CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)在水稻中的研究進(jìn)展

劉建菊　肖寧　吳云雨　蔡躍　潘存紅　時(shí)薇　陳梓春　朱書豪　李育紅　余玲　王志平　劉廣青　周長?！↑S年生　張小祥　季紅娟　 李愛宏

摘要：基因編輯是一種能對特定基因進(jìn)行修飾的基因工程技術(shù)，能快速對靶點(diǎn)基因編輯，是高效捕獲目的基因、快速研究目標(biāo)基因功能的重要手段，在基因功能研究和作物育種等方面有著重要意義和廣闊的應(yīng)用前景?；蚓庉嬂锰禺惖腄NA結(jié)合元件和切割元件開展編輯工作，然而該技術(shù)最需注意的是特異性和脫靶率問題，不同時(shí)期的基因編輯技術(shù)也針對上述2個(gè)問題進(jìn)行改良，目前應(yīng)用最為廣泛的是CRISPR/Cas9，Cas12a 由于其特異性高且脫靶率大大降低也受到越來越多的關(guān)注。本文對基因編輯的技術(shù)發(fā)展及特點(diǎn)、CRISPR/Cas9和Cas12a的技術(shù)優(yōu)勢進(jìn)行介紹，并對這2種技術(shù)在水稻產(chǎn)量、抗性及品質(zhì)中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，同時(shí)對拓展CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)在水稻中的應(yīng)用提出展望，為基因功能鑒定及遺傳改良提供參考。

關(guān)鍵詞：基因編輯；Cas9；Cas12a；水稻；性狀改良

中圖分類號：S511.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2023）11-0001-09

基因編輯（gene editing）是一種能對特定基因進(jìn)行修飾的基因工程技術(shù)［1-2］，該技術(shù)利用工程核酸酶切割目標(biāo)基因組產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（DSB），進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)源性DNA修復(fù)機(jī)制從而產(chǎn)生包括插入、缺失及基因片段替換等新的基因突變類型［3-5］。

1996年出現(xiàn)的鋅指核酸酶（ZFN）為基因編輯技術(shù)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)［6-7］，利用該技術(shù)首次于2002年果蠅染色體上實(shí)現(xiàn)基因定點(diǎn)突變［8］。隨后轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（TALENs）［9］及由RNA介導(dǎo)的Cas9蛋白相關(guān)的成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）相繼被發(fā)現(xiàn)［10-11］，特別是CRISPR/Cas9于2013年開始應(yīng)用于植物基因組編輯，被Science列入2013年十大科學(xué)進(jìn)展［10］。此外，用于切割雙鏈DNA的CRISPR/Cas12a（Cpf1）［12-13］及在crRNA指導(dǎo)下切割ssRNA的CRISPR/Cas13（C2c2）［14］于2015年和2016年相繼被發(fā)現(xiàn)（圖1）。

基因編輯利用特異的DNA結(jié)合元件和切割元件開展編輯工作，然而該技術(shù)最需注意的是特異性和脫靶率問題，基因編輯技術(shù)的更迭對這2個(gè)方面的改善也各不相同（表1）。ZFNs是第一個(gè)應(yīng)用于基因定點(diǎn)編輯的技術(shù)，然而其ZFN 剪切DNA 形成同源二聚體的同時(shí)，可能會產(chǎn)生異源二聚體引起脫靶且難以實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)編輯等問題，嚴(yán)重阻礙了其應(yīng)用［15-16］；TALENs技術(shù)是1個(gè)TALE基序識別1個(gè)堿基對，因此多個(gè)串聯(lián)的TALE基序與其識別的堿基對呈一一對應(yīng)關(guān)系，大大提高了編輯特異性并降低脫靶率，但其編輯效率較低，且難以進(jìn)行多基因編輯［17-20］；CRISPR/Cas9技術(shù)在sgRNA的指導(dǎo)下與靶點(diǎn)結(jié)合，并利用HNH和RuvC對外源DNA進(jìn)行切割，其編輯效率大大提高，且可以對多基因同時(shí)編輯，然而其缺點(diǎn)是靶向目標(biāo) DNA 序列容易出現(xiàn)錯(cuò)配，存在脫靶率高、編輯特異性低等缺陷［4，16，21-22］；Cas12a可以在crRNA引導(dǎo)下識別PAM，識別到正確序列才會形成封閉的R環(huán)，因此編輯準(zhǔn)確性相對Cas9有了較大提高，其脫靶率也有所降低［12-13，23］。

