代謝組學(xué)在原發(fā)性膽汁性膽管炎中的研究進(jìn)展

步金洋?喻曉?繆虹雨?潘潔露?張海燕?邢練軍

【摘要】 原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）是一種病因與發(fā)病機制尚未明確的疾病。近幾年，通過研究PBC患者代謝物質(zhì)的改變來尋找其潛在的發(fā)病機制和治療靶點已成為熱門。代謝組學(xué)通過質(zhì)譜分析和核磁共振技術(shù)對PBC患者的代謝譜進(jìn)行全面的分析，可以為PBC的診斷和治療提供幫助。該文綜述了近年來代謝組學(xué)在PBC中的研究進(jìn)展，以期為PBC的臨床診斷和治療提供新的思路。

【關(guān)鍵詞】 原發(fā)性膽汁性膽管炎；代謝組學(xué)；發(fā)病機制；治療靶點

Research progress on metabonomics in primary biliary cholangitis Bu Jinyang， Yu Xiao， Miao Hongyu， Pan Jielu， Zhang Haiyan， Xing Lianjun. The Second Department of Digestive， Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200032， China

Corresponding author， Xing Lianjun， E-mail： xingdoctor@126.com

【Abstract】 Primary biliary cholangitis （PBC） is a disease with unclear etiology and pathogenesis. In recent years， it has become a hot topic to identify the potential pathogenesis and therapeutic targets of PBC by studying the changes of metabolic substances in PBC patients. Metabonomics are employed to comprehensively analyze the metabolic spectrum of PBC patients through mass spectrometry and nuclear magnetic resonance technology， providing assistance for the diagnosis and treatment of PBC. In this article， recent research progress upon metabonomics in PBC was reviewed， aiming to provide new ideas for clinical diagnosis and treatment of PBC.

【Key words】 Primary biliary cholangitis； Metabonomics； Pathogenesis；Therapeutic targets

原發(fā)性膽汁性膽管炎（PBC）是一種以非化膿性破壞性小膽管炎為病理特征的慢性自身免疫性疾病。臨床表現(xiàn)以乏力和皮膚瘙癢最為常見，中老年女性為主要患病人群。熊去氧膽酸（UDCA）是治療該病的首選藥物，但對UDCA應(yīng)答不佳尤其是已出現(xiàn)肝硬化失代償期的患者，仍缺乏安全有效的二線治療藥物。PBC的病因及發(fā)病機制尚未明確，主要認(rèn)為與遺傳和（或）環(huán)境所致的免疫紊亂有關(guān)。目前研究PBC主要的方向和難點是探索觸發(fā)肝內(nèi)膽管上皮的免疫應(yīng)答機制和新的治療靶點［1］。代謝組學(xué)通過檢測刺激前后代謝物的動態(tài)變化來反映機體生理和病理狀態(tài)的代謝改變，有利于對疾病的發(fā)病機制進(jìn)行整體動態(tài)分析，從而找到新的診斷標(biāo)志物和藥物靶點。肝臟作為機體重要的代謝器官，承擔(dān)了大部分物質(zhì)的合成、分解和轉(zhuǎn)化過程，應(yīng)用代謝組學(xué)研究肝臟疾病具有一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，本文就近年來代謝組學(xué)在PBC中的研究進(jìn)行綜述，為其診斷與治療提供新的研究方向。

一、代謝組學(xué)概述

代謝組學(xué)是對生物細(xì)胞、組織和體液中相對分子質(zhì)量小于1 500的小分子代謝物的分析，可作為發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的工具。與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相比，其具有操作相對簡單，檢測物相對較少的優(yōu)點。根據(jù)研究策略，代謝組學(xué)分為非靶向代謝組學(xué)和靶向代謝組學(xué)。非靶向代謝組學(xué)可測量得到更全面的代謝物，用于發(fā)現(xiàn)與研究背景相關(guān)的新代謝標(biāo)志物。靶向代謝組學(xué)是對特定代謝物進(jìn)行量化，靈敏度更高。代謝組學(xué)主要獲取數(shù)據(jù)的方法是核磁共振（NMR）和質(zhì)譜學(xué)（MS）系統(tǒng)［包括液相色譜（LC）-MS、氣相色譜（GC）-MS、超高效液相色譜（UHPLC）-MS等］［2］。

二、代謝組學(xué)在PBC中的應(yīng)用

目前發(fā)現(xiàn)與PBC相關(guān)的代謝標(biāo)志物主要涉及膽汁酸代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝和葡萄糖代謝。主要的研究樣本包括血液、尿液和糞便，其中尿液和糞便樣本中因含有較多的細(xì)菌、真菌等微生物，故多與微生物組學(xué)聯(lián)合研究。

