miR-29c 和miR-93 在卵巢癌患者血清中的表達及其臨床意義

于聰祥，李躍飛，劉亞萍*

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010012）

卵巢癌（ovarian cancer，OvCa）在全球女性惡性腫瘤中的發(fā)病率及病死率位居第四[1]，約85%卵巢癌發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于中晚期[2]，5 年總生存率低于30%[3]，預后相對較差，并且有年輕化趨勢。目前國內(nèi)外面臨的瓶頸是缺乏有效的篩查手段，難以對卵巢癌進行早期診斷以及精準治療。研究發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移與p53突變率、p16和Ki67的高表達率具有顯著相關(guān)性，有助于進行臨床診斷，可能作為診斷和預后的特異性抗體指標[4]。然而p53 突變率、p16 和Ki67 的表達率不能應(yīng)用于卵巢癌的早期篩查及早期診斷。血清糖類抗原125（cancer antigen125，CA125）是MUC16 基因編碼的糖蛋白，在正常組織中呈低表達或不表達，在卵巢癌惡性腫瘤中卻呈顯著升高趨勢，廣泛應(yīng)用于卵巢癌的早期診斷。然而其敏感性、特異性相對較低，并且假陽性率相對較高[5]。相當多的患者難以實現(xiàn)早期診斷，而錯失治療時機。微小核糖核酸（micro RNA，miRNA）是在惡性腫瘤中新近發(fā)現(xiàn)的一類影響腫瘤轉(zhuǎn)移、復發(fā)的重要生物學標志物。miRNA 是由20～22 個核苷酸組成的一類內(nèi)源性、不編碼蛋白質(zhì)的小型非編碼RNA，轉(zhuǎn)錄后通過靶向互補的DNA 和miRNA 序列調(diào)控基因表達[6]。目前的研究熱點主要集中在試圖將miRNA 作為癌癥的早期診斷指標。然而關(guān)于miRNA 與卵巢癌的研究仍處于起步階段，miRNA 能否聯(lián)合CA125 作為卵巢癌診斷及治療的重要分子標志物，以實現(xiàn)對卵巢癌的二級預防，是亟待解決的重要問題。本課題擬通過測定卵巢癌患者血清中miR-29c、miR-93 表達情況，探討miR-29c、miR-93 在卵巢癌患者中的生物學特性，進而分析其潛在的臨床應(yīng)用價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2016 年4 月至2018 年1 月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科因卵巢腫瘤住院的患者32例，其中卵巢癌患者20 例（包括卵巢上皮性惡性腫瘤14例、非上皮性惡性腫瘤6 例）、卵巢良性腫瘤（benign ovarian tumor，BT）12 例，所有患者入組前采集血液標本，待術(shù)后病理確診方列入相應(yīng)組別。所有卵巢癌均行卵巢癌根治術(shù)。另隨機選取無卵巢腫瘤的正常健康女性（normal healthy women，N）12 例為對照組，采集血液樣本。研究組患者平均年齡（42.52±4.38）歲，對照組平均年齡（41.68±3.86）歲，對照組平均年齡（39.82±4.13）歲，組間比較平均年齡等一般資料差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），有可比性。所有受試者均簽署知情同意書，且本研究已獲得內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準。入組前未接受放化療或激素藥物治療；不合并自身免疫系統(tǒng)疾病、其他臟器器質(zhì)性病變及惡性腫瘤等。

1.2 標本采集

收集20 mL血液于EDTA管中，室溫下放置2 h，以3 000 rpm/min離心15 min，離心后將血漿勻漿等分于-80 ℃保存。

1.3 miRNA提取

根據(jù)生產(chǎn)商說明，使用QiAzol Lysis Reagent（Qiagen，杜塞爾多夫，德國）裂解血清樣品。將miRNeasy 血清、血漿摻入對照（Qiagen）添加到裂解樣品中進行miRNA提取。具體的提取過程如下：取200 μL 血清樣本，加入5 倍體積的裂解液，渦旋混勻，室溫靜置5 min；加3.5 μL control 工作液，混勻；加200 μL 氯仿，渦旋15 s，室溫放置3 min；4 ℃1 2000 rpm 離心15 min；取上清液至新EP 管，加1.5倍體積無水乙醇，渦旋混勻；將上述溶液移至吸附柱中，室溫1 2000 rpm 離心1 min，棄廢液；加700 μL RWT buffer至吸附柱中，室溫1 2000 rpm 離心1 min，棄廢液；加500 μL RPE buffer 至吸附柱中，室溫1 2000 rpm 離心1 min，棄廢液；加500 μL 80%乙醇至吸附柱中，室溫1 2000 rpm 離心2 min，棄廢液及收集管；將吸附柱置于新的收集管上，室溫1 2000 rpm離心5 min；將吸附柱置于新的EP 管上，加入14 μL RNase-free water于吸附柱中央，靜置1 min，1 2000 rpm離心1 min；提好的RNA放到-80 ℃保存。

