β-catenin、Biglycan蛋白在結腸癌中的表達及臨床意義*

莊義娟 ，張歡，關蕾 ，劉漢忠 ，陳軍芳

［1.錦州醫(yī)科大學研究生培養(yǎng)基地（孝感市中心醫(yī)院），湖北 孝感 432000；2.武漢科技大學附屬孝感醫(yī)院（孝感市中心醫(yī)院），湖北 孝感 432000；3.湖北職業(yè)技術學院，湖北 孝感 432000］

結腸癌是消化道常見惡性腫瘤，據(jù)2020 年全球癌癥發(fā)病率和死亡率的統(tǒng)計，結腸癌在全球癌癥發(fā)病率排名第三，死亡率第二。我國結腸癌發(fā)病率高居第二，每年新發(fā)人數(shù)可達55 萬，嚴重危害人類健康，需引起高度警惕［1］。β-鏈蛋白（β-catenin）是WNT 信號通路中的重要作用因子，β-catenin 陽性表達上升，能夠通過激活WNT 信號通路，導致下游癌細胞核轉錄活性的增強，使癌細胞DNA 的復制速度明顯增強［2］。雙糖鏈蛋白聚糖（Biglycan）屬于富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖家族，是一種細胞外基質蛋白?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)Biglycan 在多種腫瘤中表達，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關，更有研究者發(fā)現(xiàn)Biglycan 在結腸癌中高表達且與腫瘤不良預后因素相關［3-5］，前有學者研究發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤中Biglycan 可經(jīng)Wnt/β-Catenin 信號通路促進瘤細胞的生長［6］。錯配修復（mismatch repair,MMR）系統(tǒng)是一系列修復DNA堿基錯配的特異性修復蛋白，MMR 系統(tǒng)功能受損或缺失（dMMR），則喪失本身的校驗核對功能，導致DNA 錯配堆積，微衛(wèi)星重復序列拷貝數(shù)目發(fā)生變化，從而產(chǎn)生遺傳不穩(wěn)定性，稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability,MSI）。MSI 可進一步分為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-H）和低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性/微衛(wèi)星穩(wěn)定性（MSI-L/MSS）。MMR基因中任何一個或幾個基因突變均可產(chǎn)生MSI 表型［7］。另有研究發(fā)現(xiàn)MSI-H 腫瘤組中出現(xiàn)低或零的β-Catenin 陽性表達，而MSS 或MSI-L 的腫瘤組顯示出高含量的β-Catenin 陽性表達，揭示了兩組腫瘤表現(xiàn)出的不同臨床行為表現(xiàn)［8］。綜上，為探尋Biglycan 蛋白與β-catenin 蛋白表達及其與結腸癌的關系，其次探究β-catenin 蛋白是否在MSI-H與MSI-L/MSS 兩組腫瘤中存在不同表達，選取80例結腸癌患者作為研究對象，應用免疫組織化學染色方法檢測癌組織中β-catenin、Biglycan 蛋白，應用PCR 方法檢測分析癌組織中MSI 狀態(tài)并分組，分析不同組別間β-catenin 陽性表達率。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年1 月至2020 年6 月孝感市中心醫(yī)院收治的結腸癌患者80 例為研究對象，其中男性43 例，女性37 例；年齡22～86 歲，平均（63.55±12.30）歲。TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期30 例，Ⅲ期50 例；腫瘤部位：右半結腸47 例，左半結腸33 例；分化程度：高、中分化42 例，低分化38 例；浸潤程度：T1～T2 期23 例，T3～T4 期57例；淋巴結轉移情況：無淋巴結轉移（N0）38例，有1～3 枚淋巴結轉移或見任一癌結節(jié)（N1）23 例，有4～6 枚淋巴結轉移（N2）6 例，有大于等于7 枚淋巴結轉移（N3）13 例。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準同意。

納入標準：①經(jīng)臨床及病理組織學確診為原發(fā)性結腸癌；②入組前未行放療、化療及手術治療等；③患者及家屬同意并簽署知情同意書。排除標準：①合并有其他部位腫瘤；②患有嚴重精神疾?。虎坌?、腎、肝臟等功能嚴重不足。

