蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種和中華甲蟲蒲螨對冷杉梢斑螟的殺蟲作用1)

王倩倩 遲德富

(東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱,150040)

冷杉梢斑螟(Dioryctriaabietella)隸屬于鱗翅目、螟蛾科,是我國重要的林業(yè)害蟲,嚴(yán)重危害紅松球果[1-2]。目前,受害的紅松人工林面積已達(dá)到黑龍江省已進(jìn)入結(jié)實(shí)期的紅松人工林總面積的65%,且持續(xù)增加[3-4]?，F(xiàn)有的燈光誘殺等物理措施防治冷杉梢斑螟,存在著一次性投入大,且對具有趨光性的各種昆蟲沒有選擇性的缺陷,而化學(xué)防治雖能快速有效殺滅害蟲,但會給環(huán)境和人畜帶來威脅。因此,急需探索高效且環(huán)保的生物措施防治冷杉梢斑螟。

蘇云金芽孢桿菌制劑以高效、無污染、對人無毒而被廣泛使用[5]。蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)是1種革蘭氏陽性菌,在芽孢形成期間產(chǎn)生α、β、γ、δ多種類型伴孢晶體蛋白,其中δ-內(nèi)毒素(亦稱為“殺蟲晶體蛋白”)是最主要的殺蟲蛋白。隨著昆蟲的取食,晶體蛋白進(jìn)入昆蟲中腸后,在中腸堿性條件下(pH>10),二硫鍵斷開,晶體蛋白溶解成原毒素,在中腸蛋白酶的作用下,原毒素裂解為有活性的毒素,有活性的毒素結(jié)合到中腸上皮細(xì)胞膜的特異性受體上,毒素亞基低聚形成孔洞結(jié)構(gòu),并插入到頂膜上,這些孔洞允許離子和水分自由出入細(xì)胞,使細(xì)胞的通透性受到破壞,形成離子通道或孔洞,引起細(xì)胞膨脹和裂解,最后導(dǎo)致昆蟲死亡[6-7]。蘇云金芽孢桿菌對害蟲生長發(fā)育和相關(guān)酶活的影響已有資料報(bào)道[8-9],而有關(guān)該菌對鱗翅目冷杉梢斑螟的殺蟲毒力以及對該蟲生理生化的影響未見報(bào)道。為了探索利用蘇云金芽孢桿菌防控冷杉梢斑螟的可行性,有必要了解該菌對冷杉梢斑螟幼蟲的毒力以及對該蟲保護(hù)與解毒酶活性的影響。

中華甲蟲蒲螨(PyemoteszhonghuajiaYu,Zhang and He)是一種昆蟲天敵蒲螨,由于其雌性比例高、完成世代發(fā)育時(shí)間短、易飼養(yǎng),叮咬寄主時(shí)可產(chǎn)生神經(jīng)毒素將其麻痹、毒殺,能寄生鞘翅目、鱗翅目、等翅目、膜翅目昆蟲,是群居和隱蔽性害蟲的重要生物控制因子等特點(diǎn)[10-11],而被廣泛應(yīng)用于害蟲的防治。張佐雙等[12]應(yīng)用中華甲蟲蒲螨防控六星黑點(diǎn)豹蠹蛾(Zeuzeraleuconotum),寄生率高達(dá)60.5%,且蒲螨對其有明顯的趨性搜尋現(xiàn)象;2005—2008年,賀麗敏等[13]利用中華甲蟲蒲螨控制光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)等鉆駐性害蟲,寄生率高達(dá)98.93%;2012年,賀麗敏等[14]還利用中華甲蟲蒲螨控制松梢螟(Dioryctriapryeri),防治效果也達(dá)75.90%～86.91%。但應(yīng)用中華甲蟲蒲螨防治冷杉梢斑螟的研究未見報(bào)道。鑒于冷杉梢斑螟與松梢螟在分布區(qū)域、寄主植物、生物學(xué)習(xí)性等方面均存在明顯差異,因此有必要對中華甲蟲蒲螨寄生冷杉梢斑螟的能力開展研究。

因此,本文通過蘇云金芽孢桿菌、中華甲蟲蒲螨分別作用于冷杉梢斑螟,根據(jù)死亡率和保護(hù)酶、解毒酶活性的變化,分析兩者的殺蟲效果,旨在為蘇云金芽孢桿菌與中華甲蟲蒲螨聯(lián)合高效安全防治冷杉梢斑螟提供參考。

