)照組中男20例、女10例,平均年齡(57.83±6.83)歲;觀察組和對(duì)照組年齡、性別占比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有研究對(duì)象知情同意,本研究經(jīng)過(guò)金華市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要材料 蘇木素購(gòu)自上海展云化工,倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本的Olympus公司,TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司,MLCK、pMLC、ZO-1、β-actin抗體均購(gòu)自英國(guó)的Abcam公司,兔二抗、鼠二抗、DAB顯色試劑盒購(gòu)自中杉金橋,蛋白酶K購(gòu)自德國(guó)Biofroxx公司,組織蛋白提取試劑盒、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher,MLCK酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)于上海江萊生物。

1.3 血液學(xué)檢測(cè) 采集腸梗阻患者手術(shù)前和手術(shù)后3天,以及健康體檢者的外周靜脈血5 mL,置于鈍性分離膠試管中,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)MLCK的含量。按試劑盒上的操作步驟嚴(yán)格操作,450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。

1.4 組織標(biāo)本檢測(cè)

1.4.1 HE染色 手術(shù)切除的病變腸組織和腸旁正常組織立即置入4%多聚甲醛中固定24 h后做組織病理切片,顯微鏡下觀察腸組織病理變化情況。根據(jù)Chiu評(píng)分法評(píng)價(jià)腸道黏膜損傷等級(jí):0為正常腸黏膜絨毛;1級(jí)為在絨毛中軸出現(xiàn)腸黏膜上皮下的Gruenhagen’s間隙,常常伴隨毛細(xì)血管充血;2級(jí)為來(lái)自固有膜的腸黏膜上皮抬高及腸上皮下間隙的擴(kuò)張;3級(jí)為大片腸黏膜上皮抬高,絨毛向兩側(cè)倒伏,部分絨毛頂端脫落;4級(jí)為絨毛及固有膜脫落,裸露的毛細(xì)血管擴(kuò)張,可見(jiàn)固有膜細(xì)胞成分構(gòu)成增加;5級(jí)為固有膜脫變或被消化,出血或潰瘍形成。

1.4.2 Tunel 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 嚴(yán)格按照碧云天細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒步驟進(jìn)行操作,其中滴加20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K,20 ℃～37 ℃作用20 min,滴加按說(shuō)明書配置的TdT反應(yīng)液50 μL,37 ℃避光孵育60 min,滴加50 μL Streptavidin-HRP標(biāo)記液,37 ℃避光孵育30 min。顯微鏡下統(tǒng)計(jì)整張玻片相應(yīng)部位細(xì)胞核被染色成深棕色的凋亡細(xì)胞數(shù)量。

1.4.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 石蠟組織切片經(jīng)二甲苯和不同濃度酒精脫水后,進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè),顯微鏡下觀察MLCK和pMLC在梗阻腸段肌層和黏膜層的表達(dá)情況。

1.4.4 Western blot(WB) 檢測(cè) 手術(shù)獲得腸組織,選取病變部位和正常部位腸組織樣本,用蛋白提取試劑盒提取蛋白,并用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)蛋白濃度,進(jìn)行WB檢測(cè),用ECL試劑盒顯影,并觀察分析蛋白表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料用(%)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血中MLCK含量 對(duì)照組和觀察組手術(shù)前、后外周血MLCK的含量分別為(1.52±1.16) g/L、(12.56±4.11) g/L、(2.04±0.83) g/L,三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=177.69,P<0.001);觀察組術(shù)后外周血MLCK的含量和正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.80,P=0.423)。

2.2 腸組織病理變化 HE染色顯示,梗阻部位腸組織結(jié)構(gòu)破壞,相較于正常腸組織有大量上皮細(xì)胞脫落,少量絨毛裸露,腸道黏膜損傷分級(jí)Chiu評(píng)分3級(jí)。Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示,腸梗阻部位組織的凋亡細(xì)胞(31.66±4.04)多于正常腸組織(1.33±1.53),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= -12.16,P<0.05)。見(jiàn)封三圖3。

2.3 MLCK和pMLC在梗阻腸段肌層和黏膜層的表達(dá)水平 免疫組化檢測(cè)顯示,梗阻部位腸組織肌層和黏膜層MLCK、pMLC的表達(dá)均高于正常腸組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見(jiàn)封三圖4、5。

2.4 梗阻段MLCK、pMLC、ZO-1的表達(dá)水平 WB檢測(cè)結(jié)果顯示,相較于正常腸段,梗阻段的MLCK(0.7632±0.3423)、pMLC(0.6399±0.2239)表達(dá)升高,ZO-1表達(dá)(0.1445±0.1430)降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-30.145、10.793、-13.807,均P<0.01)。見(jiàn)圖1。

注:**P<0.01。圖1 MLCK、pMLC、ZO-1的 WB檢測(cè)結(jié)果(A)和灰度比值統(tǒng)計(jì)柱狀圖(B)Figure 1 WB detection results (A) and histogram of gray ratio statistics (B) of MLCK、pMLC、ZO-1