1.2 主要儀器和試劑

光學顯微鏡（型號：BX53，奧林巴斯工業(yè)有限公司）、免疫組織化學染色試劑盒（貨號：JY-0015，公司：武漢珈源生物醫(yī)學）、Idylla 全自動PCR 腫瘤基因檢測系統(tǒng)（公司：武漢福達祥康科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本制備 收集根治術后結腸癌標本切取癌組織及癌旁組織（距癌組織≥5 cm）經(jīng)10%中性福爾馬林緩沖溶液固定后脫水、浸蠟、包埋、切片等處理后分別制成3～4 μm 厚的石蠟切片用于免疫組織化學染色、5～10 μm 厚的石蠟切片用于PCR腫瘤MSI 檢測。

1.3.2 免疫組織化學染色法檢測 嚴格按照免疫組織化學染色試劑盒說明書進行操作，實驗最終所得切片在光學顯微鏡下觀察并采集圖像。染色結果判定：細胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為β-catenin 陽性細胞，細胞質或細胞膜中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為β-catenin 陰性細胞；細胞漿中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為Biglycan 陽性細胞，按染色強度記錄，染色強度：無色、淡黃、棕黃、棕褐色分別記0、1、2、3 分，0～1 為陰性，2～3為陽性。

1.3.3 微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測 實驗所用PCR-MSI 檢測分析系統(tǒng)可檢測7 個標志物（AVR2A、BTBD7、DIDO1、MRE11、RYR3、SEC31A、SULF2），檢測方法過程嚴格按照分析系統(tǒng)說明要求完成前期標本處理、試劑盒加樣并編號上機，最終系統(tǒng)顯示每個標志物檢測結果：檢測到突變的標志物得分為0.50～1.00、未檢測到突變的標志物得分為小于0.50 及無效（Invalid），可得到的結果有4 種：MSI-H（≥2 個標志物突變）、MSI-L（＜2 個標志物突變）、MSS（無標志物突變）及Invalid（＞2 個標志物結果無效）。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，比較用t檢驗；計數(shù)資料以百分率（%）表示，比較用χ2檢驗；采用Pearson 法進行相關性分析；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結腸組織中β-catenin 蛋白及Biglycan 蛋白的表達

β-catenin 蛋白陰性表達定位在細胞膜和細胞漿，異常陽性表達定位于細胞核，腸癌組織中細胞陽性表達率顯著高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Biglycan 蛋白陽性表達定位在細胞質中表達，結腸癌組織中Biglycan 蛋白陽性表達率顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

圖1 結腸癌組織中Biglycan 蛋白與β-catenin 蛋白表達

表1 Biglycan 蛋白與β-catenin 蛋白在結腸癌與癌旁組織中的表達

2.2 β-catenin 蛋白和Biglycan 蛋白陽性表達與結腸癌臨床病理特征的關系

結腸癌組織中β-catenin 蛋白陽性表達與患者性別、年齡、腫瘤部位、大體類型無明顯相關性（P均＞0.05），與分化程度、浸潤深度、脈管侵犯、淋巴結轉移及TNM 分期有相關性（P均＜0.05）；Biglycan 蛋白表達與患者性別、年齡、腫瘤部位、大體類型、分化程度及脈管侵犯無明顯相關性（P均＞0.05），與浸潤深度、淋巴結轉移及TNM 分期有相關性（P均＜0.05），見表2。

表2 β-catenin 蛋白與Biglycan 蛋白表達水平與結腸癌臨床病理特征的關系（例）

2.3 β-catenin 和Biglycan 的相關性

Speraman 相關性分析發(fā)現(xiàn)，結腸癌組織中β-catenin 與Biglycan 表達具有相關性（r=0.992,P＜0.001），見圖2。

圖2 結腸癌組織中β-catenin 與Biglycan 的相關性

2.4 β-catenin 在MSI-H 與MSS/MSI-L 兩組腫瘤中陽性表達率

在入組的80 例結腸癌患者中，經(jīng)PCR 方法測定并分類，80 例結腸癌中MSI-H 組有10 例，β-catenin 陽性表達率為40.0%，MSI-L/MSS 組有70 例，β-catenin 陽性表達率為61.4%，兩組結腸癌中β-catenin 陽性表達率相比，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.345＞0.05）。見表3 及圖3。