1 材料與方法

供試蟲源:冷杉梢斑螟老熟幼蟲,2021年9月采自黑龍江省海林市森寶源天然食品有限公司的紅松球果。中華甲蟲蒲螨購于南京登博生物科技有限公司。

供試菌及藥劑:蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種(Bacillusthuringiensissubsp.aizawaiBonnefoi et de Barjac,菌種編號BNCC 110056)購于ATCC菌種庫北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司。將凍干粉于無菌水中溶化,涂布于培養(yǎng)基(蛋白胨5 g,牛肉浸取物3 g,NaCl 5 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 L)上,培養(yǎng)1 d,菌種穩(wěn)定后,轉(zhuǎn)接于新的培養(yǎng)基上,培養(yǎng)1～2 d,轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基上,待其穩(wěn)定后,置于冰箱中4 ℃保存。在超凈工作臺中,用無菌槍頭將菌苔刮到裝有250 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中,將錐形瓶置于恒溫振蕩器中,在30 ℃、170 r/min條件培養(yǎng)48 h,獲得孢晶混合物,用體積分?jǐn)?shù)為0.05%的吐溫-80制備不同濃度菌懸液。

試驗(yàn)儀器:藍(lán)豹恒溫振蕩器HZQ-300;致微全自動(dòng)高壓滅菌器FD50A;北京東聯(lián)哈爾(哈東聯(lián))潔凈工作臺;北京東聯(lián)哈爾(哈東聯(lián))智能光照培養(yǎng)箱HPG-400BX;杭州奧盛全波長酶標(biāo)儀FlexA-200;艾本德5430/R小型臺式高速冷凍離心機(jī);體視顯微鏡Leica M205FA。

蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種對冷杉梢斑螟老熟幼蟲的生物測定:將蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種菌懸液制成不同濃度,將相同大小的塊狀飼料在不同濃度菌懸液中充分浸蘸,蟲饑餓24 h后,放入方形養(yǎng)蟲盒中,分別飼喂24 h,更換新的無菌飼料。對照用蒸餾水浸蘸。處理后的試蟲移到養(yǎng)蟲室飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件:溫度(23±1)℃,相對濕度70%左右,光周期為14 h光照、10 h黑暗。每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)20頭蟲。每天檢查死蟲數(shù),連續(xù)檢查11 d。

中華甲蟲蒲螨對冷杉梢斑螟老熟幼蟲的生物測定:將饑餓24 h的冷杉梢斑螟老熟幼蟲置于直徑為35 mm的塑料培養(yǎng)皿中,每皿1頭,用0號毛筆將中華甲蟲蒲螨挑出,在解剖鏡下分區(qū)計(jì)數(shù)。將0(CK)、20、30、40、50、60頭蒲螨分別接到蟲體,用保鮮膜封口,昆蟲針在保鮮膜上均勻扎孔,再在保鮮膜上蓋上培養(yǎng)皿蓋,防止冷杉梢斑螟咬破保鮮膜逃逸。每皿1頭幼蟲,作為一個(gè)重復(fù),每個(gè)處理10個(gè)重復(fù)。最后將接入蒲螨的塑料培養(yǎng)皿全部放進(jìn)智能光照培養(yǎng)箱(溫度(25±1)℃,相對濕度55%)中。每天在解剖鏡下觀察記錄冷杉梢斑螟的存活情況(用針刺蟲體不動(dòng)即為死亡),以及蒲螨寄生狀況(產(chǎn)生膨腹體的大小、數(shù)量)。

酶源的制備:將蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種菌懸液制成不同濃度,將相同大小的塊狀飼料在不同濃度菌懸液中充分浸蘸,蟲饑餓24 h后,放入方形養(yǎng)蟲盒中,分別飼喂浸蘸菌懸液后的飼料4、8、12、24、48 h后取活蟲,澆液氮,置于冰箱中-80 ℃冷凍待用,對照(用浸蘸蒸餾水后的飼料飼喂冷杉梢斑螟老熟幼蟲)同上。每組3個(gè)重復(fù)。將待勻漿的幼蟲,用流動(dòng)的蒸餾水沖洗后,放在濾紙上吸干水分,用液氮快速冷卻,置于勻漿器中,放入1 mL酶提取液,冰浴勻漿,勻漿液于高速冷凍離心機(jī)上以4 ℃、12 000 r/min離心10 min,取上清液作為酶源,置冰上待用。

蒲螨處理組,將不同數(shù)量中華甲蟲蒲螨接到冷杉梢斑螟幼蟲體后,分別于4、8、12、24、48 h取出冷杉梢斑螟幼蟲,澆液氮,置于冰箱中-80 ℃冷凍待用,對照同上。每組10個(gè)重復(fù)。后續(xù)操作同蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種菌懸液處理組。