1.血液和組織樣本

1.1膽汁酸代謝

膽汁酸的合成、轉(zhuǎn)運和代謝失調(diào)是幾乎所有人類肝病的常見病因，不同病因的慢性肝病患者中膽汁酸譜的組成也是不同的［3］。Walker等［4］通過通路富集分析發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)性硬化性膽管炎（PSC）和PBC有關(guān)的代謝物主要集中在膽汁酸的生物合成通路上。Lian等（2015年）采用UHPLC-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)膽汁酸代謝紊亂的途徑可導(dǎo)致自身免疫性肝?。ˋILD）。Chen等［5］采用UHPLC-MS進(jìn)行血清代謝物分析發(fā)現(xiàn)，單純PBC組血清中總膽汁酸譜（BAs）［膽酸、?；悄懰?、甘膽酸、鵝去氧膽酸（CDCA）、牛磺鵝去氧膽酸和甘鵝脫氧膽酸］明顯高于健康對照組，而總次級膽汁酸譜［脫氧膽酸、?；撬崦撗跄懰幔═DCA）、甘氨酸脫氧膽酸（GDCA）、石膽酸和?；撬崮懯幔菟急壤^低。Yang等（2016年）發(fā)現(xiàn)BAs通過調(diào)節(jié)腸道微生物組和特定分子的動態(tài)平衡，高度參與PBC的發(fā)生、發(fā)展，并在誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞方面發(fā)揮重要作用。這提示調(diào)節(jié)BAs的變化有可能作為一種新的治療方法來對抗、甚至逆轉(zhuǎn)PBC的不可逆性肝硬化。

膽酸和CDCA是人體肝臟中合成的主要初級膽汁酸，經(jīng)過酶修飾成為次級膽汁酸。CDCA和膽酸在腸中經(jīng)過脫羥基，形成的石膽酸和脫氧膽酸具有誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌變、調(diào)節(jié)宿主代謝和免疫反應(yīng)的作用。石膽酸是一羥膽酸，疏水性強，較其他膽酸毒性較強，可被用作誘發(fā)小鼠肝內(nèi)膽汁淤積的誘導(dǎo)劑。脫氧膽酸和石膽酸及其衍生物是循環(huán)膽汁酸池的主要成分，該池的大小和組成是治療PBC和非酒精性脂肪肝的靶點［6］。

GSK2330672是回腸膽汁酸轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑，可以阻斷膽汁酸的腸肝循環(huán)，從而緩解膽汁淤積。2017年一項關(guān)于GSK2330672治療PBC的Ⅱ期臨床實驗，證明了其可以降低PBC患者的瘙癢嚴(yán)重程度，且可使血清總膽汁酸下降50%，有望成為治療PBC的潛在藥物。

由此可見，對膽汁酸的代謝圖譜和代謝通路的深入探索仍是未來研究PBC診斷和治療的熱點方向。

1.2脂質(zhì)代謝

Lian等（2015年）研究發(fā)現(xiàn)，PBC患者有明顯的脂質(zhì)代謝紊亂，其中血清游離脂肪酸、磷脂酰膽堿、溶血卵磷脂和鞘磷脂水平明顯較正常人和自身免疫性肝炎（AIH）患者降低。Li等［7］建立的4種膽汁淤積小鼠模型中均觀察到神經(jīng)酰胺和乙酰肉堿的蓄積。神經(jīng)酰胺是脂毒性的關(guān)鍵分子，通過增加線粒體外膜通透性，減少線粒體呼吸，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［8］。Walker等［4］用GC-MS分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)5-脂氧合酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能與PSC和PBC的發(fā)病機制有關(guān)。5-脂氧合酶可以通過兩種方式調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡，一種是炎癥，另一種是脂質(zhì)過氧化。其主要通過刺激白三烯代謝產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和二十碳五烯酸的抗炎代謝物來調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)。

