猴樟根系適應(yīng)堿脅迫的代謝組學(xué)分析1)

韓浩章 張麗華 李素華 趙榮 王芳

(宿遷學(xué)院,宿遷,223800)

猴樟(CinnamomunbodinieriLevl.)為樟科、樟屬常綠喬木,多分布于云南、貴州、湖南西北部、四川東部、湖北等省分的山地、林區(qū)和城市道路,是我國重要的林用、綠化和經(jīng)濟(jì)樹種[1]。我國關(guān)于猴樟的研究起步較晚,前人通過對(duì)猴樟生長特性的分析,明確了猴樟作為綠化樹種進(jìn)行應(yīng)用的可能性[2-3],但我國許多地區(qū)苗圃建設(shè)和城市綠化過程中栽培土壤質(zhì)量較差,因建筑垃圾回填等原因使得土壤pH在8.4～9.0之間,土壤密度大,有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低,礦質(zhì)營養(yǎng)元素缺乏,直接影響猴樟的生長發(fā)育。苗木栽植后普遍表現(xiàn)為生長緩慢、葉片黃化、抗性降低等,生產(chǎn)栽培過程中采用的人工換土、藥液灌根、樹干掛水、葉面噴肥等措施的效果也并不理想[4],因此限制了猴樟的推廣應(yīng)用。

當(dāng)植物暴露于非生物脅迫時(shí),可以通過調(diào)節(jié)由信號(hào)、基因、功能蛋白、代謝物及表型組成的復(fù)雜系統(tǒng)來維持體內(nèi)生長過程,其中代謝物被認(rèn)為是連接表型和基因型的橋梁,能及時(shí)反映植物的生理狀態(tài)。代謝組學(xué)分析能檢測并篩選出逆境條件時(shí)植物體內(nèi)具有重要生物學(xué)意義和統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的代謝物[5-6],已廣泛用于不同物種的逆境脅迫機(jī)理研究。Goufo et al.[7]發(fā)現(xiàn),在豇豆(Vignaunguiculata)根中,氨基酸、可溶性糖以及原花青素的積累,與干旱脅迫起始階段的感知密切相關(guān)。鹽脅迫時(shí),西伯利亞白刺(Nitrariasibirica)根部,γ-氨基丁酸、天冬酰胺、天冬氨酸、蘋果酸、草酰乙酸及延胡索酸等代謝物質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯增加[8]。Lu et al.[9]研究表明,高羊茅(Festucaarundinacea)和星星草(Puccinelliatenuiflora)中,酮戊二酸、烏頭酸、脯氨酸、可溶性糖和山梨糖等代謝物在混合鹽堿脅迫時(shí)大量積累。從代謝通路來看,鹽脅迫時(shí),多年生黑麥草(Loliumperenne)顯著差異代謝物主要富集于淀粉和蔗糖代謝通路、半乳糖代謝通路、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路、乙醛酸和二羧酸代謝通路、光合碳循環(huán)代謝通路等[10]。棉花(Gossypiumhirsutum)在鹽堿脅迫時(shí),代謝產(chǎn)物變化最明顯的代謝通路是色氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝與檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))[11]。由此可見,代謝組分析為植物適應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)理研究提供了新的證據(jù)。樟屬植物遺傳多樣性豐富,種間耐堿性差異較大,目前關(guān)于樟屬植物耐堿機(jī)理研究仍較少[12]。我們前期的轉(zhuǎn)錄組分析表明,堿敏感猴樟葉片苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成通路、精氨酸和脯氨酸代謝通路、異喹啉生物堿生物合成通路、植物——病原菌互作通路、類胡蘿卜素生物合成通路等相關(guān)基因表達(dá)量在堿脅迫時(shí)明顯上調(diào)[13],但對(duì)猴樟根系適應(yīng)堿脅迫的機(jī)制并不了解。因此,本研究以猴樟根系為研究對(duì)象,采用水培培養(yǎng)技術(shù),研究堿脅迫時(shí)代謝物的積累和代謝途徑,以期從代謝組學(xué)角度,為解析猴樟適應(yīng)堿脅迫的分子機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料:試驗(yàn)在宿遷學(xué)院樟屬植物種苗基地進(jìn)行,于2020年8月采種,低溫層積后,于2021年2月播種,選擇正常生長、長勢(shì)一致的猴樟幼苗為試驗(yàn)材料,苗高(30±2)cm。