乙酰膽堿酯酶(AchE)、羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、過氧化氫酶(CAT)活性的測定,參照格銳思試劑盒說明書進(jìn)行;過氧化物酶(POD)活性的測定,參照蘇州科銘試劑盒說明書進(jìn)行。

數(shù)據(jù)處理:本試驗(yàn)采用Excel和SPSS 23.0軟件中的單因素方差分析進(jìn)行死亡率和酶活性的顯著性分析,通過概率單位回歸計(jì)算蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種對冷杉梢斑螟的致死中濃度(LC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種對冷杉梢斑螟老熟幼蟲的致死力測定

處理分析取食浸蘸不同菌濃度蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種的飼料后冷杉梢斑螟老熟幼蟲的死亡數(shù),擬合得到蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種對冷杉梢斑螟老熟幼蟲的致死中濃度為6 584.065菌落/mL,毒力回歸方程為y=0.431x-1.286。表1表明,冷杉梢斑螟老熟幼蟲的死亡率隨蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種菌濃度的提高而升高。

蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種對冷杉梢斑螟老熟幼蟲的毒力較強(qiáng)。與CK相比,冷杉梢斑螟取食蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種初期,幼蟲拒食,行動(dòng)遲緩。取食后期,蟲體顏色加深,逐漸變?yōu)楹谏?蟲體逐漸癱軟,失去彈性,用鑷子難以夾起,體壁皺縮。死亡蟲體發(fā)黑,腐爛發(fā)臭(圖1)。

圖1 蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種致死冷杉梢斑螟老熟幼蟲

2.2 不同菌濃度蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理冷杉梢斑螟的保護(hù)酶和解毒酶的活性變化

取食經(jīng)105、106、107、108、109個(gè)/mL蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理后飼料的冷杉梢斑螟老熟幼蟲,乙酰膽堿酯酶活性多顯著高于取食相同時(shí)間CK處理的個(gè)體(P<0.05,表2)。只有取食經(jīng)105個(gè)/mL蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理飼料的4、8、24 h時(shí),經(jīng)106、107個(gè)/mL菌液處理飼料的4 h時(shí),經(jīng)109個(gè)/mL菌液處理飼料的4、12、48 h時(shí)的乙酰膽堿酯酶活性與CK差異不顯著,但依然略高于CK,表明乙酰膽堿酯酶活性被誘導(dǎo)激活。梢斑螟在取食含蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種的飼料后,隨蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種毒素的釋放以及作用時(shí)間的延長,解毒酶乙酰膽堿酯酶被誘導(dǎo)激活,為維持正常生理活動(dòng),乙酰膽堿酯酶提高活性,分解毒素,起到解毒作用。

表2 不同菌濃度蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理冷杉梢斑螟后乙酰膽堿酯酶活性

取食經(jīng)105、106、107、108、109個(gè)/mL蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種浸蘸后的飼料4、8、12、24、48 h時(shí),羧酸酯酶活性均顯著低于取食相同時(shí)間CK處理的個(gè)體(P<0.05,表3),表明羧酸酯酶活性被顯著抑制。蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種通過抑制羧酸酯酶活性,阻礙羧酸酯酶發(fā)揮解毒作用,從而擾亂梢斑螟正常生理代謝,最終導(dǎo)致死亡。

表3 不同菌濃度蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理冷杉梢斑螟后羧酸酯酶活性

取食經(jīng)105、106、107、108、109個(gè)/mL蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種浸蘸的飼料后,谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性大多高于取食相同時(shí)間CK處理的個(gè)體(表4),只有取食經(jīng)105個(gè)/mL菌液處理飼料的12、48 h,及經(jīng)106、107個(gè)/mL菌液處理飼料的48 h,冷杉梢斑螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性與CK差異不顯著。表明谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性被誘導(dǎo)激活。說明梢斑螟在取食含蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種的飼料后,芽孢和晶體在中腸中特定pH時(shí)釋放毒蛋白,在中腸蛋白酶作用下水解成毒素,毒素在蟲體內(nèi)不斷累積,為維持昆蟲正常生理活動(dòng),解毒酶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性升高,起到解毒作用。

表4 不同菌濃度蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理冷杉梢斑螟后谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性

