干擾素體外釋放酶聯(lián)免疫檢驗(yàn)技術(shù)在結(jié)核病臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值分析

丁祥

鹽城市大豐人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇大豐 224000

結(jié)核病主要是由結(jié)核桿菌感染引起的慢性傳染病，在青年人中較為多見(jiàn)，潛伏期為4～8 周，80%的患者發(fā)生于肺部，患者常會(huì)出現(xiàn)低熱、乏力、咳嗽等癥狀，對(duì)其正常生活帶來(lái)極大困擾，威脅身體健康[1]。近年來(lái)，該病發(fā)病率逐漸呈上升趨勢(shì)，控制結(jié)核病的流行尤為重要[2]。對(duì)于此病，既往臨床主要采用細(xì)菌學(xué)檢測(cè)，但該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，敏感性較低，診斷效能無(wú)法滿足臨床需求。結(jié)核菌素皮膚過(guò)敏試驗(yàn)為一種免疫學(xué)檢測(cè)方法，應(yīng)用較為廣泛，但易受非結(jié)核分枝桿菌感染、卡介苗接種的影響，假陽(yáng)率較高。而干擾素體外釋放酶聯(lián)免疫檢驗(yàn)技術(shù)（enzyme-linked immunosorbent assay for interferon release in vitro, ELIIGRA）為結(jié)核分枝復(fù)合群間接的免疫學(xué)篩查技術(shù)，操作簡(jiǎn)單、設(shè)備儀器要求低、檢測(cè)周期短，應(yīng)用價(jià)值高[3]。但目前，臨床關(guān)于ELIIGRA 對(duì)結(jié)核病的臨床診斷價(jià)值鮮見(jiàn)報(bào)道。基于此，本文選擇2020年1 月—2022年11 月鹽城市大豐人民醫(yī)院收治的118 例疑似結(jié)核病患者，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院就診的疑似結(jié)核病患者118例，其中男82例、女36例；年齡12～86歲，平均（49.00±10.21）歲；體質(zhì)指數(shù)14～24 kg/m2，平均（19.00±1.12）kg/m2。本文研究已經(jīng)通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：可耐受本研究相關(guān)檢查；認(rèn)知功能、溝通能力良好；知情且簽署協(xié)議書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：有惡性腫瘤疾病者；肝、腎功能障礙者；合并慢性阻塞性肺病、支氣管哮喘、支氣管擴(kuò)張等疾病者；合并免疫系統(tǒng)、感染性疾病者；近期使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等者；具有神經(jīng)系統(tǒng)疾病或病史、無(wú)法正常溝通交流者；臨床資料不完整者；依從性差者。

1.3 方法

1.3.1 結(jié)核菌素皮膚過(guò)敏試驗(yàn)方法 應(yīng)用皮內(nèi)注射法，先吸0.1 mL 純蛋白衍生物（pure protein derivative, PPD）原液備用，再吸0.2 mL PPD 原液加入0.9%氯化鈉注射液稀釋至0.4 mL，以備使用。PPD用量：第1 次試驗(yàn)液：每0.1 mL 中含有0.0001 mg。對(duì)注射部位進(jìn)行常規(guī)消毒，于上肢前臂進(jìn)行皮內(nèi)注射0.1 mL 標(biāo)準(zhǔn)PPD，2～3 d 后，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。觀察局部是否有硬結(jié)，并記錄硬結(jié)直徑，取平均值作為最終值，直徑平均≥5 mm 為陽(yáng)性，＜5 mm 為陰性。

1.3.2 ELIIGRA 試驗(yàn)方法 應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（enzyme-linked immunospot, ELISPOT）試劑（深圳市達(dá)科為生物技術(shù)公司），采集受試對(duì)象10 mL 靜脈血，應(yīng)用乙二胺四乙酸進(jìn)行抗凝處理，2 h 內(nèi)將其血液標(biāo)本分離成為單個(gè)核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcell, PBMC），洗滌2 次，于ELISPOT 培養(yǎng)板中預(yù)包被抗-IFN-γ 抗體，于板中各種加100 μL 的細(xì)胞懸液，每孔細(xì)胞數(shù)約為2.0×105個(gè)。在陽(yáng)性對(duì)照孔內(nèi)，每孔加入濃度為5 μg/mL 的植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA）；禁止在陰性對(duì)照孔各孔中添加刺激物。于實(shí)驗(yàn)孔中加入濃度為5 μg/mL 的PoolB、ESAT-6、PoolA 等特異性抗原刺激物。之后將培養(yǎng)板放在溫度為37℃、含有5%CO2的培養(yǎng)箱中，持續(xù)培養(yǎng)16～24 h。2 h 后洗板，將生物素化的抗IFN-γ 加入并溫育1 h。應(yīng)用親和素標(biāo)記二抗，再持續(xù)孵育1 h，加底物液，顯色。顯色洗板后應(yīng)用自來(lái)水終止反應(yīng)，應(yīng)用ELISPOT 測(cè)定儀記錄斑點(diǎn)數(shù)。檢測(cè)結(jié)果（每孔斑點(diǎn)數(shù)排除陰性孔中斑點(diǎn)數(shù)）斑點(diǎn)數(shù)量≥30，為陽(yáng)性；若PoolB、ESAT-6、PoolA 中≥1 種抗原結(jié)果為陽(yáng)性，則結(jié)果為陽(yáng)性；若3 種抗原測(cè)試結(jié)果均為陰性，則結(jié)果為陰性。

