那如三味片防治類風濕性關(guān)節(jié)炎的有效成分預測與靶點通路分析

杜曉鸝，金義輝，朱彥，蘇佳，李剛*

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；2.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；3.內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010013）

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一類以慢性關(guān)節(jié)滑膜炎和骨損傷為主要特點的慢性炎癥性自體免疫病變，可導致嚴重殘疾[1]。其一般侵害周圍重要關(guān)節(jié)，并造成重要關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞、畸形和功能損害。主要特征表現(xiàn)為手、腳小關(guān)節(jié)的發(fā)炎，并往往伴隨著重要人體關(guān)節(jié)外器官損傷或血清類風濕因子陽性，同時也可伴隨體質(zhì)量的驟降、低熱量和疲倦感等身體表現(xiàn)。更多的證據(jù)指出，RA患者會面臨更多的并發(fā)癥的風險，包括感染、惡性腫瘤和急性冠狀動脈綜合征[2～4]。目前還不完全了解這種疾病發(fā)生的機制。有研究提出，不同的環(huán)境因素，如吸煙、職業(yè)和大氣因素可觸發(fā)刺激易感個體基因的RA 的發(fā)展，導致滑膜增生和骨骼破壞。RA 的最初發(fā)病階段與先天和適應性免疫的變化密切相關(guān)，隨后形成了自身抗體，主要針對不同分子，也包括經(jīng)過修改后的自我表位。在發(fā)病的以下階段，先天的（如樹突狀細胞、巨噬細胞和中性粒細胞）和適應性免疫細胞（如B 淋巴細胞和T 淋巴細胞）都有助于慢性炎癥狀態(tài)的擴增和持續(xù)。對RA發(fā)病機理中的重要細胞結(jié)構(gòu)、介質(zhì)和機制的認識，為開發(fā)新型精確的疾病修飾抗風濕藥物提供了基礎(chǔ)[5]。

目前治療類風濕性關(guān)節(jié)炎藥物主要包括疾病修飾劑（DMARDs），如磺胺嘧啶和甲氨蝶呤，以及最近使用的“生物制劑”，如抗TNF-α 藥物[6]?，F(xiàn)階段人們廣泛采用中西醫(yī)結(jié)合方式來治療和控制類風濕性關(guān)節(jié)炎的進展。那如三味（NRSW）片是中國傳統(tǒng)蒙藥，具消“黏”、除“協(xié)日烏素”、祛風、鎮(zhèn)痛、散寒功效。其主要適用于風濕、關(guān)節(jié)酸痛、腰腿冷疼、牙痛、白喉等病癥。其由制草烏、蓽茇、制訶子組成，該三味藥均為中、蒙醫(yī)使用的傳統(tǒng)植物藥。方中草烏殺黏、止痛、燥黃水為主；訶子調(diào)理體素為輔；蓽茇補胃火、祛巴達干赫依為之佐使。三藥聯(lián)用，對寒性黃水病、皮膚蟲病、白喉、炭疽等“黏”病均有功效[7，8]。然而，由于蒙藥基礎(chǔ)研究的起步相對較晚，對其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機理仍缺乏深入的研究[9]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學為新型科學，融合并運用了網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)生理學、多向藥理學、計算生理學、網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析方法等多學科專業(yè)的研究手段與教學內(nèi)容，以實現(xiàn)立體化網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的建構(gòu)，從系統(tǒng)整合的視角去探討醫(yī)藥與病理之間的聯(lián)系，其整體性、系統(tǒng)性的特點，與傳統(tǒng)中醫(yī)藥對處理疾病的總體觀點和辨證論治基本原則相吻合。

1 資料與方法

1.1 那如三味片的化學成分數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

利用TCMSP（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php），Version 2.0[10]并結(jié)合BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/ index. php/）[11]數(shù)據(jù)庫，搜集“草烏”“蓽茇”“訶子”主要化學成分。

1.2 活性物質(zhì)篩選

本課題以口服給藥的生物利用度（oral bioavailability，OB）閾值OB≥30%和類藥性（druglikeness，DL）閾值DL≥0.18 為主要活性物質(zhì)的檢測要求[12]，將TCMSP 中有較高活性的物質(zhì)加以檢測，增加數(shù)據(jù)分析處理的價值。BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫中通過設(shè)置Score cutoff to 20 及Adjusted P_value cutoff to 0.05相關(guān)參數(shù)進行活性化合物的篩選提取。