取食經(jīng)105個(gè)/mL蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理飼料的冷杉梢斑螟老熟幼蟲,4、12、24、48 h時(shí),體內(nèi)過氧化氫酶活性低于CK,8 h時(shí)顯著高于CK(P<0.05),為CK的1.11倍(表5)。表明取食經(jīng)105個(gè)/mL蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理的飼料時(shí),過氧化氫酶活性總體呈抑制-激活-抑制趨勢。取食經(jīng)106個(gè)/mL菌液處理飼料,4、12、24 h時(shí),梢斑螟過氧化氫酶活性顯著低于CK(P<0.05);8、48 h時(shí),顯著高于CK(P<0.05),分別為CK的1.13、1.04倍。表明取食經(jīng)106個(gè)/mL蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理的飼料時(shí),過氧化氫酶活性總體呈抑制-激活-抑制-激活趨勢。取食經(jīng)107個(gè)/mL菌液處理飼料,4、8、24 h時(shí),過氧化氫酶活性顯著高于CK(P<0.05),分別為CK的1.04、1.03、1.01倍;12、48 h時(shí),顯著低于CK(P<0.05)。表明取食經(jīng)107個(gè)/mL蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理的飼料時(shí),過氧化氫酶活性總體呈激活-抑制-激活-抑制的趨勢。取食經(jīng)108、109個(gè)/mL菌液處理飼料的蟲體內(nèi)過氧化氫酶活性均顯著低于CK(P<0.05),表明過氧化氫酶活性被明顯抑制。過氧化氫酶活性增強(qiáng),分解H2O2,防止產(chǎn)生自由基毒害。梢斑螟在取食經(jīng)105個(gè)/mL蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理的飼料后,芽孢和晶體在中腸中特定pH釋放毒蛋白,8 h時(shí)形成晶體,在中腸蛋白酶作用下水解成毒素,毒素在蟲體內(nèi)不斷累積,過氧化氫酶被激活,后期過氧化氫酶活性被抑制。取食106個(gè)/mL蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理的飼料后,初期,梢斑螟蟲體過氧化氫酶活性被激活,隨著毒素積累,后期再次被激活。取食經(jīng)107個(gè)/mL蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理的飼料后,過氧化氫酶活性呈激活-抑制-激活-抑制的趨勢,表明蟲體被該菌濃度處理后,酶活性較敏感,到48 h時(shí),蟲體活性降低,趨于死亡,過氧化氫酶活性也降低。取食經(jīng)108、109個(gè)/mL蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理的飼料后,蟲體內(nèi)過氧化氫酶活性始終低于CK,取食前期,蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種抑制過氧化氫酶活性,阻礙過氧化氫酶發(fā)揮保護(hù)作用,甚至無法發(fā)揮作用,導(dǎo)致保護(hù)酶系紊亂,擾亂蟲體正常生理機(jī)能,最終導(dǎo)致蟲體死亡,過氧化氫酶活性也降低。

表5 不同菌濃度蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理冷杉梢斑螟后過氧化氫酶活性

取食經(jīng)105個(gè)/mL蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理后飼料的冷杉梢斑螟老熟幼蟲,4、8 h時(shí),體內(nèi)過氧化物酶活性顯著低于CK(P<0.05,表6);12、24 h時(shí),與CK差異不顯著;48 h時(shí)顯著高于CK,為CK的1.18倍(P<0.05)。取食經(jīng)106個(gè)/mL蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理后飼料,8、24 h時(shí),蟲體內(nèi)過氧化物酶活性顯著低于CK(P<0.05);12 h時(shí),過氧化物酶活性達(dá)到峰值,為CK的1.25倍;4、48 h時(shí),與CK差異不顯著。表明取食經(jīng)106個(gè)/mL蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理后飼料時(shí),過氧化物酶活性總體呈抑制-激活-抑制的趨勢。取食經(jīng)107個(gè)/mL蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種浸蘸飼料的冷杉梢斑螟老熟幼蟲,4、48 h時(shí),過氧化物酶活性顯著低于CK(P<0.05);8、12 h時(shí),過氧化物酶活性顯著高于CK,8 h時(shí)達(dá)到峰值,為CK的1.12倍(P<0.05);24 h時(shí),過氧化物酶活性與CK差異不顯著。表明取食經(jīng)107個(gè)/mL蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理后飼料時(shí),過氧化物酶活性總體呈抑制-激活-抑制的趨勢。取食經(jīng)108、109個(gè)/mL蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理后飼料,蟲體內(nèi)過氧化物酶活性多顯著低于取食相同時(shí)間CK處理的個(gè)體(P<0.05),只有經(jīng)108個(gè)/mL菌懸液處理后飼料的4、12、24 h時(shí),與CK差異不顯著,表明過氧化物酶活性多被抑制。過氧化物酶主要作用是清除體內(nèi)過量的H2O2,維持細(xì)胞內(nèi)H2O2的平衡,從而適應(yīng)外界環(huán)境。低菌濃度(105個(gè)/mL)的蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理中,隨毒素積累,直到48 h時(shí),過氧化物酶被激活,開始清除體內(nèi)多余自由基,降低毒性。106、107個(gè)/mL菌懸液處理的蟲體內(nèi)過氧化物酶活性變化趨勢表明,隨蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種菌濃度的升高,毒素在蟲體累積,為維持昆蟲正常生理生化反應(yīng),過氧化物酶被激活的時(shí)間點(diǎn)提前,隨作用時(shí)間的延長,毒素在蟲體內(nèi)進(jìn)一步累積,徹底破壞蟲體保護(hù)酶系,酶活性降低,蟲體活性降低,直至死亡。高菌濃度(108、109個(gè)/mL)蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種抑制蟲體內(nèi)的過氧化物酶活性,阻礙過氧化物酶發(fā)揮作用,導(dǎo)致保護(hù)酶系功能紊亂,最終導(dǎo)致死亡,過氧化物酶活性也降低。

