低強度耳屏迷走神經(jīng)刺激通過減輕心房內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激緩解長程起搏誘導的心房顫動

韓亞凡 湯寶鵬 王菲菲 孫華鑫 李瑤 桑婉玥 王璐 楊杭 周賢惠 蘆顏美 張玲 李耀東

(1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心臟中心起搏電生理科 新疆心電生理與心臟重塑重點實驗室,新疆 烏魯木齊 830054;2.成都市第四人民醫(yī)院心身醫(yī)學中心,四川 成都 610000)

心房顫動(atrial fibrillation, Af)作為臨床中最常見的快速室上性心律失常,可導致心力衰竭或體循環(huán)栓塞等多種并發(fā)癥,具有較高的死亡率[1-2]。既往研究[3-5]表明,氧化應激、鈣超載和自主神經(jīng)紊亂等均與Af密切相關(guān),可導致心房肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu),對Af的發(fā)生和發(fā)展具有重要的維持作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和維持細胞正常功能的細胞器,參與鈣穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)合成與折疊等多種細胞過程[6]。由于炎癥、氧化應激和缺血等內(nèi)在或外在因素致使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡,誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)[7-8],長期或過度的ERS將促進CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP) 和胱天蛋白酶-12等促凋亡因子激活,誘導細胞凋亡,參與Af和室性心動過速等多種心律失常疾病的進展[9-11]。本課題組前期研究證實,低強度耳屏迷走神經(jīng)刺激(transcutaneous auricular vagal nerve stimulation, ta-VNS)具有增加心室電穩(wěn)定性并減輕心室間質(zhì)纖維化的作用[12];亦可通過平衡胸腔內(nèi)自主神經(jīng)活動,減少心臟交感神經(jīng)過度支配,發(fā)揮抗室性心律失常作用[13];課題組近期研究并報道了ta-VNS對阻塞性睡眠呼吸暫停所導致的Af也具有顯著的保護作用,其機制為ta-VNS通過改善交感神經(jīng)興奮和心房肌細胞凋亡等降低Af易感性[14]。然而ta-VNS對長程起搏介導的Af中ERS的調(diào)節(jié)作用及潛在機制并無研究報道。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

本研究遵從《美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物研究指南》,并得到新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院動物實驗醫(yī)學倫理委員會審批通過(批號:IACUC201902-K05)。由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供18只健康Beagle犬,年齡3～5歲,體重8～10 kg,采用隨機數(shù)字法分為3組(每組6只):假手術(shù)組、Af組和Af+ta-VNS組。所有犬植入起搏器,其中假手術(shù)組不起搏,Af組與Af+ta-VNS組起搏頻率設為600次/min,持續(xù)4周。Af+ta-VNS組于4周后給予ta-VNS直至8周末,其余分組給予假刺激。參照課題組前期研究[12-14],刺激脈寬0.1 ms,頻率20 Hz,引起竇性心率下降20%或房室傳導減慢20%的最低電壓值定義為閾值電壓,其閾值電壓的一半設為低強度刺激電壓,刺激頻率為隔天1次,每次2 h,兩耳交替,且每次刺激前重新校正閾值電壓。

1.2 材料與試劑

LEAD-7000多通道電生理記錄儀(錦江電子,中國),呼吸麻醉機(廣州柯之藍儀器有限公司,中國),起搏器(恩識醫(yī)療科技(上海)有限公司,中國),多集電極(美敦力,美國),KZ-Ⅲ 研磨儀(武漢賽維爾生物科技有限公司,中國),e-BLOT電子壓片成像儀(易孛特光電技術(shù)(上海)有限公司,中國)。TUNEL檢測試劑盒(MK1025,博士德生物工程(武漢)有限公司);犬乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)試劑盒(JL48115,上海江萊生物科技有限公司)。一抗:抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)抗體(稀釋1：500,ab109659,Abcam),抗蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)抗體(1：1 000,3192S,CST),抗磷酸化PERK(p-PERK)抗體(1：1 000,3179S,CST),抗真核翻譯起始因子2亞基α(eIF2α)抗體(1：1 000,NBP2-02669,Novus Biologicals),抗磷酸化的eIF2α(p-eIF2α)抗體(1：1 000,NBP2-67353,Novus Biologicals),抗轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcription factor,ATF4)抗體(1：500,bs-1531R,Bioss),抗CHOP抗體(1：1 000,bs-20669R,Bioss)?？垢视腿?3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(1：10 000,ab8245,Abcam)。二抗:山羊抗兔抗體(1：10 000,ZB-2301,中杉金橋)及山羊抗鼠抗體(1：10 000,ZB-2305,中杉金橋)。

