糖尿病合并頸動(dòng)脈狹窄患者中Ang Ⅱ調(diào)節(jié)T 細(xì)胞活性的相關(guān)研究

王 凱，金 鳳

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院影像診斷科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050）

2 型糖尿?。═2DM）是由于各種原因?qū)е碌囊葝u素分泌不足和胰島素敏感性缺乏的一種疾病。T2DM 的發(fā)病率逐年上升，糖尿病及其并發(fā)癥的治療[1]是世界范圍的問(wèn)題，對(duì)于家庭和社會(huì)產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)巨大。T2DM 與周?chē)懿　⒛X血管病和冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)病密切相關(guān)[2]。T2DM 中動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制仍是亟待解決的問(wèn)題，對(duì)其機(jī)制的研究也是目前熱點(diǎn)。

免疫紊亂是引起T2DM 并發(fā)癥的主要原因，報(bào)道也較多[3]。免疫紊亂與T 淋巴細(xì)胞密切相關(guān)。T淋巴細(xì)胞分為不同亞型和類別，主要亞型有Th1、Th2和Th17，產(chǎn)生不同類型炎癥相關(guān)因子，從而導(dǎo)致感染和免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)破壞[4]。有證據(jù)證實(shí)特定的T細(xì)胞亞型對(duì)Ang Ⅱ誘發(fā)的高血壓和相關(guān)血管紊亂疾病有潛在的影響[4]。所以，我們考慮T 細(xì)胞亞型（Th1、Th2 和Th17）可能參與了T2DM 患者的頸動(dòng)脈粥樣硬化（carotid atherosclerosis stenosis，CAS）形成；T 細(xì)胞亞型可能會(huì)促發(fā)Ang Ⅱ相關(guān)T2DM 患者的頸動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展。

為了證實(shí)我們的推測(cè)，在T2DM 患者合并或不合并CA中，研究T細(xì)胞亞型的表達(dá)。同時(shí)研究作為對(duì)照組的健康體檢者外周血單核細(xì)胞中分離出的T細(xì)胞亞型（Th1、Th2 和Th17），應(yīng)用Ang Ⅱ刺激劑或Ang Ⅱ拮抗劑治療后的T 細(xì)胞的變化，進(jìn)而推測(cè)Ang Ⅱ調(diào)節(jié)T 細(xì)胞變化可能促進(jìn)T2DM 患者的頸動(dòng)脈粥樣硬化形成?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 研究對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年9月至2021年6月診斷為2型糖尿病的患者200 例。根據(jù)頸部彩超結(jié)果，所有患者被分成兩組，CA 組（2 型糖尿病合并頸動(dòng)脈狹窄組）100 例和T2DM 組100 例，另外選30 例健康體檢者。根據(jù)美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，糖尿病的診斷基于血糖水平和糖化血紅蛋白（HbA1c）水平（血糖水平＞200mg/dL and HbA1c ＞6.5%）。納入標(biāo)準(zhǔn)：勁動(dòng)脈狹窄經(jīng)過(guò)我院彩超鑒定狹窄≥30%。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）高血壓；（2）冠心??；（3）充血性心衰；（4）急性或慢性炎癥；（5）腦卒中病史；（6）肝功能不全和或腎功能不全；（7）腫瘤和或風(fēng)濕性疾?。唬?）抗炎藥物史如非甾體抗炎藥物、類固醇藥物和其他等。同時(shí)，30 例健康體檢者作為對(duì)照組。對(duì)基本特征（包括年齡、性別、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、高血壓病史、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、吸煙）進(jìn)行收集和記錄整理。

1.2 血樣處理

禁食情況下肘靜脈采血分裝到兩個(gè)真空采血管中，一支用肝素抗凝，離心后分離出上清液裝到無(wú)菌EP 管中，之后保存在-80 ℃，用來(lái)進(jìn)行IFN-γ、IL-4 以及IL-17水平的檢測(cè)。下層細(xì)胞用來(lái)分離外周血單核細(xì)胞（PBMCs）。另外一支試管裝有乙二胺四乙酸（EDTA）酶抑制劑，在3000 r/min離心4～5 min后，分離出來(lái)的血漿裝到無(wú)菌EP管中保存在-80 ℃用來(lái)檢測(cè)Ang Ⅱ。