試驗(yàn)設(shè)計(jì):試驗(yàn)采用水培培養(yǎng)技術(shù),將幼苗移入塑料水培箱(營養(yǎng)液體積為38 L)中培養(yǎng),營養(yǎng)液配方為0.5倍的霍格蘭營養(yǎng)液,采用蒸餾水進(jìn)行配制,采用KT板(厚度為2 cm)進(jìn)行固定,期間采用增氧泵24 h充氧。試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理,材料培養(yǎng)3周后,根據(jù)課題組前期研究,向各處理營養(yǎng)液中加入Na2CO3,濃度分別為0(對(duì)照)、20 mmol/L(濃度≥30 mmol/L則出現(xiàn)幼苗逐步死亡現(xiàn)象)[14],營養(yǎng)液pH分別為7.58、9.49。分別于處理之后的6、48 h隨機(jī)選取各重復(fù)幼苗根部須根系,分別標(biāo)注為HCK6(對(duì)照處理6 h)、HT6(Na2CO3處理6 h)、HCK48(對(duì)照處理48 h)、HT48(Na2CO3處理48 h),液氮速凍后,于-80 ℃凍存,每處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

代謝物提取、檢測:取液氮研磨后的樣品40 mg,參考郭家鑫等[11]的方法進(jìn)行代謝物提取,采用超高效液相色譜系統(tǒng)(島津,LC-30)進(jìn)行分離,采用質(zhì)譜儀(賽默飛世爾科技公司QE Plus)進(jìn)行質(zhì)譜分析。

數(shù)據(jù)質(zhì)量與穩(wěn)定性驗(yàn)證:采用MS-DIAL軟件完成原始數(shù)據(jù)的基線對(duì)齊、保留時(shí)間矯正和解卷積等工作。采用精確質(zhì)量數(shù)匹配(質(zhì)量偏差<2×10-5)和二級(jí)譜圖匹配(質(zhì)量偏差<0.02 u)的方式進(jìn)行代謝物結(jié)構(gòu)鑒定,檢索人類代謝組數(shù)據(jù)庫(HMDB)及上海拜譜生物科技有限公司自建的代謝物標(biāo)準(zhǔn)品庫。運(yùn)用正交偏最小二乘方判別分析(OPLS-DA)進(jìn)一步修正由偏最小二乘回歸建立的代謝物表達(dá)量與樣品類別之間的關(guān)系模型,依據(jù)OPLS-DA得分圖上的預(yù)測主成分區(qū)分組間變異。

差異代謝物篩選與功能注釋:差異代謝物篩選條件為:(1)OPLS-DA模型得到的變量權(quán)重值>1;(2)單變量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(P值)<0.05。依據(jù)HMDB數(shù)據(jù)庫對(duì)各比較組的差異代謝物進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì),采用京都基因與基因組百科全書(KEGG)系統(tǒng)進(jìn)行通路分析。對(duì)差異代謝物的注釋結(jié)果進(jìn)行差異豐度得分的計(jì)算,利用差異豐度得分對(duì)代謝通路進(jìn)行整體趨勢(shì)分析。當(dāng)差異豐度得分為-1時(shí),表示該通路中所有代謝物的豐度均下降,當(dāng)差異豐度得分為1時(shí),表示該通路中所有代謝物的豐度均上升,越趨近于1或-1,表示該通路整體表達(dá)情況越傾向于上調(diào)或下調(diào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿脅迫時(shí)猴樟根系差異代謝物篩選

圖1為HT6和HCK6、HT48和HCK48組合正、負(fù)離子模式的OPLS-DA分析結(jié)果,橫坐標(biāo)上預(yù)測主成分以0為中心點(diǎn),將各組合中的兩組樣品明顯分離開,說明各組合中樣品組間代謝物表達(dá)量差異顯著。

