釀酒酵母篩選及乙醇發(fā)酵條件的優(yōu)化

張玲玲 宋璐 孫京格 孟夢(mèng) 侯麗華

摘要：能源危機(jī)導(dǎo)致人們將視野轉(zhuǎn)移到可再生能源的開發(fā)與利用上，乙醇作為一種不含硫及灰分的清潔燃料，逐漸進(jìn)入人們的視野并被用于替代汽油和柴油。人們對(duì)乙醇生產(chǎn)方式的研究越來(lái)越多，目前生產(chǎn)乙醇的重要手段是通過發(fā)酵技術(shù)，利用酵母對(duì)糧食或纖維類廢棄物進(jìn)行發(fā)酵，將其轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)燃料乙醇。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)鮮有對(duì)釀酒酵母菌株篩選并優(yōu)化發(fā)酵條件的研究，該研究針對(duì)天津科技大學(xué)誘變的編號(hào)為H1～H17的17株釀酒酵母進(jìn)行篩選，并對(duì)篩選出的4株優(yōu)良釀酒酵母進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，獲得最優(yōu)發(fā)酵條件：YPD液體培養(yǎng)基初始還原糖濃度為220 g/L，接菌量為1×108 CFU/mL，不添加葡萄糖和添加6%的乙醇，在此條件下，發(fā)酵結(jié)束后殘留還原糖含量最低，乙醇生成率最高。

關(guān)鍵詞：能源危機(jī)；乙醇；釀酒酵母；正交試驗(yàn)；最優(yōu)發(fā)酵條件

中圖分類號(hào)：TS201.3? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號(hào)：1000-9973（2023）07-0056-05

Abstract： The energy crisis has led people to shift their vision to the development and utilization of renewable energy. As a clean fuel without sulfur or ash， ethanol has gradually entered people's vision and been used to replace gasoline and diesel.There are more and more researches on ethanol production methods. At present， an important way to produce ethanol is to use yeast to ferment and convert grain or fiber wastes into fuel ethanol through fermentation technology. In recent years， there are few studies on screening Saccharomyces cerevisiae strains and optimizing fermentation conditions in China. In this study， 17 strains of Saccharomyces cerevisiae numbered H1～H17 mutagenized by Tianjin University of Science and Technology are screened， and single facter test and orthogonal test are conducted on the four selected excellent Saccharomyces cerevisiae strains. The optimal fermentation conditions are obtained as follows： the initial reducing sugar concentration of YPD liquid medium is 220 g/L， the inoculation amount is 1×108 CFU/mL， without adding glucose and adding 6% ethanol， under these conditions， the residual reducing sugar content is the lowest and the production rate of ethanol is the highest after fermentation.

Key words： energy crisis; ethanol; Saccharomyces cerevisiae; orthogonal test; optimal fermentation conditions

隨著不可再生資源的逐漸枯竭及環(huán)境的日益惡化，資源緊缺和環(huán)境污染問題成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，人們逐漸將視野轉(zhuǎn)移到可再生能源的開發(fā)與利用上，用其取代石油資源。乙醇是一種不含硫及灰分的清潔燃料，它的用途很廣，可用于制造醋酸、飲料、香精、染料、燃料等，也被用于醫(yī)療消毒及國(guó)防工業(yè)、醫(yī)療衛(wèi)生、有機(jī)合成、食品工業(yè)、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域[1]。用乙醇代替汽油、柴油，一方面，可減少原油的使用，節(jié)約資源且降低成本；另一方面，它在燃燒期間抑制顆粒和氮氧化合物以及其他溫室氣體的排放[2-3]，可減少汽車尾氣對(duì)環(huán)境的污染，保護(hù)環(huán)境。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是酒及發(fā)酵食品制作過程中不可或缺的輔料。乙醇生產(chǎn)過程中，在底料中添加釀酒酵母，酵母發(fā)酵利用底物代謝生成產(chǎn)物乙醇，之后將產(chǎn)物脫水并進(jìn)行適當(dāng)處理即可獲得燃料乙醇。目前我國(guó)乙醇生產(chǎn)方式中以纖維素為代表的第2代乙醇發(fā)酵技術(shù)，主要存在秸稈收集處理效率低、預(yù)處理費(fèi)用和纖維素酶成本高等問題[4-5]；以合成氣生物發(fā)酵法生產(chǎn)乙醇的技術(shù)存在生產(chǎn)效率低、氣體底物在液相中的溶解性差、傳質(zhì)性能不佳等問題[6]。因此，我國(guó)乙醇的主要生產(chǎn)方式為以玉米和木薯等糧食為原料的第1代生物發(fā)酵法，其中玉米發(fā)酵法占比為61%[7]。釀酒酵母還含多種生理活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分，將其添加至食品和動(dòng)物飼料中，不僅能提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且具有保健功能，可調(diào)節(jié)腸道菌群，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，提高免疫功能和抗氧化功能，緩解應(yīng)激[8]。此外，釀酒酵母與動(dòng)植物同為真核生物，具有很多相同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并且具有繁殖快、代謝時(shí)間短、易于培養(yǎng)和分離等特點(diǎn)，因此，常用釀酒酵母作為食品科學(xué)研究中的實(shí)驗(yàn)生物[9]。篩選出優(yōu)良的釀酒酵母菌種不僅能提高乙醇的產(chǎn)量和質(zhì)量，提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，而且能緩解能源危機(jī)，減輕環(huán)境污染。因此，對(duì)釀酒酵母進(jìn)行篩選及乙醇發(fā)酵條件的優(yōu)化具有重要的科研意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