1.4 血清miRNA反轉(zhuǎn)錄

使用Mir-XTM miRNA 第一鏈合成試劑盒（Ta-KaRa，中國大連）。根據(jù)生產(chǎn)商說明進行血清miRNA反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：5 μL緩沖液、3.75 μLRNA、1.25 μL酶。反應(yīng)條件如下：37 ℃反應(yīng)1 h、85℃反應(yīng)5 min。4 ℃冷卻，用100 μL cDNA，-20 ℃保存。

1.5 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

qRT-PCR反應(yīng)體系根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMII（TaKaRa）說明制備。每個樣品設(shè)置兩個反應(yīng)孔，并進行3 次平行實驗。反應(yīng)條件為：預變性（95 ℃，2 min）、變性（95 ℃，2 min）、退火（60 ℃，15 s）、延伸（72 ℃，30 s）、共進行40 個循環(huán)。上游引物由上海勝工生物工程有限公司提供。 mRQ 3'Primer作為下游引物（TaKaRa）。秀麗隱桿線蟲miR-39 作為內(nèi)參基因。采用RT-qPCR 實驗[18]檢測血清中特定miRNA 的相對表達量。將所研究的miRNA 的每個循環(huán)閾值（Ct）用內(nèi)源參考miRNA的Ct（ΔCt）進行標準化，ΔCt=平均值Ct（參考miRNA）-平均值Ct（目標miRNA），特定的miRNA 相對內(nèi)參基因的相對表達量采用2-Δct值表示。BT 或OvCa 組的每例患者均以正常健康女性組的平均值（N 個）（ΔΔCt）進行標準化。ΔΔCt=平均值Ct（來自N 個正常健康女性miRNA 的平均值）-平均值Ct（來自BT 或OvCa 的miRNA的平均值），特定的miRNAs相對陰性對照組的相對表達量采用2-Δct值表示。

1.6 引物

RT- qPCR 實驗中所用到的引物采用Primer 5軟件和NCBI Primer- BLAST 進行設(shè)計，Tm 值在60 ℃上下浮動，引物設(shè)計均符合RT-qPCR 正常進行的要求。具體引物見表1。內(nèi)參基因miR- 39（miRNeasy?Serum/ Plasma Spike- In Control），U6 引物（Mir-X?miRNA First-Strand Synthesis Kit），3′microRNA Primer 通用下游引物（Mir- X?miRNA First-Strand Synthesis Kit）均由試劑盒提供。F 表示上游引物，R表示下游引物。

表1 引物列表

1.7 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)用（±s）表示，利用t檢驗；計數(shù)數(shù)據(jù)用[n（%）]表示，利用χ2檢驗，組間比較采用秩和檢驗。通過受試者工作特征曲線（ROC）分析miRNA的診斷能力，并計算其下面積（AUC）。檢驗水準為α=0.05，P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義，預后采用Logistics回歸進行分析。

2 結(jié)果

2.1 主要指標

本研究共納入44 位受試者，包括20 位OvCa 患者（其中包括上皮性卵巢癌患者14例、非上皮性惡性腫瘤6例）、12位良性卵巢腫瘤患者（BT）和12位正常健康女性（N），以評估外周血中差異表達的miRNA。

2.2 選擇miRNA

根據(jù)文獻資料，本實驗選擇8 種miRNA 作為OvCa 患者候選生物學標志物[7～9]，包括miR-29c、miR-93、miR-141、miR-21、miR-200a、miR-200c、miR-494-5p 和miR-let-7f2-5p。資料表明在OvCa患者中，上述miRNA在血清或組織樣本中的濃度均比正常健康女性更高或更低。本研究預實驗應(yīng)用RT-qPCR檢測了12位卵巢癌患者血清中8種miRNA的表達。結(jié)果顯示，OvCa 患者血清中miR-29c、miR-93相對濃度顯著高于BT患者或正常健康女性。因此，后續(xù)實驗中選取miR-29c、miR-93 作為OvCa診斷的潛在血清miRNA指標進行驗證（見圖1）。