1.3 神經(jīng)遞質(zhì)濃度測定

按時抽取實驗犬靜脈血3～5 mL,置于肝素抗凝管中離心并收集上清液,使用高效液相色譜儀檢測血液樣本中腎上腺素(epinephrine,E)及去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)等兒茶酚胺類物質(zhì)濃度;ELISA試劑盒檢測ACh神經(jīng)遞質(zhì)濃度,操作過程嚴格遵守儀器使用規(guī)范及試劑盒說明書進行。

1.4 在體電生理檢測

實驗犬靜脈麻醉后,取仰臥位穿刺右側(cè)股靜脈,將電極導管插入右心房,并使用LEAD-7000電生理儀檢測心房有效不應期(atrial effective refractory period,AERP)、Af易損窗(window of vulnerability,WOV)、Af誘發(fā)率及Af持續(xù)時間等電生理參數(shù)。AERP的測定通過高于基礎心率20%頻率起搏的S1S1刺激誘導,S1S2間期從160 ms以10 ms逐次遞減,直至達到不能被奪獲的最長S1S2間期。其在AERP測試中,誘發(fā)出Af最長和最短的S1S2間期之差稱為WOV。Af誘發(fā)率定義為短陣快速脈沖刺激(burst刺激)10次(S1S1=50 ms,持續(xù)10 s)出現(xiàn)Af的百分比。Af定義為不規(guī)則心房率≥500次/min且不規(guī)則房室傳導持續(xù)時間≥5 s。Af從起搏誘發(fā)到自行終止之間的時間稱為Af持續(xù)時間。

1.5 超聲心動圖評估

實驗員將犬安撫后,胸前區(qū)備皮并右側(cè)臥位。由同一位超聲專科醫(yī)師使用超聲儀(HD11XE,美國飛利浦股份有限公司)于基線期、4周末、8周末測量左/右心房最大內(nèi)徑、左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)及心率,連續(xù)測量3次取平均值。

1.6 心肌細胞凋亡檢測

采用TUNEL凋亡試劑盒對石蠟切片的心房組織檢測細胞凋亡,操作過程嚴格遵守說明書步驟。于顯微鏡下觀察凋亡細胞呈棕色,正常細胞核呈藍色。細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.7 ERS相關(guān)蛋白檢測

取各組心房組織50 mg,加入高效放射免疫沉淀分析裂解液、蛋白酶和磷酸酶抑制劑,使用研磨儀勻漿后冰上靜置30 min離心,提取上清并常規(guī)使用二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取適量蛋白上清加入上樣緩沖液煮沸10 min備用,常規(guī)電泳并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜,5%牛血清白蛋白封閉液室溫封閉1 h,加入一抗并4 ℃孵育過夜,三乙醇胺緩沖鹽水溶液+吐溫20洗滌后加入二抗室溫孵育1 h,使用超敏顯色液在電子壓片成像儀下顯影條帶,Image J軟件分析并計算目的蛋白灰度值,最終以目的蛋白與GAPDH的灰度比值作為相應目的蛋白的表達水平。