1.3 分離和培養(yǎng)PBMCs

用聚蔗糖泛影鈉的密度梯度離心法從全血細(xì)胞中分離出單核細(xì)胞（2500 r/min，10 min）。之后通過(guò)磁單元細(xì)胞用Miltenyi Biotech 工具（根據(jù)說(shuō)明書(shū)）分離單核細(xì)胞。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMCs 的純度。分離的PBMCs 放在RPMI1640 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中包括10%牛胎兒血清（FBS）和增補(bǔ)的2 mm 左旋谷酰胺，100 U/mL 青霉素和100 g/mL 鏈霉素，37 ℃，5%CO2保溫箱。

與此同時(shí)，從健康體檢者分離出的PBMCs 分成8組，分別用0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L Ang Ⅱ有或沒(méi)有氯沙坦（一種Ang Ⅱ拮抗劑；默克和默沙東，英國(guó)）作用48 h。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定Th1、Th2以及Th17細(xì)胞比例

分離出的PBMCs平鋪于24孔板中以2×105cells/孔培養(yǎng)并進(jìn)行檢測(cè)。培育24 h 后，25 ng/mL 聚丙烯酸甲酯（PMA）、50 ng/mL 伊烏諾霉素以及1 μL 莫能霉素加到每個(gè)孔中并在37 ℃保存和操作，5% CO2保溫箱中保存4 h，以300 r/min離心分離10 min重懸細(xì)胞，加入兔血清封閉30 min，加入兔抗人CD4-PE抗體避光孵育20 min。用PBS液體清洗后按說(shuō)明書(shū)加200 μL固定液固定10 min，用1 mL破膜液體作用10 min。細(xì)胞用鼠抗人FITC-IFN-γ、FITC-IL-4以及FITC-IL-17孵育培養(yǎng)，分別在黑暗條件下孵育20 min。最后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th1（positive with FITCIFN-γ）、Th2（positive with FITC-IL-4）以及Th17（positive with FITC-IL-17）比例。

1.5 實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

應(yīng)用試劑盒從PBMCs中提取總RNA，根據(jù)說(shuō)明書(shū)用cDNA 組合體（Toyobo，Japan）逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR用綠色試劑盒（TaKaRa，Shiga，Japan）在iQ5 檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）上進(jìn)行。過(guò)程如下：95 ℃for 4 min；45 cycles of 95 ℃for 5 sec以及62 ℃for 30 sec；

引物序列（Invitrogen，Carlsbad，CA），被用來(lái)擴(kuò)增如下：

基因表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄使得β-actin 標(biāo)準(zhǔn)化和用2-ΔΔCt方法測(cè)定。每個(gè)樣本做3次，并且每個(gè)數(shù)據(jù)驗(yàn)證3次。

The fold-change of gene expression was normalized to βactin and calculated using the2-ΔΔCt method. Each sample was

repeated in triplicates and all the experiments were conducted for three times.

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

血漿中Ang Ⅱ、IFN-γ、IL-4以及IL-17的水平用ELISA 法檢測(cè)（Bender 試劑盒，Vienna，Austria），根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。在溶液中反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀（BIORAD，USA）測(cè)定，定在450 nm。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有的數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，應(yīng)用SPSS 18.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）。組間比較用one-way ANOVA，組內(nèi)比較LSD 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 所有病例的基本情況和Ang Ⅱ水平

所有參與者的基本情況如表1所示。三組患者中年齡、血糖、總膽固醇和低密度脂蛋白明顯不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。吸煙和高血壓在CA組和T2DM組多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。然而，三組患者中性別、甘油三酯、高密度脂蛋白、收縮壓和舒張壓組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，Ang Ⅱ水平CA組（80.66±17.20）pg/mL明顯高于T2DM組（35.49±15.01）pg/mL和對(duì)照組（35.14±0.43）pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表1）。

TG：甘油三酯；TC：總膽固醇；SBP：收縮壓；DBP：舒張壓；Ang Ⅱ：血管緊張素Ⅱ。

2.2 T細(xì)胞活性的變化

不同組間外周血單核細(xì)胞中Th1、Th2 和Th17細(xì)胞比例應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（見(jiàn)圖1）。Th1 和Th17陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在CA組明顯高于T2DM組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；T2DM 組和對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。另外，Th2 細(xì)胞比例在三組間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 流式細(xì)胞法檢測(cè)的Th1, Th2和Th17