1.3氨基酸和葡萄糖代謝

Vignoli等［9］發(fā)現(xiàn)，PBC患者血清代謝譜中丙酮酸、檸檬酸、谷氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和乳酸水平較健康人升高。丙酮酸是碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪代謝的中間代謝物，由丙酮酸脫氫酶（PDC-E2）調(diào)節(jié)。嚴(yán)重的肝臟氧化損傷會導(dǎo)致抗線粒體抗體（AMA）的產(chǎn)生。AMA可以識別PDC-E2亞基的硫辛酰結(jié)構(gòu)域，但E2亞基可以被化學(xué)修飾并引發(fā)耐受性破壞，這有助于對PBC發(fā)病機制的研究。Bell等（2015年）發(fā)現(xiàn)，PBC患者色氨酸衍生的代謝物犬尿氨酸升高，脂加氧酶衍生的類花生酸12-HETE降低。大部分色氨酸在肝臟中被色氨酸雙加氧酶降解，但小部分也可被促炎細(xì)胞因子刺激的高度誘導(dǎo)酶吲哚胺 2，3-雙加氧酶代謝，這與PBC的炎癥特征有關(guān)。Hao等（2017年）發(fā)現(xiàn)PBC患者代謝途徑的改變與葡萄糖、脂肪酸和氨基酸代謝產(chǎn)物有關(guān)，并根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)設(shè)計了一個包含4種代謝物（4-羥基脯氨酸、3-羥基異戊酸、檸康酸和丙酮酸）的診斷模型，可以有效地鑒別 PBC、AIH 和乙型肝炎病毒引起的肝硬化（HBC）。馬振華［10］采用UHPLC-MS技術(shù)對54例PBC患者、26例AIH患者和39例健康對照者的血清樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PBC與AIH患者在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成上存在差異代謝物質(zhì)。這為PBC的鑒別診斷提供了研究方向。

以上研究表明，PBC涉及多種物質(zhì)的代謝改變，進(jìn)一步研究相關(guān)代謝物的代謝通路對研究PBC的發(fā)病機制、診斷、鑒別診斷和治療具有重要意義。

2.尿液樣本

相比于血清樣本代謝組學(xué)，尿液樣本代謝組學(xué)具有樣本收集簡便、無創(chuàng)等優(yōu)點。錢婷婷等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在肝損傷代謝組學(xué)模型研究中，以尿液為樣本的代謝組學(xué)療效評價靈敏度明顯高于血清學(xué)檢測。

PBC是遺傳易感性和環(huán)境因素相互作用引起的多因素疾病，細(xì)菌感染是PBC的主要環(huán)境因素。日本的一項流行病學(xué)研究表明，兒童時期環(huán)境衛(wèi)生差可能是日本PBC發(fā)展的危險因素［12］。且已有多項研究表明尿路感染（UTI）與PBC的發(fā)生密切相關(guān)，在大多數(shù)UTI患者中，大腸桿菌是主要的病原體。Yang等［13］發(fā)現(xiàn)大腸桿菌會引發(fā)針對大腸桿菌丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的特異性抗體，從而導(dǎo)致決定因子擴散和針對人丙酮酸脫氫酶復(fù)合物的經(jīng)典自身抗體，并認(rèn)為這是導(dǎo)致PBC發(fā)展的第一步。此外，中老年女性是PBC的主要患病人群，此類人群也更易發(fā)生尿路感染。對單純UTI患者與PBC合并UTI患者的尿液差異代謝物分析，也將有利于PBC尿液代謝組學(xué)的研究。

除細(xì)菌等微生物外，人體尿液還含有許多可溶性元素。有研究發(fā)現(xiàn)，PBC患者尿液中葫蘆巴堿和馬尿酸水平低于健康人［9］。馬尿酸是最豐富的微生物-宿主共代謝產(chǎn)物之一，由甘氨酸和微生物苯甲酸酯在肝臟和腎臟中通過第2階段解毒結(jié)合產(chǎn)生，高濃度尿液馬尿酸鹽是代謝健康的一般標(biāo)志［14］。Lv等（2016年）發(fā)現(xiàn)PBC患者的尿液代謝物中，與L-色氨酸代謝途徑相關(guān)的代謝物發(fā)生了明顯變化，且GDCA和甘鵝脫氧膽酸濃度增加。已有研究表明，部分細(xì)菌可以將色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚和吲哚衍生物，包括吲哚乙醇、吲哚丙烯酸、吲哚乙酸等。Schirmer等（2016年）發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)將色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚乙醇的細(xì)菌基因與IFN-γ的產(chǎn)生之間存在負(fù)相關(guān)性，這表明吲哚乙醇具有抗炎特性。Wlodarska等（2017年）發(fā)現(xiàn)吲哚丙烯酸可通過激活NRF2-ARE途徑促進(jìn)小鼠的抗氧化和抗炎免疫應(yīng)答。Krishnan等（2018年）發(fā)現(xiàn)吲哚乙酸可以減弱小鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)中的促炎細(xì)胞因子反應(yīng)。這些研究表明色氨酸分解代謝物可能通過影響人體的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而影響PBC的發(fā)生和發(fā)展。針對PBC的治療也可從細(xì)菌與色氨酸代謝的相互作用入手?，F(xiàn)有對PBC尿液代謝組學(xué)的研究主要集中在丙酮酸和氨基酸的代謝方面。迄今為止，已在尿液中檢測到超過2 600種化合物，相比于其他代謝組學(xué)涉及的化合物相對較少。我們?nèi)孕鑼BC患者尿液中其他物質(zhì)，尤其是細(xì)菌代謝物的更多樣本的研究。