表6 不同菌濃度蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理的冷杉梢斑螟過氧化物酶活性

2.3 中華甲蟲蒲螨對冷杉梢斑螟老熟幼蟲的致死力測定

處理分析接入不同數(shù)量中華甲蟲蒲螨的冷杉梢斑螟老熟幼蟲的死亡數(shù),擬合得到中華甲蟲蒲螨寄生冷杉梢斑螟老熟幼蟲的半數(shù)致死數(shù)量(27.454頭),毒力回歸方程為y=0.032x-0.866。經(jīng)接入數(shù)量為20、30、40、50、60、0(CK)頭中華甲蟲蒲螨處理后,冷杉梢斑螟老熟幼蟲的死亡率分別為40.00%、60.00%、60.00%、70.00%、90.00%、0,表明冷杉梢斑螟老熟幼蟲的死亡率隨中華甲蟲蒲螨接入量的增加而升高。

由表7可見,中華甲蟲蒲螨對冷杉梢斑螟老熟幼蟲的寄生能力較強(qiáng),接入中華甲蟲蒲螨60頭,冷杉梢斑螟老熟幼蟲死亡率高達(dá)90.00%。

2.4 中華甲蟲蒲螨寄生后冷杉梢斑螟性狀

中華甲蟲蒲螨寄生冷杉梢斑螟致死后,蟲體死狀多為“C”形或“I”形。梢斑螟蟲體剛剛死亡時(shí),體壁遍布蒲螨刺吸叮咬留下的黑斑(圖2A);死后0～2d,蟲體上的蒲螨產(chǎn)生膨腹體,隨膨腹體膨大,產(chǎn)生小螨,蟲體逐漸干癟,變硬(圖2B、C)。

A為中華甲蟲蒲螨寄生后冷杉梢斑螟死狀;B為中華甲蟲蒲螨寄生冷杉梢斑螟產(chǎn)生膨腹體;C為中華甲蟲蒲螨寄生蟲蛹產(chǎn)生膨腹體;D為中華甲蟲蒲螨寄生化蛹完全的蟲蛹產(chǎn)生膨腹體。

經(jīng)過24 d的觀測,中華甲蟲蒲螨既可以寄生幼蟲,也可以寄生蛹。幼蟲在接入蒲螨后2.7～14.7 d,蒲螨產(chǎn)生膨腹體;在開始化蛹后2 d,蛹上的蒲螨產(chǎn)生膨腹體。在冷杉梢斑螟化蛹初期,寄生效率更高。蒲螨寄生部位偏好冷杉梢斑螟的頭部和節(jié)間膜,產(chǎn)生膨腹體的位置比較分散,遍布全身。蒲螨寄生蟲蛹,多在蟲蛹還未完全閉合處(第4腹節(jié)處)寄生,因此產(chǎn)生膨腹體的位置比較集中。中華甲蟲蒲螨也可寄生已經(jīng)化蛹完全的蟲蛹,從圖2D可見,接入蒲螨后,直至幼蟲化蛹,蟲蛹被蒲螨叮咬出1個(gè)明顯的孔洞,旁邊有膨腹體產(chǎn)生。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),蟲體上的蒲螨產(chǎn)生膨腹體,蟲體即死亡,也有蟲死后2 d,蟲體上的蒲螨產(chǎn)生膨腹體,膨腹體直徑平均每天增長0.01～0.02 mm,1 d最大增長0.13 mm,幼蟲產(chǎn)膨腹體直徑最大可達(dá)0.88 mm,蛹產(chǎn)膨腹體直徑最大可達(dá)1.05 mm,持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn),產(chǎn)小螨的膨腹體的最小直徑為0.6 mm,最大直徑為1.05 mm。

