從表達(dá)載體構(gòu)建創(chuàng)新看基因工程考題變遷

鄧自發(fā)　顧雨薇

摘 要：生命科學(xué)發(fā)展日新月異，盡管教材內(nèi)容不會頻繁變動，但秉承著“一核、四層、四翼”的高考試題常常圍繞生物學(xué)科新發(fā)現(xiàn)、新成就創(chuàng)設(shè)情境，設(shè)置問題.尤其是基因工程部分，它更為貼近學(xué)科前沿.因此，本文結(jié)合教材與基因工程技術(shù)創(chuàng)新歷程，圍繞基因表達(dá)載體的構(gòu)建分析?？寂c高考試題的變遷，嘗試為高中生物學(xué)教學(xué)提供一定的參考.

關(guān)鍵詞：基因工程；同源重組；高中生物

中圖分類號：G632 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1008-0333（2023）16-0139-04

收稿日期：2023-03-05

作者簡介：鄧自發(fā)（1967-），男，陜西省鎮(zhèn)安人，教授，從事生態(tài)學(xué)研究；

顧雨薇（1996-），女，江蘇省南通人，從事中學(xué)生物學(xué)課程與教學(xué)論研究.

基金項(xiàng)目：江蘇省一流本科專業(yè)（生物科學(xué)）建設(shè)項(xiàng)目；生物科學(xué)專業(yè)“卓越教師”教學(xué)技能培養(yǎng)研究與實(shí)踐（南通大學(xué)教學(xué)改革項(xiàng)目）

基因工程，誕生于20世紀(jì)70年代，以它為核心的技術(shù)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)一直是研究的熱點(diǎn).這些年來針對現(xiàn)實(shí)不同的需求或是操作，基因工程取得了不少技術(shù)創(chuàng)新和優(yōu)化.現(xiàn)有的教材中介紹的是傳統(tǒng)的表達(dá)載體構(gòu)建，但是通過對以往的高考和?？荚囶}分析，會發(fā)現(xiàn)高考的情境從不回避前沿知識.研讀高考評價(jià)體系，能清楚發(fā)現(xiàn)，在高考評價(jià)體系“四翼”的應(yīng)用性就明確要求高考要多以貼近時(shí)代、貼近社會、貼近生活的生活實(shí)踐或?qū)W習(xí)探索問題情境為載體，將陳述性知識與程序性知識的有機(jī)整合和運(yùn)用作為考查目標(biāo)，體現(xiàn)對即將進(jìn)入高等學(xué)校的學(xué)習(xí)者遷移課堂所學(xué)內(nèi)容、理論聯(lián)系實(shí)際水平的測量與評價(jià)^[1].所以，在此筆者以基因工程中的核心基因表達(dá)載體的構(gòu)建為主體，通過整理它技術(shù)路線的變遷來探究試題變化趨勢.

1 基因表達(dá)載體構(gòu)建技術(shù)變遷

1.1 傳統(tǒng)表達(dá)載體構(gòu)建

基因工程又叫重組DNA技術(shù)，在現(xiàn)有人教版高中生物教材中介紹的基本工具是限制性內(nèi)切核酸酶——“分子手術(shù)刀”、DNA連接酶——“分子縫合針”、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”.并且后續(xù)介紹基因工程的核心構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，仍然遵循著最初的思路即利用限制酶和DNA連接酶將目的基因和表達(dá)載體相連.因此在傳統(tǒng)的基因表達(dá)載體構(gòu)建中限制酶的選取是基因工程這類題目的考察重點(diǎn)，并圍繞真實(shí)科研中遇到的問題設(shè)置題目考察學(xué)生的科學(xué)思維等核心素養(yǎng).

例題1 （2022·山東模擬）圖1是獲取用于構(gòu)建基因表達(dá)載體的含人生長激素基因的DNA片段（DNA復(fù)制子鏈延伸方向是5′→3′，轉(zhuǎn)錄方向?yàn)樽蟆遥┦疽鈭D，圖2是所用質(zhì)粒示意圖，其上的Ampr表示青霉素抗性基因，Tett表示四環(huán)素抗性基因.有關(guān)限制酶的識別序列和酶切位點(diǎn)見表1.