T-bet，GATA3 和RORγt 分別作為T(mén)h1、Th2 和Th17 的轉(zhuǎn)錄因子，也是用外周血單核細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR 試驗(yàn)檢測(cè)（圖2A）。同樣得到，T-bet 和RORγt水平在CA組明顯高于T2DM組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但是GATA3 水平在三組中表達(dá)相似，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2A和圖2B 不同組間T細(xì)胞的表達(dá)因子的表達(dá)情況A 不同組間T-bet、GATA3 和RORγt mRNA 水平的表達(dá)（PCR）；B 不同組間血漿中IFN-γ、IL-4 和IL-17 表達(dá)情況（ELISA）。Column:mean,n=3 and bar:SD；**P ＜0.01 vs control group.

血漿中作為T(mén)h1、Th2和Th17的特征因子IFN-γ、IL-4 和IL-17 在CA 組、T2DM 組和對(duì)照組進(jìn)行比較（圖2B）。在CA 組IFN-γ 和IL-17 的表達(dá)比T2DM 組和對(duì)照組明顯上調(diào)，然而IL-4 水平保持不變（P＞0.05）。

2.3 Ang Ⅱ水平的比較

CA 組Ang Ⅱ水平（80.66 ± 17.20）pg/mL 明顯高于對(duì)照組（35.14 ± 0.43）pg/mL 和T2DM 組（35.49±15.01）pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；后兩組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)圖3）。

圖3 三組患者血漿中Ang Ⅱ水平的比較

2.4 培養(yǎng)PBMCs中效應(yīng)T細(xì)胞比例以及加入Ang Ⅱ和/或ARB后效應(yīng)性T細(xì)胞比例變化的比較

PBMCs 從健康人外周血分離出來(lái)后分成8 組，分別加入0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L Ang Ⅱ，不加ARB 的組效應(yīng)T 細(xì)胞的變化以及和分別加入0.1 μmol/L ARB作用48 h的變化，見(jiàn)圖4。Th1和Th17細(xì)胞的活性，隨著加入0 μmol/L，0.1 μmol/L，1 μmol/L，10 μmol/L Ang Ⅱ濃度的增大而表達(dá)增高，在10 μmol/L Ang Ⅱ刺激組達(dá)到最大效應(yīng)，與對(duì)照組相比，Th1細(xì)胞比例增加1倍多，Th17細(xì)胞比例增加4倍。在0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L 不同濃度Ang Ⅱ組中均設(shè)置相應(yīng)濃度的氯沙坦（ARB）預(yù)處理各個(gè)亞組。我們看到的結(jié)果是，Ang Ⅱ上調(diào)Th1和Th17細(xì)胞活性的效應(yīng)被氯沙坦顯著抑制。

圖4 不同濃度AngⅡ和不同濃度ARB刺激后效應(yīng)性T細(xì)胞比例

我們得到的結(jié)果如圖4 所示：與對(duì)照組比較，Ang Ⅱ刺激下Th1 細(xì)胞比例隨著Ang Ⅱ濃度升高而上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Ang Ⅱ刺激組比較，氯沙坦預(yù)處理+ Ang Ⅱ刺激組Th1 細(xì)胞比例下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，Ang Ⅱ刺激組Th17 細(xì)胞比例隨著Ang Ⅱ濃度升高而上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與Ang Ⅱ刺激組比較，氯沙坦預(yù)處理+Ang Ⅱ刺激組Th17細(xì)胞比例下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，給予Ang Ⅱ刺激和氯沙坦預(yù)處理+Ang Ⅱ刺激Th2細(xì)胞比例均無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