菌種：天津科技大學(xué)誘變選育的編號(hào)為H1～H17的17株釀酒酵母。

YPD培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YPD）[10]：1%酵母膏，2%蛋白胨，1.5%瓊脂粉，115 ℃高溫滅菌20 min，添加5%的葡萄糖。

玉米培養(yǎng)基：玉米面經(jīng)糖化后得到葡萄糖濃度為240 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基，添加0.05％的（NH 4） 2HPO 4 和0.05％的KH 2PO 4。

1.2 材料與試劑

玉米面：天津市濱海新區(qū)明耀超市；重鉻酸鉀、酒石酸鉀鈉、3，5-二硝基水楊酸（分析純）：博歐特（天津）化工貿(mào)易有限公司；乳糖（分析純）：天津市奧淇醫(yī)科醫(yī)藥銷售有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

微量離心機(jī)、冷凍大容量離心機(jī)、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美瑞泰克科技有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 檢測(cè)還原糖含量的方法

參考《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)》[11]中的DNS法，分兩步進(jìn)行測(cè)定，測(cè)量?jī)x器為酶標(biāo)儀：繪制還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，分梯度配制葡萄糖溶液，加入DNS試劑，經(jīng)過處理，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；樣品測(cè)定：取合適稀釋濃度的樣品，用同樣的方法處理并進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)第一步繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的還原糖含量。

1.4.2 檢測(cè)乙醇含量的方法

參考文獻(xiàn)[12]，用重鉻酸鉀比色法分兩步進(jìn)行測(cè)定，測(cè)量?jī)x器為酶標(biāo)儀：繪制乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，分梯度配制乙醇溶液，加入重鉻酸鉀溶液，經(jīng)過處理后，在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；樣品測(cè)定：取合適稀釋濃度的樣品用同樣的方法處理并進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)第一步繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的乙醇含量。

1.4.3 檢測(cè)海藻糖含量的方法

參考文獻(xiàn)[13]，用蒽酮-硫酸法分兩步進(jìn)行測(cè)定，測(cè)量?jī)x器為酶標(biāo)儀：繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分梯度配制海藻糖溶液，加入蒽酮-硫酸溶液，經(jīng)過處理后，在630 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；胞內(nèi)海藻糖的提取與測(cè)定：用冰水提取酵母泥的胞內(nèi)海藻糖，加入三氯乙酸，通過振蕩離心的方法提取。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算海藻糖含量。

1.5 分析方法

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次以上，所列的數(shù)據(jù)均是3次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 篩選優(yōu)良釀酒酵母菌株

選取實(shí)驗(yàn)室誘變選育的17株釀酒酵母（編號(hào)為H1～H17）進(jìn)行乙醇發(fā)酵，整個(gè)發(fā)酵過程中，間隔一段時(shí)間檢測(cè)發(fā)酵溶液中剩余還原糖含量，檢測(cè)結(jié)果見圖1，初始還原糖濃度均為240 g/L，在發(fā)酵前25 h內(nèi)，H1～H17菌株對(duì)還原糖的消耗均很快，每隔5 h殘留還原糖的含量大幅銳減；在發(fā)酵25 h后，殘留還原糖的含量遞減速度變緩；在發(fā)酵72 h時(shí)，殘留還原糖的含量基本接近于0，可認(rèn)為72 h為發(fā)酵最長(zhǎng)時(shí)間，設(shè)置72 h為本試驗(yàn)結(jié)束時(shí)間。對(duì)比不同菌株試驗(yàn)結(jié)束后溶液中殘留的還原糖含量，編號(hào)為H1、H3、H6、H7、H17的菌株溶液中含量較少，分別為0.88，0.94，0.94，0.91，0.92 g/dL，可見在實(shí)驗(yàn)室誘變選育的17株釀酒酵母菌株中，上述5株菌株對(duì)還原糖的消耗較多，更能充分利用發(fā)酵醪液中的還原糖。