A為HT6和HCK6正離子模式;B為HT6和HCK6負(fù)離子模式;C為HT48和HCK48正離子模式;D為HT48和HCK48負(fù)離子模式。

由堿脅迫處理6、48 h的猴樟根系顯著差異次生代謝產(chǎn)物韋恩圖可知,堿脅迫處理6 h時(shí),HT6和HCK6組合共鑒定到正離子模式差異顯著的次生代謝產(chǎn)物126個(gè),鑒定到負(fù)離子模式差異顯著的次生代謝產(chǎn)物143個(gè),共計(jì)269個(gè);堿脅迫處理48 h后,HT48和HCK48組合共鑒定到正離子模式差異顯著的次生代謝產(chǎn)物194個(gè),鑒定到負(fù)離子模式差異顯著的次生代謝產(chǎn)物166個(gè),共計(jì)360個(gè)。兩組共有的差異代謝物分別是正離子模式95個(gè)和負(fù)離子模式99個(gè)。堿處理48 h后的表達(dá)量差異顯著次生代謝產(chǎn)物數(shù)量比堿處理6 h的增加了91個(gè),其中正離子模式的增加了68個(gè)。

2.2 堿脅迫時(shí)猴樟根系差異代謝物分類

由表1、2可知,當(dāng)堿脅迫處理6 h時(shí),HT6和HCK6組合正離子模式表達(dá)差異代謝物主要包括生物堿類、聚酮類、苯丙素類和萜類;負(fù)離子模式差異代謝物包括萜類、核酸、聚酮類、有機(jī)酸類、生物堿類、碳水化合物和脂類。當(dāng)堿脅迫處理48 h時(shí),HT48和HCK48組合正離子模式差異代謝物主要包括生物堿類、聚酮類、類固醇類、苯丙素類、甾醇類酯和萜類;負(fù)離子模式差異代謝物包括聚酮類、萜類、生物堿類、核酸、抗生素和脂類。

表2 堿脅迫6、48 h時(shí)猴樟根系負(fù)離子模式差異代謝物種類

2.3 堿脅迫時(shí)猴樟根系差異代謝物KEGG通路分析

在植物體中,多種代謝物通常相互協(xié)調(diào)完成不同的生物學(xué)任務(wù),差異豐度得分可以捕捉到通路中整體代謝物相對(duì)于對(duì)照組增加或減少的趨勢(shì)。由表3可知,堿脅迫處理6 h時(shí),HT6和HCK6組合中能鑒定出差異代謝物主要富集的30條KEGG通路,其中嘧啶代謝通路和玉米素生物合成通路最為顯著;由表4可知,富集的30條KEGG通路中,大部分顯著下調(diào)或趨于下調(diào),只有脂肪酸生物合成通路和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路顯著上調(diào),而托烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成通路、嘧啶代謝通路、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)通路和苯丙烷生物合成通路趨于上調(diào),其余通路無明顯變化。

表3 堿脅迫6 h時(shí)猴樟根系差異代謝物KEGG通路分析結(jié)果

表4 堿脅迫6 h時(shí)猴樟根系差異代謝物KEGG通路的差異豐度得分

如表5所示,堿脅迫處理48 h時(shí),HT48和HCK48組合中,能鑒定出差異代謝物主要富集的30條KEGG通路,其中醛固酮合成與分泌、皮質(zhì)醇合成和分泌、庫欣綜合征、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、孕酮介導(dǎo)的細(xì)胞成熟、膽汁分泌、嘧啶代謝、胰島素抵抗、黃酮類生物合成、光合生物的固碳作用、卵巢類固醇激素生成、黃酮和黃酮醇生物合成通路最顯著;如表6所示,富集的30條KEGG通路中只有半乳糖代謝通路和黃酮類生物合成通路趨于上調(diào),而托烷、哌啶和吡啶生物堿生物合成通路整體無顯著變化,其余通路均顯著下調(diào)或趨于下調(diào)。