3 討論

許多研究者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)心腦血管疾病的發(fā)病與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)，而動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展與血管炎癥有關(guān)，血管炎癥的特征是免疫和炎癥的細(xì)胞浸潤(rùn)明顯呈高水平表達(dá)[5]。炎性反應(yīng)激活了大量免疫T 淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致免疫功能紊亂而形成正反饋循環(huán)，進(jìn)而增強(qiáng)炎性反應(yīng)，促進(jìn)了動(dòng)脈粥硬化的形成[5]。本研究中，Th1 和Th17 細(xì)胞比例的增高，以及mRNA 水平的T-bet 和RORγt 的轉(zhuǎn)錄因子，血漿中IFN-γ 和IL-17表達(dá)水平，這些因子在CA 組患者中相比T2DM 組患者明顯增多（P＜0.05）。本研究結(jié)果證實(shí)了T細(xì)胞活性在伴有2型糖尿病的患者形成頸動(dòng)脈狹窄的過(guò)程中更多的是起著關(guān)鍵作用。同時(shí)證實(shí)假設(shè)成立，Th1 和Th17 細(xì)胞數(shù)及其表達(dá)因子和轉(zhuǎn)錄因子在CA 組中較對(duì)照組和T2DM 組明顯增加。這提示Th1和Th17細(xì)胞在CA 組患者頸動(dòng)脈粥樣硬化形成中起到促進(jìn)作用。

相關(guān)研究報(bào)道[6]提到Ang Ⅱ廣泛地參與動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的形成和進(jìn)展。更多的證據(jù)[7]揭示出炎癥事件和血管緊張素系統(tǒng)的相互影響很大。Ang Ⅱ誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和增加了免疫系統(tǒng)的活性，在Ang Ⅱ受體缺乏的小鼠身上，T 細(xì)胞活性被抑制。這些可能說(shuō)明，伴有T2DM的CA患者形成動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中Ang Ⅱ和T cell 活性密切相關(guān)，我們的研究也得到了相似的結(jié)論。

ARB 類藥物如科素亞（氯沙坦的商品名）能夠阻斷血管緊張素受體（AT1），避免血管緊張素Ⅱ結(jié)合到受體上，抑制炎癥細(xì)胞活性，減少細(xì)胞因子、黏附因子等的表達(dá)，從而減弱Ang Ⅱ的促炎作用，最終達(dá)到防止AS 形成的目的。近年來(lái)的研究表明[8～13]，ARB 類藥物如氯沙坦、纈沙坦、替米沙坦等還有抑制Th1 為主的免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫的作用。在本組實(shí)驗(yàn)中，我們用氯沙坦預(yù)處理作為拮抗劑，不僅顯著使Th1細(xì)胞活性下調(diào)，而且下調(diào)Th17細(xì)胞的活性，但對(duì)Th2 細(xì)胞活性無(wú)影響。這提示氯沙坦通過(guò)結(jié)合T淋巴細(xì)胞表面的AT1受體從而抑制Ang Ⅱ所誘導(dǎo)的效應(yīng)性T 細(xì)胞的活化。所以我們得出結(jié)論：通過(guò)調(diào)整T細(xì)胞活性和其表達(dá)因子，可能促進(jìn)2型糖尿病的頸動(dòng)脈狹窄形成和發(fā)展。Ang Ⅱ可以調(diào)節(jié)T 細(xì)胞活性及相關(guān)因子的表達(dá)，可能會(huì)促進(jìn)T2DM患者發(fā)生頸動(dòng)脈粥硬化。

本研究中仍有一些局限性。首先，不同組中年齡的顯著差異，歸因于CA多見(jiàn)于老年人。年齡相一致的對(duì)照可能更恰當(dāng)和更具說(shuō)服力。同時(shí)，Ang Ⅱ和T 細(xì)胞活性之間的關(guān)系的潛在機(jī)制沒(méi)有研究，這些需要更深一步的實(shí)驗(yàn)研究。

由此得出結(jié)論，Th1 和Th17 細(xì)胞比例在CA 組明顯高于T2DM 組和對(duì)照組。與此一致，T-bet 、RORγt、IFN-γ和IL-17一樣，其表達(dá)都是在CA組明顯高于T2DM 組和對(duì)照組。因此，我們推測(cè)Ang Ⅱ可能會(huì)通過(guò)調(diào)整Th1、Th17 和相關(guān)促炎因子的表達(dá)促進(jìn)伴有T2DM的頸動(dòng)脈粥樣硬化狹窄的形成。我們的研究可能為研究伴有T2DM的心腦血管疾病新的藥物作用靶點(diǎn)和發(fā)病機(jī)制提供新的關(guān)注點(diǎn)。