2.5 中華甲蟲蒲螨對冷杉梢斑螟保護(hù)酶和解毒酶活性的影響

接20、30、40、50、60頭中華甲蟲蒲螨到冷杉梢斑螟老熟幼蟲后,4、8、12、24、48 h時(shí),梢斑螟蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性多顯著高于CK(P<0.05,表8),只有接50頭的4、48 h和接20頭的48 h,乙酰膽堿酯酶活性與CK差異不顯著。表明乙酰膽堿酯酶活性整體處于被誘導(dǎo)激活狀態(tài)。梢斑螟在被蒲螨叮咬、刺吸后,隨寄生時(shí)間的延長,乙酰膽堿酯酶活性不斷升高,起到降低體內(nèi)毒性的作用,隨接入數(shù)量增多(50、60頭)以及接入時(shí)間的延長(48 h),蟲體進(jìn)入深度麻痹狀態(tài),免疫系統(tǒng)紊亂,蟲體活性降低,酶活性也降低。

表8 接入不同數(shù)量中華甲蟲蒲螨的冷杉梢斑螟乙酰膽堿酯酶活性

接20頭中華甲蟲蒲螨到冷杉梢斑螟老熟幼蟲,48 h時(shí),梢斑螟蟲體內(nèi)羧酸酯酶活性顯著高于CK,為CK的1.24倍(P<0.05,表9);處理8、12、24 h時(shí),羧酸酯酶活性顯著低于CK(P<0.05);處理4 h時(shí),羧酸酯酶活性與CK差異不顯著。表明接20頭中華甲蟲蒲螨時(shí),蟲體內(nèi)羧酸酯酶活性總體呈抑制-激活的趨勢。接30、40、50、60頭中華甲蟲蒲螨,4、8、12、24、48 h時(shí),蟲體羧酸酯酶活性均低于CK,只有接30頭中華甲蟲蒲螨4h時(shí)、接60頭中華甲蟲蒲螨48 h時(shí),與CK差異不顯著,表明羧酸酯酶活性多被抑制。接入少量蒲螨(20頭),蒲螨刺吸、叮咬蟲體,注入神經(jīng)毒素,毒素不斷積累,直到48 h,羧酸酯酶活性被激活。隨接入數(shù)量的增加和接入時(shí)間的延長,蟲體在短時(shí)間內(nèi)迅速麻痹且麻痹程度不斷加深,體內(nèi)免疫系統(tǒng)逐漸紊亂,蟲體活性降低,羧酸酯酶活性也降低。

接20、30、40、50、60頭中華甲蟲蒲螨到冷杉梢斑螟老熟幼蟲4、8、12、24、48 h時(shí),梢斑螟蟲體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性多高于CK處理相同時(shí)間的個(gè)體(表10),只有接20、30頭中華甲蟲蒲螨8 h時(shí)、接40頭中華甲蟲蒲螨8、12、48 h時(shí)和接50頭中華甲蟲蒲螨8、12、24 h時(shí),谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性與CK差異不顯著。表明谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性總體呈激活的趨勢。蒲螨叮咬梢斑螟體壁,同時(shí)注入毒素,激活谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性,谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮解毒作用,維持昆蟲正常生理活動(dòng)。

表10 接入不同數(shù)量中華甲蟲蒲螨的冷杉梢斑螟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性

接20、30頭中華甲蟲蒲螨到冷杉梢斑螟老熟幼蟲,24 h時(shí),蟲體內(nèi)過氧化氫酶活性顯著高于CK(P<0.05),分別為CK的1.04、1.02倍(表11);4、8、12、48 h時(shí),過氧化氫酶活性多數(shù)顯著低于CK(P<0.05),只有接20頭中華甲蟲蒲螨48 h時(shí),過氧化氫酶活性與CK差異不顯著。表明接20、30頭中華甲蟲蒲螨時(shí),過氧化氫酶活性總體呈抑制-激活-抑制的趨勢。接40、50頭中華甲蟲蒲螨到冷杉梢斑螟老熟幼蟲,4、12、24、48 h時(shí),蟲體內(nèi)過氧化氫酶活性顯著低于CK(P<0.05);8 h時(shí),過氧化氫酶活性顯著高于CK(P<0.05),分別為CK的1.09、1.05倍。表明接40、50頭中華甲蟲蒲螨時(shí),過氧化氫酶活性總體呈抑制-激活-抑制的趨勢。隨接入蒲螨數(shù)量的增加以及接入時(shí)間的延長,蟲體內(nèi)毒素累積,過氧化氫酶被激活的時(shí)間點(diǎn)提前,過氧化氫酶可以分解體內(nèi)多余的自由基,降低毒性,從而維持蟲體正常生理活動(dòng)。接入后期,毒素繼續(xù)在蟲體內(nèi)積累,蟲體進(jìn)入深度麻痹,活性降低,過氧化氫酶活性也降低。接60頭中華甲蟲蒲螨4、8、12、24、48 h時(shí),過氧化氫酶活性顯著低于CK(P<0.05),表明過氧化氫酶活性被明顯抑制。由于接蒲螨頭數(shù)較多,注入蟲體毒素也相應(yīng)增多,蟲體迅速進(jìn)入麻痹狀態(tài),蒲螨不斷吸取蟲體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì),蟲活性降低直至死亡,過氧化氫酶活性也降低。