（1）引物1由5′→3′的堿基序列為，引物2應(yīng)含有限制酶的識別序列

（2）在構(gòu)建表達(dá)載體的過程中對圖中質(zhì)粒、DNA片段進(jìn)行合適的完全酶切后，向兩者的混合物中加入DNA連接酶，若只考慮DNA切段兩兩連接，則混合物中將形成種環(huán)狀DNA.答案：AGATCTGCATCCTCCAGG BamHⅠ 6

解析 分析題目所給的四種限制酶，其中BamH Ⅰ和Bcl Ⅱ?qū)儆谕裁?，它們雖然識別的序列不同，但切出的粘性末端相同.構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，不能使用Hind Ⅲ和Pst Ⅰ，它們識別的序列位于目的基因的內(nèi)部會切斷目的基因，只能選擇BamH Ⅰ和Bgl Ⅱ.由于目的基因兩側(cè)沒有合適的酶切序列，所以需要利用PCR技術(shù)，在引物設(shè)計(jì)上注意添加限制酶的識別序列，由于子鏈的延伸是由5′→3′的方向，所以3′端是用來連接新的游離的脫氧核糖核苷酸不能添加與目的基因本身不堿基互補(bǔ)配對的限制酶序列，而要在5′端加入.并且由于目的基因的插入是有方向的，反向接入沒有意義，所以按照題目，Bgl Ⅱ限制酶的識別序列應(yīng)該接在引物1上，而BamH Ⅰ的酶切序列則加在引物2的5′端.

由于BamH Ⅰ和Bcl Ⅱ?qū)儆谕裁?，所以盡管用了2種酶但是切出了相同的黏性末端.質(zhì)粒完全酶切后會產(chǎn)生2個(gè)片段，且產(chǎn)生的4個(gè)黏性末端與DNA酶切后的兩個(gè)黏性末端都能夠堿基互補(bǔ)配對，所以在混入了DNA連接酶后，僅考慮片段的相連的話會有6種.

總結(jié)：①限制酶的選擇要注意以下幾點(diǎn)：

針對目的基因：不能夠破環(huán)目的基因本身，否則連接毫無意義，因此往往要選取目的基因兩側(cè)的限制酶切割位點(diǎn).

針對質(zhì)粒：因?yàn)橐c目的基因相連所以要確保產(chǎn)生同種黏性末端即切割質(zhì)粒和目的基因的限制酶一般是同種.若沒有同種酶則考慮同尾酶（識別序列不同但產(chǎn)生相同的黏性末端.其次限制酶的選擇不能破壞質(zhì)粒中的重要元件，包括復(fù)制原點(diǎn)、啟動子、終止子，且選擇啟動子和終止子之間的限制酶；否則就沒辦法復(fù)制和正常表達(dá).有時(shí)質(zhì)粒上有多個(gè)標(biāo)記基因，此時(shí)標(biāo)記基因可以破壞，但必須注意保留一個(gè)以便后續(xù)目的基因的篩選和鑒定.

②單酶切與雙酶切的選擇：

單酶切有可能使目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化，也可能導(dǎo)致目的基因反向插入質(zhì)粒，因此可以使用雙酶切，讓目的基因兩端帶有不同的黏性末端，避免自身環(huán)化，使目的基因定向插入質(zhì)粒.

③目的基因兩側(cè)添加合適的酶切序列：

有的時(shí)候目的基因兩側(cè)并沒有較好的限制酶的酶切位點(diǎn)，所以需要在利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)在引物設(shè)計(jì)上注意，適當(dāng)?shù)卦谝锏?′端帶有限制酶酶切序列.

1.2 EASY法構(gòu)建表達(dá)載體

除了利用限制酶和DNA連接酶來連接2個(gè)DNA片段，隨著研究的發(fā)展，1990年，科學(xué)家舒曼在牛痘病毒中發(fā)現(xiàn)了1種拓?fù)洚悩?gòu)酶，它的生理作用主要體現(xiàn)在DNA復(fù)制的過程中，同時(shí)具有內(nèi)切酶和連接酶的功能：酶切釋放DNA復(fù)制過程中因?yàn)榻庑鴰淼漠a(chǎn)生的螺旋力；在復(fù)制完成后，將缺口補(bǔ)上，完成DNA的復(fù)制，是DNA正常復(fù)制的重要保障.因此基于這一原理，科學(xué)家嘗試將拓?fù)洚悩?gòu)酶應(yīng)用于基因表達(dá)載體的構(gòu)建.在2019年江蘇高考就應(yīng)用了這個(gè)科研結(jié)果作為背景.