表5 堿脅迫48 h時(shí)猴樟根系差異代謝物KEGG通路分析結(jié)果

表6 堿脅迫48 h時(shí)猴樟根系差異代謝物KEGG通路的差異豐度得分

2.4 堿脅迫時(shí)猴樟根系差異代謝物質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

由表7可見,堿脅迫處理6 h時(shí),HT6和HCK6組合中鑒定出脂肪酸生物合成通路中的丙二酸、月桂酸、棕櫚酸、亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升;丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路中N-乙酰天冬氨酰谷氨酸、草酰乙酸、2-氧代丁酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升;托烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成通路中的千里光堿和東莨菪堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升,胡椒堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降;嘧啶代謝通路中尿苷5’-二磷酸、尿苷、尿嘧啶、丙二酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升,尿苷一磷酸(UMP)的顯著下降;磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)通路海藻糖、N-乙酰氨基甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升,水楊苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降;苯丙烷生物合成通路中的蘋果酸芥子酰、丁香素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升;半乳糖代謝通路中的水蘇糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升,UDP-葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降;黃酮類生物合成通路中的高圣草素、(-)-表兒茶素、松木素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降。

表7 篩選出的關(guān)鍵差異代謝物

堿脅迫處理48 h時(shí),HT48和HCK48組合中鑒定出脂肪酸生物合成通路中的月桂酸、棕櫚酸、亞油酸、硬脂酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升;丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路中草酰乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升,γ-氨基丁酸(GABA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降;苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路中的莽草酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升,D-赤蘚糖-4-磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降;托烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成通路中的千里光堿和東莨菪堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升,胡椒堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降;嘧啶代謝通路中尿苷5’-二磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升,尿苷一磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降;磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)通路水楊苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降;半乳糖代謝通路中的蜜二糖、水蘇糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升,UDP-葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降;黃酮類生物合成通路中的阿夫兒茶素、槲皮素、高圣草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升,(-)-表兒茶素、松木素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降。

3 結(jié)論與討論

植物在逆境脅迫的基因表達(dá)與環(huán)境因素共同作用,伴隨代謝通路和代謝物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化,代謝物積累既有時(shí)空積累的特異性,又存在適應(yīng)逆境的多樣性。目前,已發(fā)現(xiàn)許多代謝物在鹽脅迫時(shí)顯著上調(diào),鹽脅迫明顯提高了狗牙草(Cynodondactylon)氨基酸、可溶性糖、有機(jī)酸以及可溶性糖醇等37種代謝物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[15];油菜(Brassicanapus)通過促進(jìn)三羧酸循環(huán),積累糖類和肌醇代謝物,適應(yīng)鹽脅迫[16];椰子(Cocosnucifera)在鹽脅迫時(shí),黃酮類代謝物質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其合成相關(guān)的基因表達(dá)量明顯提高[17],這些代謝物的積累有利于維持植物胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)、清除氧化損傷和穩(wěn)定蛋白質(zhì)功能。最近的代謝組分析發(fā)現(xiàn),植物根系適應(yīng)鹽脅迫和堿脅迫的機(jī)理存在差異,生物堿和類胡蘿卜素參與了垂絲海棠(Malushalliana)適應(yīng)堿脅迫[18];棉花(Gossypiumhirsutum)主要通過三羧酸循環(huán)代謝、色氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝通路適應(yīng)堿脅迫[11]。與對(duì)照相比,堿脅迫處理6 h時(shí),猴樟根系共鑒定到表達(dá)量差異顯著的次生代謝產(chǎn)物269個(gè),包括生物堿類、聚酮類、有機(jī)酸類、核酸、苯丙素類和萜類等;堿脅迫處理48 h時(shí),共鑒定到表達(dá)量差異顯著的次生代謝產(chǎn)物360個(gè),主要包括聚酮類、生物堿類、核酸、脂類、苯丙素類、抗生素和萜類等。可見,堿脅迫時(shí)間越長,參與適應(yīng)堿脅迫的代謝物種類越多,猴樟受到的影響也越大。植物體內(nèi)維生素、類黃酮、木質(zhì)素、生物堿、花青素等多種次生代謝物的前體來源是莽草酸途徑[19],堿脅迫處理48 h時(shí),猴樟根系苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途徑中的D-赤蘚糖-4-磷酸表達(dá)量顯著下調(diào),而莽草酸表達(dá)量顯著上調(diào),莽草酸途徑與此時(shí)代謝物的大量合成有關(guān)。