表11 接入不同數(shù)量中華甲蟲蒲螨的冷杉梢斑螟過氧化氫酶活性

接20頭中華甲蟲蒲螨到冷杉梢斑螟老熟幼蟲,48 h時(shí),蟲體內(nèi)過氧化物酶活性顯著高于CK(P<0.05),為CK的1.05倍(表12);4、8、12、24 h時(shí),過氧化物酶活性顯著低于CK(P<0.05)。表明接20頭中華甲蟲蒲螨時(shí),過氧化物酶活性總體呈抑制-激活的趨勢。接30頭中華甲蟲蒲螨處理,4、48 h時(shí),蟲體內(nèi)過氧化物酶活性顯著高于CK(P<0.05),分別為CK的1.73、1.22倍;8、12、24 h時(shí),過氧化物酶活性顯著低于CK(P<0.05)。表明接30頭中華甲蟲蒲螨時(shí),過氧化物酶活性總體呈激活-抑制-激活的趨勢。接40、50、60頭中華甲蟲蒲螨4、8、12、24、48 h時(shí),蟲體過氧化物酶活性均顯著低于處理相同時(shí)間CK的個(gè)體(P<0.05),表明接40、50、60頭中華甲蟲蒲螨時(shí),蟲體過氧化物酶活性被明顯抑制。接20頭蒲螨時(shí),隨接入時(shí)間的延長,毒素在蟲體內(nèi)積累,過氧化物酶活性在后期被激活;接30頭蒲螨,初期和后期過氧化物酶活性增強(qiáng),分解蟲體內(nèi)多余的自由基,降低毒性,起到保護(hù)作用。當(dāng)接蒲螨數(shù)量增多時(shí),毒素在蟲體內(nèi)迅速積累,蟲體在較短時(shí)間內(nèi)麻痹,體內(nèi)保護(hù)酶系逐漸被破壞,蒲螨取食蟲體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì),過氧化物酶活性始終低于對照。

表12 接入不同數(shù)量中華甲蟲蒲螨的冷杉梢斑螟過氧化物酶活性

3 結(jié)論與討論

蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白具有高度專一性、只對靶標(biāo)害蟲有效、對其他昆蟲無害、環(huán)保等特點(diǎn)[15]。本文采用飼料浸蘸蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種的方法,室內(nèi)處理冷杉梢斑螟,取得了良好的效果,且隨著蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種菌濃度的升高,梢斑螟的死亡率上升,菌濃度為109個(gè)/mL時(shí),致死率最高(100%)。中華甲蟲蒲螨毒力很強(qiáng),繁殖周期短,被稱為“蛀蟲殺手”[11-12]。梢斑螟類害蟲由于幼蟲營隱蔽性生活,被害果梢產(chǎn)生保護(hù)性泌脂反應(yīng),常規(guī)藥劑防治難以接觸蟲體[16],本文采用蒲螨防治,可達(dá)到更好的防治效果。隨蒲螨接入數(shù)量的增加,梢斑螟死亡率升高,室內(nèi)試驗(yàn)殺蟲效果高達(dá)90%。中華甲蟲蒲螨在冷杉梢斑螟老熟幼蟲蟲體上寄生效果較好。

昆蟲對周圍環(huán)境的變化極其敏感,環(huán)境脅迫會引起昆蟲體內(nèi)一系列生理變化,并伴隨著內(nèi)源毒素的產(chǎn)生。昆蟲解毒酶系(如羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等)的活性可以被各種外源、內(nèi)源化合物誘導(dǎo),這使得昆蟲在受到環(huán)境脅迫時(shí),體內(nèi)酶能迅速作出反應(yīng),從而存活下來[17]。

Guo et al.[18]認(rèn)為,羧酸酯酶是昆蟲體內(nèi)一類重要的解毒酶系,在內(nèi)源或外源毒素代謝中不需要額外能量就能夠催化酯類化合物水解,所以昆蟲在不同環(huán)境脅迫時(shí),均能通過提高自身羧酸酯酶活性來適應(yīng)逆境。本研究中,經(jīng)過蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種或中華甲蟲蒲螨處理后,羧酸酯酶活性多低于CK,呈現(xiàn)被抑制狀態(tài)。表明蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種和中華甲蟲蒲螨都對冷杉梢斑螟羧酸酯酶活性有抑制作用。