CRISPR/Cas9及Cas12a是目前基因編輯技術(shù)中應(yīng)用最為廣泛的2種技術(shù)，在水稻產(chǎn)量、品質(zhì)、生物脅迫及非生物脅迫性狀關(guān)鍵基因的分子遺傳功能解析和目標(biāo)性狀的精準(zhǔn)改良上已成熟應(yīng)用（表2）。

2CRISPR/Cas在水稻中的研究進(jìn)展

2.1產(chǎn)量性狀

水稻產(chǎn)量由單株穗數(shù)、每穗粒數(shù)、粒型及粒重等多個(gè)性狀綜合組成［112-113］。目前已有29個(gè)產(chǎn)量相關(guān)基因被編輯，其中4個(gè)基因?qū)Ξa(chǎn)量起正調(diào)控作用，其他25個(gè)基因均作為負(fù)調(diào)控因子發(fā)揮作用。Li等對每穗粒數(shù)Gn1a、粒型DEP1、粒重GS3及理想株型基因IPA1定點(diǎn)突變，gn1a、dep1和gs3的T2突變體出現(xiàn)穗粒數(shù)增加、粒型變大，成功提高了產(chǎn)量［37］。其他研究分別對Gn1a&DEP1、GS3&DEP1、GS3、GS2/GRF4及SPL16/qGW8等開展基因編輯，在穗粒數(shù)、粒型、粒重等性狀上調(diào)控產(chǎn)量，改善農(nóng)藝性狀同時(shí)提高產(chǎn)量［39，42，44，47-48］。開展多基因同時(shí)編輯也可快速調(diào)控產(chǎn)量，Xu等同時(shí)對負(fù)調(diào)控粒重、粒型基因GS3、GW2、GW5及TGW6進(jìn)行編輯，快速改良突變體粒重及產(chǎn)量［41］。Zhou等同時(shí)編輯GS3、Gn1a及GW2，相關(guān)突變體出現(xiàn)籽粒變大、穗粒數(shù)增多從而提高水稻產(chǎn)量［38］。Zeng等同時(shí)編輯PIN5b、GS3和MYB30，突變體兼顧了高產(chǎn)和耐冷性［43］。非產(chǎn)量調(diào)控基因突變也會提高產(chǎn)量，Miao等獲得ABA受體突變體pyl1/4/6，通過增加31%籽粒數(shù)量從而提高產(chǎn)量［57］，除此之外，對FWL4、SD1（OsGA20ox2）及PYL9進(jìn)行定點(diǎn)突變也可不同程度提高產(chǎn)量［49，51-52，58］。然而產(chǎn)量正調(diào)控基因如RGA1、SWEET11被編輯后會分別引起植株極端矮化及灌漿功能受損，從而減產(chǎn)［42，50］。

CRISPR/Cas12a在水稻產(chǎn)量調(diào)控中應(yīng)用也日漸增多，Malzahn等對粒長基因DEP1和葉片卷曲度基因ROC5進(jìn)行敲除提高產(chǎn)量。對水稻PDS、DEP 和ROC5基因所有靶點(diǎn)進(jìn)行突變，能同時(shí)改良農(nóng)藝性狀及抗性［45，54］，而將葉綠素a加氧酶基因CAO1靶向敲入水稻中，突變體的產(chǎn)量及品質(zhì)降低［32，53］，Zheng等同時(shí)利用Cas9和Cas12a對細(xì)胞分裂素家族基因OsCKX1-11進(jìn)行編輯，獲得了農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量均有提升的單基因及多基因突變體，Cas9的編輯效率為26.9%～90.0%，有8個(gè)基因的編輯效率高于50.0%，而Cas12a的編輯效率為368%～100%且9個(gè)基因的編輯效率高于60%，Cas12a的多基因編輯效率高于Cas9（91.7%>545%）［40］。上述研究表明，對負(fù)調(diào)控基因進(jìn)行定點(diǎn)突變后可快速獲得目標(biāo)性狀改善的編輯系，然而有些基因突變后會對其他性狀產(chǎn)生不利影響，因此多重基因編輯技術(shù)的應(yīng)用為多個(gè)性狀同時(shí)改良提供了方案和可行性，在開展基因編輯時(shí)Cas12a的編輯效率及穩(wěn)定性均高于Cas9。