逆境脅迫時(shí),植物體內(nèi)代謝物積累具有系統(tǒng)性和特異性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)堿脅迫處理6 h時(shí),KEGG通路中大部分顯著下調(diào)或趨于下調(diào),只有脂肪酸生物合成和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路顯著上調(diào),而托烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成通路、嘧啶代謝通路、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)通路和苯丙烷生物合成通路趨于上調(diào)。因此,在堿脅迫處理前期,猴樟主要通過提高根系氨基酸、糖類、有機(jī)酸和生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)適應(yīng)堿脅迫。脂肪酸是生物膜的重要成分和細(xì)胞中的重要能源物質(zhì),還是一些逆境適應(yīng)信號(hào)合成的前體物質(zhì)[21]。在許多植物中已觀察到鹽堿脅迫會(huì)使細(xì)胞膜脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)、組分發(fā)生改變,細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受到傷害[22]。堿脅迫處理時(shí),脂肪酸代謝相關(guān)通路中棕櫚酸、亞油酸、月桂酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高,除了利于維持生物膜的穩(wěn)定性外,還可通過促進(jìn)茉莉酸等激素信號(hào)的傳遞及時(shí)適應(yīng)NaHCO3和NaCl的脅迫[23]。氨基酸代謝被證明參與多種逆境脅迫[8,24],堿脅迫處理6 h時(shí),丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝通路中,N-乙酰天冬氨酰谷氨酸、草酰乙酸和2-氧代丁酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升,N-乙酰天冬氨酰谷氨酸和草酰乙酸參與天冬氨酸的合成,而2-氧代丁酸參與亮氨酸和纈氨酸的合成,植物體內(nèi)氨基酸的積累參與了活性氧的清除和細(xì)胞損傷的修復(fù)[25]。值得注意的是,堿脅迫處理48 h時(shí),丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝通路中草酰乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)依然顯著上升,而γ-氨基丁酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降。γ-氨基丁酸是高等植物中重要的N代謝中間產(chǎn)物,其質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降與三羧酸循環(huán)回補(bǔ)作用有關(guān)[26],而草酰乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升除了利于調(diào)節(jié)根際pH外,也參與了三羧酸循環(huán),三羧酸循環(huán)與猴樟耐堿性密切相關(guān)。植物體內(nèi)的生物堿通常受茉莉酸等信號(hào)誘導(dǎo)合成[27],多數(shù)生物堿在根部合成后,進(jìn)入木質(zhì)部,通過三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體運(yùn)輸進(jìn)入其他器官發(fā)揮作用[28]。堿脅迫處理6 h和48 h時(shí),托烷、哌啶和吡啶類生物堿合成通路中,千里光堿和東莨菪堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升。外源化學(xué)藥劑處理提高植物耐鹽性的同時(shí),也會(huì)伴隨東莨菪堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高[29],千里光堿也具有明顯的抗氧化活性[30],可以認(rèn)為生物堿類主要通過其抗氧化活性參與猴樟耐堿性。糖類代謝物是許多非鹽生植物的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),能夠維持逆境下細(xì)胞膜及原生質(zhì)體的穩(wěn)定,降低細(xì)胞中酶類的降解,還能通過三羧酸循環(huán)為植物適應(yīng)逆境脅迫的代謝過程提供能量[18]。堿脅迫處理6 h時(shí),磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)通路趨于上調(diào),猴樟根系對(duì)糖類的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用能力提高,同時(shí)代謝物海藻糖和N-乙酰氨基甲酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升,海藻糖作為滲透劑,保障了細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)功能穩(wěn)定[31],還通過其抗氧化活性提高植物耐堿性[32]。嘧啶代謝通路相關(guān)基因通常在逆境脅迫下上調(diào)表達(dá)[33],堿脅迫處理6 h時(shí),嘧啶代謝通路中,尿苷5’-二磷酸、尿苷、尿嘧啶和丙二酸表達(dá)量上調(diào),尿苷主要參與核酸合成,而堿脅迫能促進(jìn)核酸合成[34],核酸合成有助于猴樟適應(yīng)短時(shí)間堿脅迫。堿脅迫處理48 h時(shí),尿苷5’-二磷酸表達(dá)依然顯著上調(diào),此時(shí)尿苷5’-二磷酸作為糖基供體合成的參與者,促進(jìn)黃酮類物質(zhì)的糖基化過程[35-36]。苯丙烷類代謝是花青素、黃酮、花色素苷、香豆素、肉桂酸及木質(zhì)素等多種代謝產(chǎn)物的合成途徑[37],受茉莉酸等激素信號(hào)調(diào)控[38-39],相關(guān)基因在堿性和低鐵條件下表達(dá)顯著上調(diào)[40]。堿脅迫處理6 h時(shí),苯丙烷合成途徑中的蘋果酸芥子酰、丁香素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升,蘋果酸芥子酰和丁香素均參與木質(zhì)素合成[41],蘋果酸芥子酰是芥子酸酯代謝途徑中的主要成員,還與脫落酸代謝合作調(diào)控葉片氣孔關(guān)閉和根系生長[42-43],從而提高猴樟耐堿性。