圖3 微衛(wèi)星不穩(wěn)定檢測結果

表3 結腸癌MSI-H 組與MSS/MSI-L 組中β-catenin 的表達 ［n(%)］

3 討論

結腸癌是世界三大癌癥之一，發(fā)病率和死亡率高居前三，每年死于癌癥患者有近千萬，而死于結直腸癌的患者近10%，結直腸癌的防治研究工作刻不容緩［1］。結腸癌的發(fā)生及發(fā)展是一個涉及多基因、多階段的復雜過程。結腸癌患者早期癥狀不典型，常表現(xiàn)為便秘、大便習慣改變、腹痛、腹瀉等癥狀，多未引起注意，大多患者就診時已進展至中晚期，影響患者術后生活質量［9］。時代變遷，人們健康意識不斷提升和健康宣教的普及，加之內(nèi)窺鏡檢查和影像學技術不斷更新提升，很多結腸病變得以早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，但也為了進一步做好結腸癌的防治工作，造福更多病患，探究有關結腸癌發(fā)生發(fā)展中影響因素有助于了解疾病轉歸、探尋預后不良的相關因素，有助于制定并完善個體治療方案，對改善患者預后有一定意義。

雙糖鏈蛋白聚糖（Biglycan,BGN）屬于富含亮氨酸的小蛋白聚糖類家族（SLRPs），參與構成細胞外基，它由兩個糖胺多糖和一個核心蛋白組成，核心蛋白分子量為38 kD，含10 個富亮氨酸的重復單位，糖胺多糖由硫酸皮質素/硫酸軟骨素組成，BGN 長約8 kb，含有內(nèi)含子和8 個外顯子，位于Xq27-Xq28，最早于骨組織中發(fā)現(xiàn)［10］。

BGN 在腫瘤的生物發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，在胃癌、結直腸癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌等多種癌癥中均發(fā)現(xiàn)異常BGN 表達。有研究證實BGN在結腸癌中高表達，并且與其組織學分級、淋巴結轉移及遠處器官轉移相關［11-13］。BGN 表達失調可導致多種臨床疾病的發(fā)生，如代謝紊亂、炎癥性疾病、肌肉骨骼缺損和惡性腫瘤等，在癌癥中，BGN 的高表達促進了腫瘤的生長、侵襲和轉移，這與臨床預后不良有關［14］。新興研究表明，BGN參與多種生物事件，包括細胞增殖和分化、血管形成、骨折愈合、組織修復和炎癥［15］。在各種類型的實體癌患者中，BGN 的上調與預后不良相關，BGN 在實體瘤中的表達增加及其與預后不良的相關性表明，BGN 可作為多種類型腫瘤的預后指標［16］。

Wnt/β-catenin 信號轉導廣泛涉及人類癌癥和動物實驗癌癥模型。大量研究表明，WNT 信號通路的激活是結腸癌早期的重要標志，超過90%的結腸癌存在WNT 信號通路的異常激活，NF-κB 信號通路的異?；罨谴龠M結腸癌發(fā)生、發(fā)展和治療抵抗的重要因素［17-18］。當細胞的WNT 信號通路信號在無外界刺激時，穩(wěn)定狀態(tài)下Axin/GSK-3β/APC復合體可解體β-catenin 蛋白，使其在細胞質中濃度降低且維持在較低水平，當細胞受到外界WNT信號通路信號刺激時，Axin/GSK-3β/APC 復合體構象發(fā)生改變進而最終解體，其解體后對β-catenin蛋白解體作用缺失，使得細胞質內(nèi)的β-catenin 蛋白得以穩(wěn)定存在且不斷積聚，進而轉入細胞核內(nèi)與TCF/LEF 轉錄因子結合激活信號通路，最終啟動下游靶基因的轉錄［19-20］。有研究認為β-catenin表達上升能夠導致結腸癌細胞的侵襲能力的增強，提高了癌細胞對于結腸黏膜基底組織的浸潤程度［21］。還有研究者認為β-catenin 的表達上升能夠顯著促進結腸癌患者的臨床預后的惡化［22］。