2.2品質(zhì)性狀

稻米品質(zhì)是水稻商業(yè)價(jià)值的核心賣點(diǎn)，受到多個(gè)基因綜合調(diào)控，已有大量基因被證實(shí)直接或間接調(diào)控稻米品質(zhì)，可用于定向改良直鏈淀粉含量、蛋白、香味等性狀。目前有13個(gè)品質(zhì)基因被編輯，其中4個(gè)基因（ISA、ITPK、GL3.2和BEL）正調(diào)控稻米品質(zhì)，其他基因負(fù)調(diào)控稻米品質(zhì)。Wx基因的基因編輯位置差異對稻米品質(zhì)影響不同，對Wx基因功能位點(diǎn)進(jìn)行突變，可以將直鏈淀粉含量降至與糯稻相似，在不影響產(chǎn)量前提下改良稻米品質(zhì)［59-61］；對 Wxb基因啟動子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，獲得新的Wx等位基因并獲得直鏈淀粉含量不同程度降低的突變體，改良了稻米品質(zhì)［62］。fad2突變體的油酸濃度提高，gs9突變體的粒型、堊白及外觀等品質(zhì)顯著改善，or突變體籽粒β-胡蘿卜素含量顯著提高，isa突變體總淀粉含量下調(diào)，ZmPsy和SSU-crtI突變體水稻的籽粒類胡蘿卜素含量提高，badh2突變體籽粒產(chǎn)生香味，均可改良稻米品質(zhì)［66-67，69-70，72，114］。多基因同時(shí)突變可綜合提升水稻性狀，如app6/10雙突變體的直鏈淀粉、蛋白及谷蛋白含量均下調(diào)［65］；細(xì)胞色素P450家族基因（Os03g0603100、Os03g0568400和GL3.2）和香味基因BADH2同時(shí)突變后改良稻米香味并提高產(chǎn)量［71］；PDS和BELs同時(shí)突變穩(wěn)定提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)［73］。對正調(diào)控基因進(jìn)行突變，有助于理解基因在稻米品質(zhì)改良中的作用，敲除Wxb第一內(nèi)含子、SBEIIb進(jìn)行精準(zhǔn)敲除，突變體直鏈淀粉含量上調(diào)，且引起營養(yǎng)特性改變［63-64］。Jiang等突變ITPK1-6，降低籽粒植酸含量然而卻提高無機(jī)磷含量，不利于水稻生長繁殖，證實(shí)該基因?qū)λ菊ＩL發(fā)育的重要性［68］。對負(fù)調(diào)控稻米品質(zhì)基因的敲除加速了優(yōu)質(zhì)水稻品種選育的進(jìn)程，與其他產(chǎn)量性狀相關(guān)基因同時(shí)編輯，有望在保證產(chǎn)量的同時(shí)提高品質(zhì)。

2.3生物脅迫

水稻生長過程對生物脅迫的抗性也可利用基因編輯方法改良，對抗性相關(guān)基因MPK1、MPK2、MPK5和MPK6的敲除能夠提高抗病性［85-86］。ERF922、SEC3A、ALB1、RSY1 和Pi21敲除后，突變體對稻瘟病的抗性提高，同時(shí)農(nóng)藝性狀也得到改良［74-78］。SWEET13和SWEET14敲除后突變體對白葉枯病菌的抗性提高，且SWEET14突變體無產(chǎn)量損失［79，81］。對SWEET11/8N3/Xa13編碼區(qū)及啟動子區(qū)定點(diǎn)突變，也能提高水稻對白葉枯病的抗性［80，82］。Liang等對稻曲病相關(guān)基因USTA和UvSLT2進(jìn)行編輯，顯著提高了水稻對稻曲病抗性［84］。利用Cas12a低水平同源性核酸酶MAD7對水稻基因EPSPS、NRAMP、PDS、Xa13及ALS等進(jìn)行多重基因敲除，同步提升了突變體的品質(zhì)、除草劑及白葉枯病抗性［83］。Wang等利用Cas12a對受體樣激酶（OsRLK）相關(guān)基因（OsRLK-798、OsRLK-799、OsRLK-802和OsRLK-803）及CYP81A家族基因（OsBEL-230、OsBEL-240、OsBEL-250和OsBEL-260）開展多重基因編輯，獲得了陽性植株，相關(guān)突變體調(diào)控了水稻的抗逆性［105］。

對水稻負(fù)調(diào)控抗性基因進(jìn)行敲除或替換可快速改善目標(biāo)性狀，提升水稻抗性，然而有些編輯以損失產(chǎn)量為代價(jià)［109］，而有些編輯在不損害甚至優(yōu)化農(nóng)藝性狀前提下同步改善水稻品質(zhì)［77-78，81，90，95］，因此在進(jìn)行水稻抗性改良時(shí)需要考慮基因?qū)λ镜木C合影響，從而制定相應(yīng)編輯策略。