1.3 活性成分-作用靶點數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

利用TCMSP檢索活性成分靶點，整理收集到靶點導入Uniprot（https://www.uniprot.org/uniprot/）以及Inparanoid8（http://inparanoid.sbc.su.se/cgi-bin/index.cgi）數(shù)據(jù)庫，將所有靶基因名稱校正為其官方名稱，剔除沒有靶點的活性成分。

1.4 類風濕性關(guān)節(jié)炎疾病數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

在PALM-IST 數(shù)據(jù)庫（http://www.hpppi.iicb.res.in/ctm/palmist_server.html）和COREMINE 數(shù)據(jù)庫（https://www.coremine.com/medical/）中搜索關(guān)鍵詞“rheumatoid arthritis”收集疾病相關(guān)靶點，整理后建立類風濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點數(shù)據(jù)集。利用活性成分靶點與類風濕性關(guān)節(jié)炎靶點之間的匹配，得到那如三味片治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的潛在靶點，從而構(gòu)建潛在靶點數(shù)據(jù)集。

1.5 那如三味片治療類風濕性關(guān)節(jié)炎網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用IPA（ingenuity pathway analysis）應用程序，通過輸入那如三味片活性成分的靶點建立藥物和疾病互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 疾病、功能和通路分析

通過IPA 技術(shù)對那如三味片治療類風濕性關(guān)節(jié)炎潛在靶點進行核心分析，以獲取與其相關(guān)疾病、功能和通路等的有關(guān)信息，分析預測那如三味片治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的可能作用機制。

1.7 分子對接驗證

從小分子數(shù)據(jù)庫zink（https://zinc.docking.org/）下載小分子文件，從RCSB PDB（https://www.rcsb.org）下載大分子蛋白，通過Autodock 軟件對小分子和蛋白進行處理、對接，計算結(jié)合能。

2 結(jié)果

2.1 那如三味片活性化合物篩選

通過TCMSP 和BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫共收集到那如三味片化合物172 種，其中草烏含27 種、蓽茇含104種、訶子含41種。以O(shè)B≥30%、DL≥0.18及Score cutoff to 20、Adjusted P_value cutoff to 0.05 作為篩選條件，篩選出生物活性物質(zhì)共33 種，其中草烏含10種、蓽茇含15種、訶子含8種。

2.2 那如三味片活性化合物-作用靶點數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

應用TCMSP 和BATMAN-TCM 分析平臺，得到那如三味片各活性化合物的靶點信息，經(jīng)去重后得到172個靶點。

2.3 疾病數(shù)據(jù)庫構(gòu)建

在PALM-IST 和COREMINE 數(shù)據(jù)庫搜索關(guān)鍵詞“rheumatoid arthritis”，共獲取6 450個類風濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點。將那如三味片活性成分靶點和類風濕性關(guān)節(jié)炎靶點匹配后，得到124 個那如三味片治療類風濕性關(guān)節(jié)炎潛在靶點。

2.4 那如三味片治療類風濕性關(guān)節(jié)炎網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將那如三味片活性成分靶點通過IPA應用程序錄入數(shù)據(jù)庫，建立“New My Pathway”，通過“Diseases and Functions”搜索“Rheumatoid arthritis”將其加入同一個“New My Pathway”，利用“Tool-Path Explorer”功能分別構(gòu)建那如三味片及草烏、訶子、蓽茇治療類風濕性關(guān)節(jié)炎網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖1、圖2（A、B、C）。通過IPA 網(wǎng)絡(luò)分析預測出47 個那如三味片治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的作用靶點，主要包括細胞/增長因子：CXCL8、TNF、TNFSF11、IL6、IL10、IL1B、VEGFA；G蛋白偶聯(lián)受體：ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、ADRB2、OPRD1、DRD2、OPRM1、HTR2A、ICAM1；轉(zhuǎn)運體：SLC6A2、SLC6A3、SLC6A4、ABCB1；代謝酶：MAOA、MAOB、CYP1A2、CYP2B6、DPAGT1、PTGS2、CA2、ACLY、PTGS1、XIAP、ACHE；離子通道：KCNJ15、GABRA1；激酶：LRRK2、CCNB1；核受體：PGR；肽酶：MMP9、MMP2、IGHG1、F10、CASP3；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)：NFKBIA、NCOA2、FOS、TP53 等。那如三味片各成分中，發(fā)揮治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的有效成分主要有草烏中的脫氧烏頭堿（Deoxyaconitine）、烏頭堿（Aconitine）、中烏頭堿（Mesaconitine）、次烏頭堿（Hypaconitine）、惰堿（Ignavine）等；蓽茇中的蓽茇壬三烯哌啶（Dehydropipernonaline）、胡椒堿（Piperine）、蓽茇明寧堿（Piperlonguminine）等；訶子中的碎葉紫堇堿（Cheilanthifoline）、霹靂蘿芙辛堿（Peraksine）等。由表1 可知，那如三味片中不同活性成分可作用于相同的靶點，也可作用于不同的靶點，體現(xiàn)其多成分、多靶點的協(xié)同作用。其中草烏活性成分主要作用靶點為多巴胺轉(zhuǎn)運體（SLC6A3、SLC6A2、SLC6A4），它們是哺乳動物SLC6（溶質(zhì)載體6）家族中的成員，所有SLC6 轉(zhuǎn)運體均為Na+/Cl-依賴的質(zhì)膜轉(zhuǎn)運體，根據(jù)SLC6 轉(zhuǎn)運體進化關(guān)系可以進一步劃分為4 個亞科，單胺轉(zhuǎn)運體即去甲腎上腺素的轉(zhuǎn)運體（SLC6A2）、多巴胺（SLC6A3）、血清素即5-羥色胺（血管收縮素）（SLC6A4），此3種同屬于一個亞科[13]。