發(fā)酵結(jié)束時(shí)測(cè)定發(fā)酵醪液中乙醇的含量，測(cè)定結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到72 h時(shí)，即發(fā)酵結(jié)束，編號(hào)為H1、H3、H7、H17菌株的溶液中產(chǎn)物生成量較高，乙醇含量分別達(dá)到9.42，8.50，8.31，9.08 g/dL。

判斷釀酒酵母菌株是否優(yōu)良主要看乙醇發(fā)酵過程中是否能消耗更多還原糖，生成更多乙醇。通過對(duì)17株釀酒酵母發(fā)酵過程中和結(jié)束時(shí)還原糖和乙醇含量的測(cè)定可知，H1、H3、H7、H17這4株為較優(yōu)釀酒酵母菌株，并用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 優(yōu)化發(fā)酵條件

分別改變YPD液體培養(yǎng)基中葡萄糖含量、乙醇含量、初始還原糖濃度、酵母菌接菌量4個(gè)不同的發(fā)酵條件，將篩選出的4株優(yōu)良菌株進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。

2.2.1 葡萄糖含量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

發(fā)酵醪液中初始還原糖濃度為240 g/L，分別在YPD液體培養(yǎng)基中添加葡萄糖（0%、3%、6%、9%），發(fā)酵結(jié)果見圖3。發(fā)酵醪液中殘留的還原糖含量均低于2%，隨著葡萄糖添加量的增加，殘留的還原糖含量也有所增加，而每種菌株中不添加葡萄糖的培養(yǎng)基中還原糖殘留量最少，分別為0.86，0.89，0.82，0.87 g/dL。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定培養(yǎng)基中的乙醇含量發(fā)現(xiàn)，乙醇含量均高于7 g/dL，隨著葡萄糖添加量的增加，乙醇生成量有所降低，每種菌株中不添加葡萄糖的培養(yǎng)基中生成的乙醇含量最多，乙醇含量分別達(dá)到9.55，8.97，8.70，9.17 g/dL。結(jié)果表明，不添加葡萄糖的培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中消耗還原糖最多，生成乙醇含量最高。

2.2.2 乙醇含量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

分別在YPD液體培養(yǎng)基中添加乙醇（0%、3%、6%、9%），結(jié)果見圖4。發(fā)酵醪液中殘留的還原糖含量均低于1.2%，每種菌株乙醇添加量為6%的培養(yǎng)基殘留的還原糖含量最低，分別為0.84，0.85，0.92，0.82 g/dL。所有試驗(yàn)組發(fā)酵結(jié)束后乙醇含量均高于8 g/dL，當(dāng)乙醇添加量在6%以內(nèi)時(shí)，隨著添加量的增加，乙醇生成量也逐漸增加，當(dāng)乙醇添加量為9%時(shí)，乙醇含量有所降低。因此乙醇添加量為6%時(shí)，4種菌株在發(fā)酵過程中消耗更多還原糖，生成更多乙醇。

2.2.3 初始還原糖濃度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

分別改變發(fā)酵醪液中初始還原糖濃度（200，220，240，260，280 g/L），研究初始還原糖濃度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果見圖5。殘留的還原糖含量差別較大，當(dāng)初始還原糖濃度為200，220，240 g/L時(shí)，發(fā)酵過程中消耗的還原糖含量較多，發(fā)酵結(jié)束時(shí)殘留的還原糖含量基本都在1%以下，當(dāng)初始還原糖濃度為260，280 g/L時(shí)，發(fā)酵過程中消耗的還原糖不多，結(jié)束時(shí)殘留的還原糖含量仍較高，分別為1.53，2.15 g/dL，且發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，約在80 h發(fā)酵結(jié)束。乙醇生成量結(jié)果見圖5中b，乙醇生成量均高于8 g/dL，且初始還原糖濃度越高，乙醇的生成量就越多，為了確定最優(yōu)初始還原糖濃度，還需要通過乙醇實(shí)際與理論產(chǎn)率比來(lái)進(jìn)行比較。