2.4非生物脅迫

水稻生長發(fā)育過程中會受到多種非生物脅迫的影響，如干旱、低溫、鹽、除草劑等，相關(guān)基因的大量挖掘促進(jìn)了基因編輯在水稻非生物脅迫中的應(yīng)用，目前有24個(gè)相關(guān)基因被編輯，其中8個(gè)基因起正調(diào)控作用，即Ann3、OTS1、RAV2、SAPK2、BELs、MKK5、RLKs和SAP。在水稻抗旱性方面，PYL9、ERA1、PDS、半卷葉基因（SRL1和SRL2）和MIR535的基因突變會增強(qiáng)突變體的抗旱性［58，88-90，106］。而敲除SAPK2和SAP基因后，突變體對干旱脅迫和活性氧更敏感，農(nóng)藝性狀顯著下降［87，111］。在水稻響應(yīng)鹽脅迫方面，敲除水稻中的RR22、DST及PQT3基因，可顯著提高耐鹽性且不影響農(nóng)藝性狀［92，94-95］，但對OTS1編碼區(qū)及RAV2啟動子的GT-1元件突變后，其耐鹽性下降［91，93］。在水稻抗除草劑方面，通過將EPSPS、ALS突變基因敲入，或點(diǎn)突變野生型基因（ALS、FTIP1e）均能使水稻獲得除草劑抗性［96-103］。

除此之外，敲除Nramp5能降低Cd的積累且不影響產(chǎn)量［107-108］；Ann3敲除后對低溫的耐受性降低［110］；敲除MKK5后，突變體抗逆性降低［104］；同時(shí)突變抽穗基因Hd2、Hd4和Hd5后突變體開花期及成熟期提前有助于逃避脅迫［109］，然而農(nóng)藝性狀受到較大影響，因此在應(yīng)用時(shí)可進(jìn)行單基因編輯，從而消除對產(chǎn)量的損害。

3CRISPR/Cas的技術(shù)展望

基因編輯技術(shù)為生命科學(xué)帶來重大進(jìn)展，然而幾種技術(shù)的脫靶率及特異性問題仍需重點(diǎn)關(guān)注。研究人員優(yōu)化了相關(guān)技術(shù)，開發(fā)了DB-PACE法從而降低基因編輯工具酶的脫靶效應(yīng)，大大提高TALEN核酸酶的DNA結(jié)合能力和切割特異性［115］；開發(fā)出提高Cas9基因編輯和堿基編輯特異性的選擇性核輸出抑制劑（SINE）［116］；Sheng利用腙介導(dǎo)CRISPR/Cas12a系統(tǒng)，通過互補(bǔ)堿基配對引起的鄰近效應(yīng)來加速整個(gè)激活鏈的形成，從而提高Cas12a 系統(tǒng)的特異性［117］。除此之外，CRISPR系統(tǒng)的sgRNA的優(yōu)化、PAM修飾、crRNA優(yōu)化及Cas蛋白突變體挖掘也會進(jìn)一步提高編輯范圍及特異性并降低脫靶率［12，46，104，118-120］。此外Cas12a蛋白表現(xiàn)出對低溫敏感的特征，目前Cas12a突變體是解決該問題的主要方式，而引起低溫敏感的分子機(jī)制尚不明確。上述問題的解決，將大大提高基因編輯水平，對目標(biāo)基因進(jìn)行定向編輯，產(chǎn)生無外源DNA插入的新品種，從而加快育種速度、縮短育種年限。

水稻產(chǎn)量、抗性和品質(zhì)相關(guān)基因的挖掘及分子機(jī)理解析，有助于更全面了解基因功能，目前基因編輯主要集中在編碼區(qū)，有少量研究是編輯啟動子的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)性狀調(diào)控的。已有研究表明，DNA結(jié)構(gòu)本身，如拓?fù)洚悩?gòu)結(jié)構(gòu)等也會影響基因表達(dá)水平［121］，因此，未來也可能作為基因編輯靶點(diǎn)，增加目標(biāo)性狀精準(zhǔn)改良的可能性。隨著人工智能的發(fā)展，Alphafold等技術(shù)對蛋白預(yù)測精準(zhǔn)度提高，越來越多的蛋白結(jié)構(gòu)被預(yù)測，對目標(biāo)基因的模擬突變有助于挖掘關(guān)鍵堿基序列，可進(jìn)行靶向預(yù)測，實(shí)現(xiàn)新的目標(biāo)性狀的改良已經(jīng)成為可能。相信隨著基因編輯技術(shù)的不斷完善、生物信息學(xué)和人工智能的不斷發(fā)展，水稻育種將會迅猛發(fā)展。

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