取食經(jīng)不同菌濃度蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理的飼料和接入不同數(shù)量中華甲蟲蒲螨的冷杉梢斑螟老熟幼蟲,乙酰膽堿酯酶活性均顯著高于CK,表明乙酰膽堿酯酶活性均被明顯激活。蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理后,蟲體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性均高于CK。接不同數(shù)量中華甲蟲蒲螨到冷杉梢斑螟,谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性均高于CK,表明蒲螨寄生蟲體后,酶活性被顯著激活。這是因?yàn)槠羊纳x體后,注入神經(jīng)毒素,蟲體產(chǎn)生免疫反應(yīng),體內(nèi)解毒酶系活性升高,發(fā)揮解毒作用,以維持昆蟲正常生理活動(dòng)。

超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶是生物體內(nèi)普遍存在的3種防御氧化損傷的重要保護(hù)酶[19-20]。昆蟲在環(huán)境脅迫時(shí),體內(nèi)活性氧的質(zhì)量分?jǐn)?shù)將增多,過氧化氫酶能將高濃度的有害物質(zhì)H2O2分解為水和O2,從而阻止形成毒性更強(qiáng)的羥基自由基,將昆蟲體內(nèi)的H2O2控制在較低的水平,維持昆蟲正常的生理活動(dòng)。本研究中,蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理的蟲體,過氧化氫酶活性多呈抑制-激活-抑制的趨勢,表明梢斑螟幼蟲在取食初期,體內(nèi)過氧化氫酶活性被顯著抑制;取食中期,隨毒素積累,過氧化氫酶被激活;取食后期,隨毒素濃度積累以及作用時(shí)間的延長,超過過氧化氫酶解毒能力,蟲體正常生理功能受到影響,取食遞減,蟲活性降低,酶活性降低。隨蒲螨接入數(shù)量的增多,蟲體過氧化氫酶被激活的時(shí)間點(diǎn)提前,當(dāng)繼續(xù)增加接入數(shù)量,蟲體短時(shí)間內(nèi),迅速麻痹,酶活性被抑制,蟲活性隨之降低。

過氧化物酶是一類以H2O2為電子受體催化底物的氧化還原酶,在昆蟲體內(nèi)可以有效催化H2O2、氧化酚類和胺類化合物,從而起到清除H2O2和酚類、胺類毒性的雙重作用[21]。本研究中,取食經(jīng)蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理后飼料的冷杉梢斑螟,過氧化物酶呈不同的變化趨勢。高菌濃度蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理的蟲體,過氧化物酶活性始終低于CK;較低菌濃度蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理前期,過氧化物酶活性增強(qiáng),蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種蛋白激發(fā)了蟲體內(nèi)解毒酶活性,過氧化物酶活性升高,起到保護(hù)作用,處理后期,過氧化物酶活性降低。蒲螨處理后,冷杉梢斑螟幼蟲體內(nèi)過氧化物酶呈相同的變化趨勢。接入初期(4 h),酶活性被激活,起保護(hù)作用,隨接入數(shù)量的增加以及接入時(shí)間的延長,毒素在體內(nèi)累積,蒲螨吸食蟲體血淋巴以及營養(yǎng)物質(zhì),蟲體逐漸麻痹,蟲活性降低,過氧化物酶活性也逐漸降低。

綜上所述,蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種作用于冷杉梢斑螟,對幼蟲體內(nèi)的解毒酶(乙酰膽堿酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)均有激活作用;對羧酸酯酶有抑制作用;過氧化氫酶和過氧化物酶隨蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種處理濃度的升高以及作用時(shí)間的延長,表現(xiàn)出逐漸抑制的作用。菌濃度為109個(gè)/mL的蘇云金芽孢桿菌鲇澤亞種致死率最高,幼蟲死亡率高達(dá)100%。中華甲蟲蒲螨處理,對蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶均有激活作用;蟲螨數(shù)量比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50時(shí),對冷杉梢斑螟幼蟲過氧化氫酶活性表現(xiàn)出抑制-激活-抑制的作用,蟲螨數(shù)量比為1∶60時(shí),對過氧化氫酶活性表現(xiàn)為全部抑制作用;對羧酸酯酶和過氧化物酶多表現(xiàn)出抑制作用。接60頭蒲螨到蟲體的致死率最高,幼蟲死亡率高達(dá)90%。