圖1 各組血清樣品中miRNA的表達情況

2.3 卵巢癌患者血漿中miR-29c 與miR-93 含量高于正常健康女性

本實驗通過qRT-PCR 分別對20 位OvCa 患者血清的每種miRNA（miR-29c、miR-93）進行了3 次測定，將3組獨立實驗的Ct值取平均值，并標準化為內(nèi)部參比miR-39，以獲得Δct值。如材料和方法[10]中所述計算2-Δct和2-ΔΔct值。通過分析受試者血清樣品中的表達來標準化這兩種miRNA的qRT-PCR數(shù)據(jù)。

與BT 患者和正常健康女性相比，OvCa 患者血清中miRNA（miR-29c、miR-93）濃度更高。N、BT和OvCa 組中miR-29c 的平均相對濃度分別為0.003、0.015和0.053（見圖2A）。N、BT和OvCa組中miR-93的平均相對濃度分別為0.112、0.345 和0.630（見圖2B）。散點圖顯示，OvCa患者miR-29c和miR-93的血清濃度高于正常健康女性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見圖2）。

圖2 不同組別miR-93濃度含量（OvCa 患者（n=20）、BT 患者（n=12）和正常健康女性（n=12）血清中miR-29c，miR-93的差異表達散點圖）。

2.4 miR-29c、miR-93 結(jié)合CA125 在OvCa 中的診斷價值

通過IBM SPSS Statistics 軟件對OvCa 患者血清中的miR-29c、miR-93 和CA125 進行聯(lián)合分析。參照正常CA125（＜35 U/mL）范圍，選擇中位數(shù)18 U/mL作為正常健康女性組的CA125值，miR-29c、miR-93血清水平的差異顯著，OvCa 患者和健康正常女性miR-29c、miR-93、CA125及其組合的AUC值分別為0.599、0.538、0.893 和0.910。miR-29c、miR-93 與CA125組合可以區(qū)分OvCa患者和正常健康女性，敏感性為89%（見圖3）。miR-29c、miR-93、CA125 及其組合的敏感性和特異性由最高的約登指數(shù)確定（敏感性+特異性-1）。總之，將miR-29c、miR-93與CA125結(jié)合起來作為診斷OvCa的新方法是可行的。

圖3 ROC曲線分析

2.5 miR-29c 、miR-93 結(jié)合CA125 對OvCa 預后分析

該實驗所檢測卵巢癌癥20例患者中，隨訪到16例，其中4例因聯(lián)系方式改變而失訪，截止到2020年12月31日，所隨訪患者隨訪時間均為≥4年、＜5年，結(jié)局變量為是否復發(fā)。因變量為是否復發(fā)，賦值：0=未復發(fā)，1=復發(fā)。自變量為miR29C、miR93 和CA125。選擇Logistics 回歸進行分析。經(jīng)Logistics回歸分析可知，miR29C、miR93 和CA125 對于是否復發(fā)沒有影響（P＞0.05）（見表2）。

表2 預后影響因素篩選結(jié)果

3 討論

卵巢位于盆腔深處，早期病變不易被發(fā)現(xiàn)，目前臨床上缺乏有效的篩查手段。大多數(shù)患者出現(xiàn)癥狀前來就診時已進展為晚期卵巢癌。治療效果明顯降低，患者預后差、生存率極低。因此，尋找特異性標志物以實現(xiàn)對卵巢癌的二級預防，早發(fā)現(xiàn)、早診斷并進行早期精準治療是改善卵巢癌患者不良預后的關(guān)鍵。

miRNA是一組內(nèi)源性非蛋白編碼RNA，約占人類基因組的1%～5%。其廣泛參與基因的表達和信號通路的調(diào)控，主要功能是參與基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控[6]。miRNA在腫瘤、炎癥等疾病中發(fā)揮重要作用，是目前國內(nèi)外的研究熱點，關(guān)于miRNA在卵巢癌發(fā)病機制中的研究仍處于起步階段。2020年胡菊梅等通過qRT-PCR 法檢測卵巢癌組織中和正常卵巢組織中miR-29b和miR-187的表達情況，發(fā)現(xiàn)miR-29b在卵巢癌組織中呈低表達，而miR-187 呈高表達，提出miR-29b 和miR-187 與卵巢癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征及預后相關(guān)，認為miR-29b和miR-187可能共同影響卵巢癌不良預后[11]。國外學者研究發(fā)現(xiàn)miRNA-141 在卵巢癌細胞中呈高表達，可促進卵巢癌細胞異常增殖，與卵巢癌轉(zhuǎn)移及預后有關(guān)[12]。miR-519a 通過調(diào)控信號通路及轉(zhuǎn)錄激活因子3（activating transcription factor 3，STAT3）發(fā)揮抑癌作用[13]。這表明多種miRNA可能與卵巢癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究表明miR-29c是血管內(nèi)皮細胞損傷的調(diào)節(jié)因子，miR-29c 通過靶向結(jié)合IGF-1 的3’-UTR，參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的細胞循環(huán)、增殖和血管形成等[14]。Liu 等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-29c 靶向抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，促進內(nèi)皮細胞的血管參與腫瘤形成。2015年穆鵬等[16]采用qRT-PCR對65 例卵巢癌患者經(jīng)手術(shù)切除的上皮性卵巢癌組織標本進行檢測分析發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中miR-29c表達水平高于正常組和良性腫瘤組。卵巢癌組miR-29c 表達水平與腫瘤分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，提出miR-29c 在卵巢癌診斷及病情評估方面具有一定應(yīng)用價值。本研究結(jié)果顯示，OvCa 患者血清中miR-29c 的濃度明顯高于卵巢良性腫瘤和正常健康女性的血清濃度（P＜0.05）。這提示miR-29c 可能通過調(diào)節(jié)血管形成促進卵巢癌細胞增殖侵襲，在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。通過檢測血清miR-29c 的表達情況可能輔助診斷卵巢癌。