隨著堿脅迫時(shí)間的延長,猴樟生長發(fā)育受到的影響逐步加重。當(dāng)堿脅迫處理48 h時(shí),KEGG和差異豐度得分結(jié)果顯示,只有半乳糖代謝通路和黃酮類生物合成通路趨于上調(diào),其他通路均顯著下調(diào)或趨于下調(diào),猴樟根系適應(yīng)堿脅迫的途徑發(fā)生改變。有研究表明,半乳糖代謝通路相關(guān)基因在鹽堿脅迫時(shí)會(huì)上調(diào)表達(dá)[44],促進(jìn)糖類質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加[45],提高植物抗性。堿脅迫處理48 h時(shí),半乳糖代謝通路中的蜜二糖、水蘇糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升,UDP-葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降。水蘇糖是由1分子蔗糖和2分子D-吡喃半乳糖通過α-1,6-糖苷鍵連接而成的四糖,又能通過β-呋喃果糖苷酶分解為蜜二糖和D-半乳糖,同時(shí)在堿脅迫6 h時(shí)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也顯著上升,水蘇糖主要作為滲透保護(hù)劑調(diào)控猴樟耐堿性[46],但也有報(bào)道指出,水蘇糖是引起地黃等植物連作障礙的主要因素[47],因此,水蘇糖對(duì)猴樟根系耐堿性的作用還需要進(jìn)一步研究。UDP-葡萄糖是黃酮類物質(zhì)糖基化的供體,UDP-葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在堿脅迫后期顯著下降,與黃酮類代謝物大量合成有關(guān)[35-36]。黃酮類化合物通常以苷與苷元的形式廣泛存在于植物體內(nèi),具有抗生物和非生物脅迫的功能[48]。堿脅迫處理48 h時(shí),黃酮類生物合成通路中的阿夫兒茶素、槲皮素、高圣草素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升,而(-)-表兒茶素和松木素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降。高圣草素、阿夫兒茶素、槲皮素均被證明與植物抗鹽有關(guān)[17,49],能增強(qiáng)植株對(duì)氧化脅迫的耐受性,減緩活性氧誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損失[20,50],黃酮類物質(zhì)主要通過其抗氧化活性在猴樟堿脅迫后期起主導(dǎo)作用。

綜上所述,植物對(duì)鹽、堿脅迫的適應(yīng)機(jī)制不盡一致,生物堿類、聚酮、有機(jī)酸類、核酸、苯丙素類、脂類、抗生素和萜類均參與猴樟耐堿脅迫過程。堿脅迫時(shí)間越長,猴樟受到的影響越大,參與適應(yīng)堿脅迫的代謝物種類越多,這與莽草酸途徑有關(guān)。KEGG和差異豐度得分結(jié)果顯示,當(dāng)堿脅迫處理6 h時(shí),KEGG通路中大部分顯著下調(diào)或趨于下調(diào),只有脂肪酸生物合成通路和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路顯著上調(diào),而托烷、哌啶和吡啶生物堿的生物合成通路、嘧啶代謝通路、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)通路和苯丙烷生物合成通路趨于上調(diào),猴樟通過提高氨基酸、糖類、有機(jī)酸和生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)適應(yīng)初期堿脅迫;當(dāng)堿脅迫處理48 h時(shí),KEGG通路中只有半乳糖代謝通路和黃酮類生物合成通路趨于上調(diào),其他通路均顯著下調(diào)或趨于下調(diào),猴樟主要依靠黃酮類物質(zhì)抵抗堿脅迫后期的氧化脅迫,茉莉酸代謝等信號(hào)調(diào)控在猴樟適應(yīng)堿脅迫過程起重要作用。