3.糞便樣本

糞便樣本的代謝組學(xué)的研究主要是針對糞便中的腸道微生物菌群代謝物的研究。已有研究表明，重建、優(yōu)化腸道微生態(tài)，抑制、阻斷微生態(tài)失衡，在防治非酒精性脂肪性肝病方面有重大意義［15］。這同樣適用于PBC的防治。最新研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物代謝物，如膽汁酸和色氨酸代謝物，影響宿主代謝和免疫系統(tǒng)，這可能間接影響肝臟損傷和再生［16］。

3.1膽汁酸代謝

與血清膽汁酸譜相似，未經(jīng)治療的PBC患者糞便中也發(fā)現(xiàn)了總的初級膽汁酸譜升高和總的次級膽汁酸譜降低［5］。腸道微生物群依賴性次級膽汁酸的產(chǎn)生可以通過膽汁酸受體TGR5依賴性調(diào)節(jié)膽汁酸以及T3和腸胰高血糖素樣肽-1的產(chǎn)生來減少炎癥反應(yīng)并促進(jìn)肝臟再生［17］。2013年一項體內(nèi)實驗證明了腸道微生物群會導(dǎo)致膽汁酸池的疏水性增加，這可能導(dǎo)致膽汁淤積性肝損傷。

3.2短鏈脂肪酸（SCFA）代謝

Lammert等［18］用16S rRNA測序和核磁共振波譜，對23例PBC患者進(jìn)行橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，進(jìn)展期肝纖維化患者糞便中乙酸鹽和SCFA含量較高。SCFA是未消化的膳食纖維經(jīng)腸道微生物發(fā)酵而成。SCFA可以激活宿主G蛋白偶聯(lián)受體41/43，有助于腸道屏障保護、代謝穩(wěn)態(tài)和免疫調(diào)節(jié)，減輕肝臟損傷，促進(jìn)肝臟再生［17］。其中，丁酸鹽具有潛在的免疫調(diào)節(jié)特性，通過調(diào)節(jié)Treg/Th17增強腸屏障功能，緩解肝臟炎癥并降低轉(zhuǎn)氨酶水平［19］。然而，Singh等（2018年）在另一項體外實驗中發(fā)現(xiàn)，在次級膽汁酸存在的情況下，丁酸鹽可誘導(dǎo)肝細(xì)胞死亡。因此，SCFA在PBC中的作用還有待進(jìn)一步研究。

3.3其他代謝物

HLA易感基因是PBC的主要遺傳危險因素。具有5個HLA DRB1高危等位基因（FHRAC）陽性患者的微生物群落豐度明顯低于FHRAC陰性患者［21］。在FHRAC陽性患者中，毛螺菌屬明顯減少，其可能通過影響糖胺聚糖代謝來影響PBC患者的肝功能［21］。

對于PBC患者糞便樣本的研究主要停留在微生物組學(xué)層面，相關(guān)的腸道菌群變化，使得保護性代謝物水平降低和破壞性代謝物水平升高。

三、總結(jié)與展望

目前對PBC代謝組學(xué)的研究，集中在膽汁酸代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、葡萄糖代謝和細(xì)菌代謝產(chǎn)物上。不足之處是，尿液和糞便樣本雖更容易獲得，但它們的微生物區(qū)系不能完全反映黏膜微生物區(qū)系的概況。且目前研究得到的結(jié)果可能會受環(huán)境和飲食等混雜因素的影響，對于女性來說，陰道菌群的影響也不可忽視。此外，我們還缺少關(guān)于尿液和糞便樣本中共生病毒或真菌群落的分析，他們對肝臟的影響還屬于未知。因此，我們需要更多的樣本來建立更全面的PBC代謝物數(shù)據(jù)庫。研究如何將差異代謝物作為一種新的診斷性生物標(biāo)志物和治療靶點應(yīng)用于PBC的預(yù)防、診斷和療效評估也是一個重要的挑戰(zhàn)。

總之，代謝組學(xué)采用質(zhì)譜分析或核磁共振技術(shù)研究，對PBC患者體液樣品的小分子內(nèi)源性代謝物及變化趨勢進(jìn)行分析，能夠清楚地區(qū)分疾病狀況，并尋找疾病進(jìn)展過程中的生物標(biāo)志物和微生物組的靶標(biāo)。將代謝組學(xué)Ⅱ應(yīng)用于PBC具有巨大的研究潛力和發(fā)展優(yōu)勢。

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（收稿日期：2023-01-13）

（本文編輯：楊江瑜）