由表1可知，當(dāng)初始還原糖濃度低于220 g/L時(shí)，隨著初始還原糖濃度的升高，乙醇實(shí)際與理論產(chǎn)率比有所提高，當(dāng)初始還原糖濃度高于220 g/L時(shí)，乙醇的生成量有所增加，但乙醇實(shí)際與理論產(chǎn)率比逐漸下降，表明對(duì)原料的利用率降低，而且發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，考慮到對(duì)原料的利用率及時(shí)間成本，選擇初始還原糖濃度為220 g/L。

2.2.4 酵母菌接菌量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

分別改變發(fā)酵醪液中的接菌量（1×107，2×107，1×108，2×108 CFU/mL）驗(yàn)證酵母菌接菌量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果見圖6。發(fā)酵醪液中殘留還原糖含量均低于1%，4種菌株中，接菌量為 1×108 CFU/mL的培養(yǎng)基殘留還原糖含量最低，分別為0.82，0.90，0.91，0.86 g/dL，表明發(fā)酵過程中對(duì)還原糖的消耗最多。發(fā)酵結(jié)束時(shí)的乙醇含量見圖6中b，所有試驗(yàn)組乙醇含量均高于8.4 g/dL，而接菌量為1×108 CFU/mL的試驗(yàn)組生成的乙醇量最高，4株菌的乙醇生成量分別達(dá)到9.71，9.31，9.26，9.57 g/dL。比較可知接菌量為1×108 CFU/mL時(shí)，最終殘留還原糖含量最少，乙醇生成量最多，發(fā)酵最徹底。

隨著乙醇發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵醪液中乙醇的濃度越來(lái)越高，發(fā)酵醪液中的滲透壓增加，不利于釀酒酵母的存活，而細(xì)胞內(nèi)的海藻糖能夠有效緩釋溶液中的滲透壓，甚至在惡劣環(huán)境中，能夠調(diào)整細(xì)胞中海藻糖的含量來(lái)抵御外界對(duì)細(xì)胞的傷害。因此，細(xì)胞中海藻糖含量越高，對(duì)活性干酵母的制備越有利。測(cè)定4個(gè)菌種不同接菌量培養(yǎng)基的細(xì)胞內(nèi)海藻糖含量，結(jié)果見圖7。每個(gè)菌種細(xì)胞內(nèi)海藻糖數(shù)量隨著接菌量的增加呈遞增趨勢(shì)，當(dāng)接菌量為 1×108 CFU/mL時(shí)達(dá)到最高峰，之后隨著接菌量的增加又呈下降趨勢(shì)，結(jié)合圖6中接菌量對(duì)發(fā)酵影響的結(jié)果可知，當(dāng)接菌量為 1×108 CFU/mL時(shí)，溶液中殘留還原糖含量最少，乙醇生成量最多，可見海藻糖含量高，細(xì)胞活性強(qiáng)，發(fā)酵產(chǎn)物多。

2.2.5 正交優(yōu)化條件

由上述4個(gè)單因素試驗(yàn)得出每種變量下的最優(yōu)條件，但沒有考慮各個(gè)因素的交互作用，因此按照表2的因素水平表進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，得出發(fā)酵的最優(yōu)條件。

由表3可知，通過極差分析，因素C（初始還原糖濃度）的變化對(duì)乙醇的生成率有較大影響，因素D（接菌量）次之，影響最小的是因素B（YPD中乙醇添加量）。所以各因素的主次順序?yàn)镃＞D＞A＞B，最優(yōu)組合為A 1B 3C 2D 3，即最優(yōu)發(fā)酵條件為YPD液體培養(yǎng)基初始還原糖濃度220 g/L，接菌量1×108 CFU/mL，不添加葡萄糖和添加6%的乙醇。

3 結(jié)論

本研究對(duì)乙醇發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，首先篩選天津科技大學(xué)誘變的編號(hào)為H1～H17的17株釀酒酵母，通過對(duì)發(fā)酵結(jié)束后17株釀酒酵母的培養(yǎng)液中殘留還原糖含量和乙醇含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)編號(hào)為H1、H3、H7、H17 4株釀酒酵母接入的發(fā)酵樣品中最終殘留還原糖量較低，乙醇含量較高。說明這4株釀酒酵母擁有較好的發(fā)酵能力，可以消耗更多底物，生成更多產(chǎn)物。其次對(duì)這4株優(yōu)良釀酒酵母在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，獲得最優(yōu)發(fā)酵條件為YPD液體培養(yǎng)基初始還原糖濃度220 g/L，接菌量1×108 CFU/mL，不添加葡萄糖和添加6%的乙醇，在此條件下，發(fā)酵結(jié)束后殘留還原糖含量最低，乙醇生成率最高。

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