圖1 那如三味片治療類風濕性關(guān)節(jié)炎網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 藥物中各成分治療類風濕性關(guān)節(jié)炎網(wǎng)絡(luò)圖A.草烏治療RA網(wǎng)絡(luò)圖；B.訶子治療RA網(wǎng)絡(luò)圖；C.蓽茇治療RA網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 疾病、功能及通路分析

那如三味片活性成分靶點和類風濕性關(guān)節(jié)炎靶點匹配后，得到124 個那如三味片治療類風濕性關(guān)節(jié)炎潛在靶點。通過IPA 可以對這些潛在靶點進行核心解析，得到這些生物分子所涉及的主要疾病包括神經(jīng)性疾病、組織損傷和畸形、心理障礙、炎癥疾病、免疫調(diào)節(jié)失常等（見圖3）。主要通路包括5-羥色胺受體信號、G蛋白偶聯(lián)受體信號、磷酸腺苷活化蛋白激酶信號等（見圖4）。這提示了類風濕性關(guān)節(jié)炎病情的發(fā)生發(fā)展進程與5-羥色胺受體的結(jié)合活性、炎癥、免疫調(diào)節(jié)等密切相關(guān)。其中ADRB2、ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、MAOA、PTGS1、PTGS2、SLC6A3、SLC6A2、SLC6A4、IL6、IL10、IL1B、TNF 等基因在類風濕性關(guān)節(jié)炎疾病發(fā)生發(fā)展中可能有重大影響，如參與腺苷酸環(huán)化酶抑制的G 蛋白偶聯(lián)受體信號通路、腺苷酸環(huán)化酶抑制5-羥色胺受體信號通路、骨重塑、5-羥色胺受體代謝等生物過程，各通路對應的作用靶點見表2。

表2 各通路權(quán)重及對應作用靶點

圖4 生物分子蛋白通路排序

2.6 那如三味片對類風濕性關(guān)節(jié)炎作用靶點分子對接結(jié)果分析

分子對接展示圖（見圖2）展示了配體與蛋白分子間的相互作用。分子對接結(jié)果（見表3、圖5）顯示那如三味片與多個靶點形成氫鍵作用，結(jié)合能≤-1.2 Kcal/mol，構(gòu)象能量低，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有較好活性。

表3 碎葉紫堇堿(Cheilanthifoline)、玫瑰樹堿（Ellipticine）胡椒堿(Piperine)與ADRB2、PTGS2、SLC6A4的分子對接

圖5 那如三味片對類風濕性關(guān)節(jié)炎作用靶點分子對接展示圖

3 討論

類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一類慢性炎癥病變，滑膜炎為其主要的病變特點。白細胞浸潤和滑膜細菌的活化，導致了軟骨和骨的損傷。而日益增多的研究資料也證實了致炎細胞因子造成的發(fā)炎、細菌繁殖和激活在RA 的發(fā)生機理上起到了關(guān)鍵性作用。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法分析探討了蒙藥那如三味片治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的主要活性成分、作用靶點及通路。這些作用靶點主要包括單胺氧化酶A基因（MAOA）、腎上腺素能受體基因（ADRA1D、ADRA2B）、多巴胺轉(zhuǎn)運體基因（SLC6A3、SLC6A2、SLC6A4）、細胞/增長因子（IL6、IL10、TNF）等；通路主要包括5-羥色胺受體信號、G 蛋白偶聯(lián)受體信號、磷酸腺苷活化蛋白激酶信號等。