miR-93 是近年發(fā)現(xiàn)的位于染色體7922 上的miR-106b-25基因簇，在非小細胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌組織中呈現(xiàn)高表達[17～19]。研究結(jié)果顯示[20]，miR-93 通過調(diào)控抑癌基因PTEN 發(fā)揮作用，過表達的miR-93 可阻斷細胞凋亡，與結(jié)直腸癌相關(guān)。miR-93 過表達可以促進鼻咽癌細胞[21]和食管癌細胞[22]的異常增殖，其過表達還與膽管癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)[23]。miR-93 在胃癌組織及胃癌細胞株中的表達明顯升高，過表達的miR-93 可顯著促進胃癌細胞的增殖，并誘導細胞由Go／G1期向S期演進，提出miR-93 通過促進細胞增殖，誘導細胞周期的演進而參與胃癌的形成[24]。這提示miR-93 在癌癥中發(fā)揮著促癌基因的作用。課題前期研究，分別在卵巢癌細胞株（A2780）和正常卵巢上皮細胞株（IOSE-80）中提取得到miRNA，并采用qRT-PCR 檢測兩種不同細胞系中miR-93 的相對表達水平，實驗結(jié)果顯示miR-93 在卵巢癌細胞系中的水平明顯高于正常卵巢上皮細胞[25]。然而，陳說等[26]研究發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌和卵巢交界性腫瘤中，miR-93的表達水平顯著低于正常卵巢組織，miR-93的表達水平與分化程度及FIGO 分期呈負相關(guān)。實驗結(jié)果顯示，Lnc RNA TDRG1 通過抑制miR-93 進而解除miR-93對Rho C（ras homolog family member c，Ras同源家族成員C）的靶向抑制作用，從而參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，OvCa患者miR-93的血清濃度顯著高于卵巢良性腫瘤組和正常健康女性，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這提示miR-93可能抑制細胞凋亡，增強卵巢癌細胞異常增殖及遷移能力，參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。通過檢測血清中miR-93的表達水平，可能提高卵巢癌的臨床診斷的準確率。關(guān)于miR-93 在血清、卵巢癌細胞系中與卵巢癌組織中表達水平的差異，課題組將在今后研究中繼續(xù)探討。

miRNA 在細胞生長、分化過程中發(fā)揮著重要作用，對多種癌細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重要影響[27]。血清中miRNA 具有穩(wěn)定性、耐受核酸酶活性以及易檢測等優(yōu)點，可以作為腫瘤的非侵入性的生物學標志物。檢測血液中表達明顯的miRNA 作為惡性腫瘤診斷手段已應(yīng)用于臨床。然而，迄今為止在臨床上還沒有miRNA 或miRNA 組被用作卵巢癌的生物標記。本研究通過ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-29c、miR-93與CA125的結(jié)合在診斷OvCa方面比CA125更為靈敏和準確，敏感性為89%。以上結(jié)果表明，miR-29c、miR-93 和CA125 的組合可能對卵巢癌的診斷具有潛在臨床意義。

綜上所述，miR-29c、miR-93 可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，miR-29c、miR-93 和CA125 的組合提高卵巢癌診斷的靈敏度和特異度，可能對卵巢癌的診斷具有潛在臨床意義。miR-29c、miR-93 或許可以作為預測卵巢癌的生物學標志物。本研究的不足之處在于樣本量不足，在后續(xù)研究中，課題組將繼續(xù)擴大樣本量，進一步證實該研究的可靠性，并檢測miR-29c、miR-93在卵巢癌血清和癌灶組織中的表達情況，通過體外實驗探究miR-29c、miR-93參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機制。