錯配修復系統(tǒng)（mismatch repair,MMR）是機體的一種DNA 基因錯配修復機制，主要識別DNA復制過程中的堿基錯配，錯配修復基因完整（pMMR）可確保DNA 復制過程的準確性，而當錯配修復基因缺失（dMMR）時不能修復錯配的堿基，出現(xiàn)MSI，一系列調節(jié)生長和增值的基因發(fā)生突變，致使DNA 遺傳不穩(wěn)定而最終發(fā)生腫瘤［23-24］。約15%的結腸癌顯示有MSI［25］。病理組織學顯示，MSI 的結腸癌多見于近端結腸，癌組織常表現(xiàn)為低分化，癌周伴有淋巴細胞浸潤，對化療的反應與微衛(wèi)星穩(wěn)定的結腸癌不同［26］。大約75% 的MSI 結腸癌伴有MLH1 基因高甲基化［27］。MSI 的結腸癌常見遺傳改變是致癌的BRAF V600E突變，散發(fā)性結腸癌中BRAF V600E 突變與死亡率增加相關［28］。結腸癌中缺乏dMMR/MSI-H 的發(fā)生率約占15%，Ⅳ期dMMR/MSI-H 腫瘤僅占所有轉移性轉移性結腸癌的2%～4%［29-30］。近期研究表明MSI-H 結腸癌患者可從免疫治療中獲益，且預后優(yōu)于MSS/MSI-L 型結腸癌。有人提出WNT 信號通路的改變可能與MSI 的結腸癌的癌變有關［31］。更有學者指出MSI-H 的結腸癌由于特征性突變導致MMP-3 表達受損，可降低對E-cadhenin 蛋白的水解作用，E-catenin 與β-catenin 連接固定于細胞骨架中，阻止細胞漿中的β-catenin 入核激活WNT信號通路，該研究進一步發(fā)現(xiàn)MSI-H 的結腸癌組β-Catenin 陰性表達，而MSS 或MSI-L 的結腸癌組顯示出高含量的β-Catenin 陽性表達，提示MSI-H與MSS/MSI-L 的結腸癌具有不同臨床表現(xiàn)及預后［8］。

本研究結果顯示Biglycan 蛋白表達水平升高與結腸癌的組織學分級、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM 分期有關，提示Biglycan 與蛋白表達水平與結腸癌的組織學分化程度和癌組織的侵襲力相關；β-catenin 蛋白陽性表達率與結腸癌的浸潤深度、淋巴結轉移及TNM 分期有關，提示β-catenin蛋白表達水平與結腸癌侵襲力及預后相關。與癌旁正常組織相比，Biglycan 表達上調及β-catenin蛋白陽性表達率均明顯升高，且相關性分析提示結腸癌組織中Biglycan 表達上調及β-catenin 蛋白陽性表達存在一定相關性，二者在結腸癌的發(fā)生、發(fā)展中是否存在一定關聯(lián)性，需待后續(xù)進一步實驗探究。

此外，筆者對比分析了80 例結腸癌中MSI-H組和MSS/MSI-L 組的β-catenin 蛋白表達情況，本研究入組的80 例結腸癌病例中MSI-H 組有10 例（12.5%），其中β-catenin 蛋白陽性表達率為40.0%，MSS/MSI-L 組有70 例（87.5%），其中β-catenin 蛋白陽性表達率為61.4%，MSI-H 與MSS/MSI-L 兩組結腸癌中β-catenin 陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義。筆者猜測，一方面可能β-catenin 陽性表達情況確實和微衛(wèi)星穩(wěn)定性無明顯相關性，另一方面可能研究中入組的MSI-H 組的標本例數(shù)太少不足以說明問題，擬進行擴大樣本量進一步的確認和分析。

綜上所述，結腸癌組織中，Biglycan 蛋白表達上調及β-catenin 蛋白陽性表達均與浸潤深度、淋巴結轉移及TNM 分期有關，Biglycan 與β-catenin可能作為評估結腸癌患者預后指標。Biglycan 蛋白表達上調及β-catenin 蛋白陽性表達存在一定相關性，識別WNT 信號通路中的關鍵調控蛋白對結直腸癌的早期診斷還是早期干預治療均有積極影響，具體Biglycan 與WNT 信號通路激活的是否相關，其相關作用機制尚需后續(xù)進一步研究。