3 討論

MLCK是一種依賴于Ca2+-鈣調(diào)蛋白的激酶,存在于不同組織中,其中平滑肌MLCK負(fù)責(zé)肌肉收縮的啟動(dòng),決定其最大縮短速度和最大縮短能力,當(dāng)Ca2+濃度升高時(shí),通過(guò)催化MLC磷酸化激活橫橋ATP酶,興奮肌肉收縮偶聯(lián),使細(xì)肌絲向粗肌絲滑行,進(jìn)而產(chǎn)生收縮效應(yīng)[8]。腸梗阻是多種原因引起的腸道內(nèi)容物通過(guò)障礙,按病因可分為機(jī)械性腸梗阻、動(dòng)力性腸梗阻、血運(yùn)性腸梗阻,按照腸壁血循環(huán)可分為單純性腸梗阻和絞窄性腸梗阻。動(dòng)力性腸梗阻的患者腸道蠕動(dòng)功能喪失或腸道痙攣是其產(chǎn)生腸梗阻的原因。本研究選取腸梗阻手術(shù)患者為觀察對(duì)象,術(shù)后病理結(jié)果排除因腫瘤、單純狹窄、腸套疊、寄生蟲(chóng)等非動(dòng)力原因引起的梗阻,可以更好地說(shuō)明單純腸梗阻發(fā)生時(shí)MLCK的作用。

本研究HE染色可見(jiàn)梗阻腸道上皮細(xì)胞凋亡增加,組織破壞,符合腸梗阻的基本病理表現(xiàn)。免疫組化發(fā)現(xiàn)MLCK及pMLC在腸梗阻段的肌層以及黏膜層表達(dá)均升高,肌層的表達(dá)升高證明腸梗阻發(fā)生時(shí)腸道處于收縮痙攣的狀態(tài),這是造成內(nèi)容物不能正常通過(guò)的原因,和國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者通過(guò)動(dòng)物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究MLCK在腸梗阻中的作用結(jié)果相似[9-10]。

腸道黏膜層的表達(dá)升高可能和腸黏膜屏障的破壞有關(guān)。國(guó)內(nèi)外眾多研究表明,MLCK及pMLC在非酒精性脂肪肝、胰腺炎、炎癥性腸病等患者的腸黏膜中都存在表達(dá)升高的情況[11-13],研究者認(rèn)為這和腸道黏膜屏障的破壞有關(guān)。腸黏膜屏障分為四層:生物屏障、機(jī)械屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障[14],腸黏膜的通透性主要與機(jī)械屏障有關(guān),機(jī)械屏障由腸上皮細(xì)胞及其連接構(gòu)成,腸上皮間的連接包括緊密連接(tightjunction,TJ)、縫隙連接(gapjunction,GJ)、黏附連接(adhesionjunction,AJ)及橋粒(desmosome)等,其中TJ最重要,ZO-1是其中重要的一個(gè)蛋白。炎癥因子如TNFα、LPS等可以通過(guò)活化MLCK,引起肌球蛋白輕鏈磷酸化,使TJ打開(kāi),從而使腸黏膜屏障遭到破壞[14],我們通過(guò)免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)得到MLCK和pMLC在梗阻腸道表達(dá)升高而ZO-1表達(dá)降低的結(jié)果,顯示梗阻段腸黏膜緊密連接打開(kāi),黏膜屏障破壞和MLCK的作用相關(guān)。

此外,本研究還利用ELISA的方法測(cè)定腸梗阻患者手術(shù)前后外周血中MLCK的含量,并與正常體檢人群外周血中的含量進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)在梗阻發(fā)生時(shí)血液中MLCK的含量升高,當(dāng)梗阻解除后含量和正常者無(wú)差異。熊莊莉等[15]曾做過(guò)哮喘患者血清中MLCK含量和肺功能的關(guān)系研究,發(fā)現(xiàn)在哮喘患者中MLCK高表達(dá),且與肺功能呈正相關(guān),她認(rèn)為血液中高表達(dá)的MLCK提示其在哮喘中的作用。本研究結(jié)果間接說(shuō)明通過(guò)血液中MLCK的含量可以了解腸道平滑肌和腸黏膜屏障的狀態(tài)。

綜上,本研究證實(shí)肌球蛋白輕鏈激酶在腸梗阻的發(fā)生和腸黏膜屏障破壞中起著重要作用,并且梗阻發(fā)生時(shí)血液中MLCK的含量升高,梗阻解除后含量恢復(fù)和正常對(duì)照無(wú)差異,對(duì)于后期研究腸梗阻早期診斷標(biāo)志物,判斷腸黏膜屏障功能是否破壞,以及抑制MLCK表達(dá)從而達(dá)到治療腸梗阻的作用提供一定的基礎(chǔ)。但由于本研究樣本量不夠大,以及研究方法的局限性,還需要大量的實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步研究MLCK對(duì)于腸梗阻的作用。