1.8 統(tǒng)計分析

使用SPSS 26.0分析數(shù)據(jù)。計量資料呈正態(tài)分布的以均數(shù)±標準差表示,兩組間采用t檢驗比較,多組間采用單因素方差分析比較,對總體有差異的采用Bonferroni兩兩比較。計數(shù)資料以頻數(shù)和百分比(%)表示,多組間比較采用克魯斯卡爾-沃利斯檢驗,并使用Bonferroni校正P值。所有統(tǒng)計分析基于雙側(cè)假設檢驗,P<0.05具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 血清神經(jīng)遞質(zhì)濃度

4周末,Af組及Af+ta-VNS組的E、NE水平與同組基線期及假手術(shù)同時期相比增高,ACh水平降低(P<0.05);但Af組E、NE及ACh水平與Af+ta-VNS組相比無差異(P>0.05)。8周末,Af+ta-VNS組E、NE水平與同組4周末及Af組同時期相比下降,ACh水平升高(P<0.05),但未回落至正常水平,與同組基線期或假手術(shù)組同時期相比仍具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)(見表1)。

表1 三組不同時間膽堿類和兒茶酚胺類濃度及超聲指標

注：a表示與同組基線期對比,P<0.05;b表示與同組4周末對比,P<0.05;c表示與假手術(shù)組同時期對比,P<0.05。

2.2 在體電生理檢測

8周末,與假手術(shù)組相比,Af組AERP縮短,而WOV和Af持續(xù)時間延長,Af誘發(fā)率增高[AERP: (83.33±5.16)ms vs(133.33±10.33)ms,t=-10.607,P<0.001;WOV:(56.67±8.16)ms vs (8.33±7.53)ms,t=10.661,P<0.001;Af持續(xù)時間:(11.83±2.48)s vs (2.75±0.37)s,t=8.857,P<0.001;Af誘發(fā)率:(88.33±9.83)% vs (8.33±7.53)%,t=15.825,P<0.001];而與Af組相比,8周末Af+ta-VNS組AERP延長,而WOV和Af持續(xù)時間縮短,Af誘發(fā)率降低[AERP:(123.33±10.33)ms vs (83.33±5.16)ms,t=8.485,P<0.001;WOV:(40.00±6.32)ms vs (56.67±8.16)ms,t=-3.953,P=0.003;Af持續(xù)時間:(5.00±0.74)s vs (11.83±2.48)s,t=-6.461,P<0.001;Af誘發(fā)率:(43.33±8.16)% vs (88.33±9.83)%,t=-8.625,P<0.001](圖1)。

注:A圖和B圖為AERP和WOV的變化,C圖和D圖為burst刺激10次后平均Af持續(xù)時間及Af誘發(fā)率,E圖為在體電生理圖。表示與假手術(shù)組相比,P<0.05;表示與Af組相比,P<0.05。

2.3 超聲心動圖評估

4周末,Af組和Af+ta-VNS組的LVEF水平與同組基線期及假手術(shù)組同時期相比較低,而左心房和右心房內(nèi)徑擴大且心率加快(P<0.05)。8周末,Af+ta-VNS組LVEF值與同組4周末及Af組同時期相比升高,左/右心房內(nèi)徑縮小且心率下降(P<0.05)。而8周末LVEF、左/右心房內(nèi)徑及心率回落至正常水平,與同組基線期及假手術(shù)組同時期相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。同時,值得注意的是,LVEF與神經(jīng)遞質(zhì)E、NE水平呈負相關(guān),與ACh水平呈正相關(guān);而左心房、右心房內(nèi)徑及心率變化與神經(jīng)遞質(zhì)E、NE水平呈正相關(guān),與ACh水平呈負相關(guān)。見表1。

2.4 TUNEL染色及ERS相關(guān)蛋白檢測

TUNEL染色發(fā)現(xiàn)Af組的心肌凋亡指數(shù)較高,Af+ta-VNS組心肌細胞凋亡減少(P<0.05)。Af組GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP等ERS相關(guān)蛋白表達水平與假手術(shù)組相比明顯增加(P<0.05);而Af+ta-VNS組抑制了Af介導的ERS相關(guān)蛋白的表達水平,與Af組相比具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)(圖2和圖3)。