例題2 （2019·江蘇高考）圖3中是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因（tet^r）和氨芐青霉素抗性基因（amp^r）.請回答下面問題：

用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有1個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸.載體P1用酶處理，在兩端各添加了1個(gè)堿基為的脫氧核苷酸.

答案：胸腺嘧啶（T）

分析 根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，由于題干介紹目的基因兩側(cè)突出的末端都是以腺嘌呤為堿基的脫氧核糖核苷酸，所以在處理質(zhì)粒時(shí)也需要讓它的兩端各添加1個(gè)堿基為胸腺嘧啶的脫氧核苷酸，方便目的基因與載體的連接.

EASY克隆主要原理是將胸腺嘧啶通過磷酸鍵與拓?fù)洚悩?gòu)酶第274位酪氨酸結(jié)合，使拓?fù)洚悩?gòu)酶和載體偶聯(lián)在一起.當(dāng)偶聯(lián)載體與PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接時(shí)，PCR產(chǎn)物3′端羥基撞擊載體與酶之間的磷酸鍵，使其斷裂，拓?fù)洚悩?gòu)酶利用斷鍵釋放的能量發(fā)揮連接功能，將片段連接到載體上，同時(shí)酶從載體上脫落.這項(xiàng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用主要得益于拓?fù)洚悩?gòu)酶本身的特性，它連接速度非常快，所以EASY法構(gòu)建表達(dá)載體會更簡便，反應(yīng)更快速，連接更高效.不過由于它的原理并不在生物高中課程標(biāo)準(zhǔn)中要求學(xué)生理解的概念中，所以圍繞這項(xiàng)技術(shù)考查的題目較少，多作為情境出現(xiàn)，并且出題角度依舊從學(xué)生已知角度出發(fā)，解決常見問題.

1.3 同源重組構(gòu)建基因表達(dá)載體

傳統(tǒng)基因表達(dá)載體的構(gòu)建中應(yīng)用雙酶切法的很多，但是在實(shí)際操作中會遇到很多問題，比如效率問題.不同的限制酶它的最適溫度可能不一樣，它們所需要的緩沖液的成分也不一定相同，因此很有可能會導(dǎo)致最后酶切效率低下或者及連接效率不高，使得篩選重組目的基因非常困難，導(dǎo)致基因工程的失敗.當(dāng)然為了解決這個(gè)問題，越來越多的基因公司改造天然質(zhì)粒，開發(fā)出了帶有合適限制酶的質(zhì)粒，但是如果基因工程需要用到特殊載體，這些問題又重新出現(xiàn)，因此人們通過研究傳統(tǒng)的基因敲除的方法，將同源重組法應(yīng)用在了基因表達(dá)載體的構(gòu)建.它逐漸成為了近幾年基因工程考題的情境.

例題3 （2021·江蘇高考）如圖4所示，某小組為研究真菌基因m的功能，構(gòu)建了融合表達(dá)蛋白M和tag標(biāo)簽的質(zhì)粒，請結(jié)合實(shí)驗(yàn)流程回答下面問題：

重組質(zhì)粒的構(gòu)建

①將Sma I切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進(jìn)，形成A-m結(jié)合體.將A-m結(jié)合體導(dǎo)入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及酶等，完成質(zhì)粒的環(huán)化.

②若正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒A—m仍能被Sma I切開，則Sma I的酶切位點(diǎn)可能在______.

答案：黏性末端堿基配對 DNA連接 基因m的連接處、基因m的內(nèi)部

解析 這道題目是經(jīng)典的同源重組構(gòu)建基因表達(dá)載體中的無縫克隆.

第一步，將質(zhì)粒線性化.在本道題里質(zhì)粒上存在Sma I的酶切位點(diǎn)，直接利用Sma I切出平末端使得環(huán)狀質(zhì)粒線性化.當(dāng)讓如果質(zhì)粒上沒有合適的位點(diǎn)，也可以利用PCR方法實(shí)現(xiàn)載體的線性化.

第二步，獲取目的基因.利用PCR擴(kuò)增目的基因，并在兩個(gè)引物的5′端添加與線性化質(zhì)粒末端相同的同源序列.