1.4 觀察指標(biāo)

以痰培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比分析兩種方法的診斷效能（靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性）。

診斷準(zhǔn)確性=（真陽(yáng)例數(shù)+真陰例數(shù)）/總例數(shù)×100%；診斷靈敏性=真陽(yáng)/（真陽(yáng)例數(shù)+假陰例數(shù)）×100%；診斷特異性=真陰例數(shù)/（真陰例數(shù)+假陽(yáng)例數(shù)）×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢查方法診斷結(jié)果

痰培養(yǎng)結(jié)果：118 例疑似患者中，陽(yáng)性107 例、陰性11 例。結(jié)核菌素皮膚過(guò)敏試驗(yàn)結(jié)果：真陽(yáng)97例、假陽(yáng)3 例、真陰8 例、假陰10 例；ELIIGRA 試驗(yàn)結(jié)果：真陽(yáng)105 例、假陽(yáng)1 例、真陰10 例、假陰2 例。見(jiàn)表1。

表1 兩種檢查方法診斷結(jié)果

2.2 兩種檢查方法診斷效能對(duì)比

ELIIGRA 試驗(yàn)的診斷準(zhǔn)確性、敏感性均高于結(jié)核菌素皮膚過(guò)敏試驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；兩種檢查方式診斷特異性對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.092）。見(jiàn)表2。

表2 兩種檢查方法診斷效能對(duì)比

3 討論

我國(guó)為結(jié)核病發(fā)病率較高的國(guó)家之一，患者總數(shù)居世界第二，并且感染者的數(shù)量不斷增加，嚴(yán)重降低了我國(guó)國(guó)民的生活質(zhì)量，威脅患者身體健康[4-6]。目前，在結(jié)核病的防治中，最大的難題仍為結(jié)核病的診斷問(wèn)題，臨床上常采用臨床癥狀、影像學(xué)、病理學(xué)等多種手段聯(lián)合診斷，但多數(shù)患者缺乏典型的臨床及影像學(xué)表現(xiàn)，易出現(xiàn)漏診、誤診等情況，而病理學(xué)檢查中標(biāo)本取材困難，診斷難度高[7-8]。因此，及時(shí)尋求一種更安全、有效、簡(jiǎn)便的診斷技術(shù)具有必要性。

徐寧等[9]學(xué)者報(bào)道發(fā)現(xiàn)，結(jié)核γ-干擾素酶聯(lián)免疫法釋放試驗(yàn)結(jié)果與病理結(jié)果具有較高的一致性。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核菌素皮膚過(guò)敏試驗(yàn)結(jié)果：真陽(yáng)97 例、假陽(yáng)3 例、真陰8 例、假陰10 例；ELIIGRA試驗(yàn)結(jié)果：真陽(yáng)105 例、假陽(yáng)1 例、真陰10 例、假陰2 例。與結(jié)核菌素皮膚過(guò)敏試驗(yàn)相比，ELIIGRA 試驗(yàn)的診斷準(zhǔn)確性、靈敏性更高（P＜0.05）。張青卿等人[10]研究數(shù)據(jù)顯示，結(jié)核γ-干擾素釋放試驗(yàn)診斷肺結(jié)核的符合率為88.76%。本文數(shù)據(jù)顯示，ELIIGRA 診斷結(jié)核病的準(zhǔn)確率為97.46%。這與張青卿等學(xué)者報(bào)道一致。提示ELIIGRA 對(duì)肺結(jié)核的診斷效能較好。主要是因?yàn)?，結(jié)核菌素試驗(yàn)為臨床常用的檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis, MTB）的免疫學(xué)方法，但其檢測(cè)結(jié)果會(huì)受到非MTB 感染、卡介苗接種的影響，且我國(guó)卡介苗接種率比較高，導(dǎo)致結(jié)核菌素試驗(yàn)檢查的假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)較高，影響診斷效能[11-12]。而ELIIGRA 為一種新的免疫學(xué)方法，主要通過(guò)體外釋放酶聯(lián)免疫技術(shù)，對(duì)全血中MTB 記憶性T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的γ干擾素濃度進(jìn)行檢測(cè)，該方法主要應(yīng)用缺失區(qū)域1，有2 種基因的重組抗原刺激MTB 感染者特異性T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生γ 干擾素，具有較強(qiáng)的特異性，還不會(huì)受卡介苗接種、非MTB 的干擾，診斷效能較高[13-14]。且ELIIGRA 操作簡(jiǎn)單快捷、對(duì)設(shè)備及儀器的要求也較低，檢測(cè)的周期短，可快速、準(zhǔn)確做出診斷[15-16]。但本文還發(fā)現(xiàn)，ELIIGRA 診斷也出現(xiàn)了假陽(yáng)性、假陰性的情況，這可能是因?yàn)椴僮髁鞒讨杏屑?xì)菌污染實(shí)驗(yàn)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。

綜上所述，對(duì)于結(jié)核病患者采用干擾素體外釋放酶聯(lián)免疫檢驗(yàn)技術(shù)的診斷準(zhǔn)確性較高，可早期準(zhǔn)確診斷出此病，便于及時(shí)進(jìn)行治療，臨床應(yīng)用價(jià)值顯著。