注:A圖為三組ERS標志物免疫印跡結(jié)果,每組6只犬;B～F圖為定量分析GRP78、ATF4、CHOP蛋白水平以及p-PERK/PERK和p-eIF2α/eIF2α比值。表示與假手術(shù)組相比,P<0.05;表示與Af組相比,P<0.05。

注:A、B、C圖為三組左心房組織TUNEL染色,每組6只犬,藍色為細胞核,棕黃色代表TUNEL染色陽性(40倍放大,比例尺=20 μm);D圖為TUNEL染色細胞凋亡率的定量分析。表示與假手術(shù)組相比,P<0.05;表示與Af組相比,P<0.05。

3 討論

本研究首次將ta-VNS緩解長程起搏誘導Af犬模型的有益作用與心房ERS的潛在作用聯(lián)系起來。其研究主要發(fā)現(xiàn):(1)ta-VNS可提高血清ACh濃度,降低血清E及NE濃度;(2)ta-VNS可降低Af犬心房電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu);(3)ta-VNS可降低GRP78和PERK通路蛋白表達水平、心房組織內(nèi)凋亡因子CHOP的表達以及心肌細胞凋亡率。

心臟交感神經(jīng)活性增加導致心肌細胞長期暴露于E及NE中,繼而通過β-腎上腺素受體信號通路激活ERS,誘導心肌細胞凋亡,維持Af的發(fā)生和發(fā)展[15]。同時,Mottillo等[16]的研究也表明,交感神經(jīng)遞質(zhì)可激活β3-腎上腺素受體,引起GRP78和CHOP的表達升高,應用β-腎上腺素受體拮抗劑后可有效逆轉(zhuǎn)兒茶酚胺對ERS的影響[17-18]。因此,交感神經(jīng)遞質(zhì)和β-腎上腺素受體在ERS誘導心肌細胞凋亡的過程中發(fā)揮重要作用[15]。本研究結(jié)果顯示ta-VNS可有效減輕Af犬模型的心房電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu),與既往研究報道一致[19];同時,筆者觀察到ta-VNS可降低血清E及NE濃度,降低心房ERS標志蛋白GRP78表達水平和PERK等ERS信號通路的蛋白表達水平,阻滯心房組織CHOP的表達,降低心肌細胞凋亡率。故筆者推測ta-VNS具有提升迷走神經(jīng)活性而抑制交感神經(jīng)活性的作用,通過減少心臟神經(jīng)再生從而削弱Af的神經(jīng)基礎,發(fā)揮抗ERS及抗心肌細胞凋亡等作用,限制Af底物的形成[20-21]。

就臨床轉(zhuǎn)化而言,ta-VNS對Af的防治作用一直是討論的熱點話題。目前臨床研究已證實ta-VNS除可降低心臟術(shù)后患者Af的發(fā)生率[22]外,對于患有阻塞性睡眠呼吸暫停合并Af、高血壓合并Af等疾病的患者均具有良好的治療效果[21,23]。然而,Kulkarni等[24]和Stavrakis等[25]的研究得出不同的結(jié)論,他們的研究表明單純ta-VNS只能減少Af負荷,并不能改善Af的復發(fā)或終止。即便如此,筆者的大動物研究發(fā)現(xiàn),ta-VNS可通過緩解ERS發(fā)揮抗心臟重構(gòu)作用,提示ta-VNS仍具有一定的抗心律失常效果。

不足之處,本研究的刺激參數(shù)均參照既往研究中所報道的刺激方案進行,未進行不同刺激電壓下的療效對比,故未得出大動物最優(yōu)的刺激參數(shù);此外,ta-VNS調(diào)控ERS的具體分子機制未深入研究,未來需進一步探索。

綜上所述,ta-VNS減輕長程起搏誘導的Af模型犬的機制可能與抑制心房ERS及細胞凋亡有關(guān)。其抗心律失常的效應為Af的防治提供了新思路。

利益沖突所有作者均聲明無利益沖突