第三步，將質(zhì)粒與目的基因混合并添加雙鏈的核酸外切酶.該酶具有從分子鏈的末端順次水解磷酸二酯鍵而生成單核苷酸的作用，主要的催化活性是催化雙鏈DNA按3′→5′的方向.

這樣形成黏性末端，然后降溫以促進(jìn)黏性末端堿基配對.這一過程要控制酶解時(shí)間，時(shí)間過短，沒有將同源序列的一條鏈全部水解，那目的基因和質(zhì)粒產(chǎn)生的黏性末端是無法堿基互補(bǔ)配對的，時(shí)間可以過長，雖然可能會水解超過同源序列的部分，但不妨礙目的基因與質(zhì)粒同源序列間的堿基互補(bǔ)序列.

第四步，導(dǎo)入大腸桿菌.剛剛提到在第三步中構(gòu)建的載體并不完整，還可能存在部分脫氧核苷酸的缺失，但是導(dǎo)入了大腸桿菌后，細(xì)胞中本來就存在的DNA聚合酶和DNA連接酶能夠?qū)⒒虮磉_(dá)載體補(bǔ)全并連接完整.

總結(jié)：同源重組法構(gòu)建基因表達(dá)載體對于學(xué)生來說是一個(gè)非常嶄新的領(lǐng)域，并不是需要學(xué)生在平時(shí)學(xué)習(xí)就掌握的內(nèi)容，更多的是試題提供背景信息，學(xué)生在有限的時(shí)間里，閱讀題干，迅速了解同源重組的流程和結(jié)果，并利用已知來解決問題，考查的是學(xué)生的科學(xué)思維.學(xué)生應(yīng)該掌握生物新課程標(biāo)準(zhǔn)中要求的基本概念，并能夠靈活運(yùn)用于新的情境，學(xué)會遷移而不是機(jī)械地死記硬背.2 思考與總結(jié)

基因工程應(yīng)用廣泛，它的誕生實(shí)現(xiàn)了在微生物、植物、動物之間的基因交流，讓人類以前不能實(shí)現(xiàn)的種種奇思妙想變?yōu)榱爽F(xiàn)實(shí)可能.它的原理看似簡單，就是將外源基因成功導(dǎo)入到受體細(xì)胞，并且這個(gè)外源基因能夠成功在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在、表達(dá)并發(fā)揮作用，進(jìn)而賦予生物新的遺傳特性，但其實(shí)從理論研究到工程實(shí)踐卻并不簡單.通過對表達(dá)載體構(gòu)建技術(shù)的發(fā)展結(jié)合相關(guān)試題的研究，發(fā)現(xiàn)面對真實(shí)科研情境，書本上的傳統(tǒng)操作過程會出現(xiàn)很多問題，學(xué)生要學(xué)會的是在掌握基礎(chǔ)知識的前提下，開拓思維，利用已有知識嘗試解決問題從而優(yōu)化相關(guān)技術(shù).

當(dāng)然基因工程技術(shù)的革新不僅僅局限于基因表達(dá)載體的構(gòu)建上，比如在目的基因獲取中，以前書本主要是從基因文庫中獲取，但是在新教材中PCR法擴(kuò)增成為主流.試題也更多地開始考查不同的PCR技術(shù)，比如RT—PCR、巢式PCR、重疊延伸PCR、熱啟動PCR等等.在目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中，花粉管通道法和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的共同使用；在目的基因的鑒定中，融合基因的應(yīng)用都出現(xiàn)在了多個(gè)考題的情境中，總的來說生物學(xué)與生活實(shí)際是息息相關(guān)的，如果生物的學(xué)習(xí)僅僅停留在背書來答題，教師的教法僅僅是題海戰(zhàn)術(shù)，那就完全違背了高考立德樹人的目的.所以在教學(xué)時(shí)教學(xué)時(shí)，教師要以“理解為先”為目標(biāo)，多關(guān)注科學(xué)前沿，適當(dāng)給學(xué)生拓展，并在平時(shí)課堂上自己通過大量文獻(xiàn)閱讀設(shè)計(jì)情境引導(dǎo)學(xué)生培養(yǎng)批判性思維、創(chuàng)新性思維，提高學(xué)生生物核心素養(yǎng).

參考文獻(xiàn)：

[1] 歐陽一鳴.從高考題看生物論文信息題的命制方式：以2021天津卷13題為例[J].理科考試研究，2022，29（07）：63-65.

[責(zé)任編輯：季春陽]