血清素（5-羥色胺）是一種神經(jīng)遞質(zhì)，在腦內(nèi)平衡中起著重要作用。最新的研究表明，血液中的5-羥色胺是成骨細胞生成的調(diào)節(jié)因子，可以抑制骨形成[14]。因此，測量血清中5-羥色胺水平對診斷RA具有一定的臨床意義。本文對那如三味片治療類風濕性關(guān)節(jié)炎進行系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學分析得出主要通路包括5-羥色胺受體信號，在文獻中得到證實。

G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）是一種跨膜受體蛋白，是膜蛋白中最大的家族，有人類基因組中的800多個基因編碼。GPCRs 包含7 個跨膜螺旋束，為配體提供結(jié)合位點[15]。GPCRs中含有許多特異性免疫受體，如β2-腎上腺素能受體（β2-AR）、前列腺素E2（PGE2）受體、趨化因子受體、腺苷受體等。這些受體通過介導細胞外刺激（包括光、蛋白質(zhì)、肽、小分子、激素、質(zhì)子和離子）的信號轉(zhuǎn)導，積極參與細胞的病理和生理過程[16]。GPCRs信號通路在炎癥和免疫反應過程中發(fā)揮重要作用，包括類風濕性關(guān)節(jié)炎[17]。本文經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學分析得出那如三味片治療類風濕性關(guān)節(jié)炎主要通路包括G 蛋白偶聯(lián)受體信號，與文獻中的報道一致[14]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學分析結(jié)論提示草烏的主要活性成分脫氧烏頭堿（Deoxyaconitine）、烏頭堿（Aconitine）、中烏頭堿（Mesaconitine）、次烏頭堿（Hypaconitine）、惰堿（Ignavine）、北烏頭堿（Beiwutine）、異烏頭堿（Isoaconitine）和紫草烏堿（Delavaconitine）主要參與了5-羥色胺受體信號通路（HTR1B、HTR3A、SLC6A4、MAOA）和多巴胺受體信號通路（SLC6A3、MAOA）。SLC 類可溶性載體成為細菌膜上的主要信號傳導者，是藥物進出細胞的關(guān)鍵，在體內(nèi)藥物的處置過程、有效性以及不良反應等方面起至關(guān)重要的作用[18]。治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的藥物多為轉(zhuǎn)運體底物，如柳氮磺胺吡啶和甲氨蝶呤等。了解類風濕關(guān)節(jié)炎下轉(zhuǎn)運體的變化對于藥代學、藥效學研究和指導臨床用藥至關(guān)重要[19]。值得注意的是，草烏對腎臟的毒性主要通過SCN10A和SCN5A離子通道作用于3 個G 蛋白偶聯(lián)受體靶點（ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C），對心臟毒性主要作用于HSP90AB1 靶點。這些靶點全部來自于草烏中的惰堿（Ignavine）。草烏成分相當復雜。研究已證實其有毒成分主要依賴雙脂型烏頭酸的水解及分解程度，動物試驗證實生草烏水煎劑在約2 h 時毒害程度最高，約4 h 時毒害程度則明顯降低。動物中毒試驗研究亦表明，生草烏潛在具有人體心血管循環(huán)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)、神經(jīng)、腎、胚胎、生殖毒性作用等，因此妊娠期應禁用。烏頭堿中毒目前還缺乏特效的解毒品，防治的關(guān)鍵是適時、合理地糾正慢性心律失常，保持生命體征穩(wěn)定，并同時給予洗胃、靜脈注射補液等處理措施。本文采用了網(wǎng)絡(luò)藥理學、分子對接的分析方法，得出了草烏腎毒與心臟中毒反應有關(guān)的主要活性成份和靶點，為進一步確定其中毒反應的化學物質(zhì)基礎(chǔ)、中毒反應機理，以及與炮制藥劑配伍的經(jīng)濟增效減脂機理，提供了依據(jù)[20]。惰堿是否對腎臟和心臟產(chǎn)生毒性及如何在炮制、提取等工藝中對草烏進行減毒、去毒從而使那如三味片更加有效、安全地發(fā)揮治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的作用，有待后續(xù)進一步研究。綜上所述，那如三味片網(wǎng)絡(luò)藥理學研發(fā)平臺的形成，不但對明確該蒙藥治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制及臨床作用特點、指導臨床定位和合理用藥具有重要意義，而且也為建立質(zhì)控指標體系、設(shè)計與優(yōu)化蒙藥產(chǎn)品制備工藝流程等提供了依據(jù)。