通過TLR4/NF-κB通路探討白藜蘆醇對急性腦出血大鼠腦損傷的作用機制

楊 龍,董秀娟

腦出血是指自發(fā)性急性腦實質(zhì)出血,具有較高的致死率和致殘率,發(fā)病后30 d內(nèi)死亡率超過30%,1年內(nèi)死亡率超過60%,且超過50%的幸存病人留有運動障礙、語言障礙、認(rèn)知障礙等殘疾[1]。腦出血的病理機制復(fù)雜,其中腦血腫占位、腦水腫、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及神經(jīng)細(xì)胞凋亡參與疾病進(jìn)展[2-3]。特異性存在于腦組織中的小膠質(zhì)細(xì)胞是先天性免疫細(xì)胞,腦出血后小膠質(zhì)細(xì)胞被迅速激活,并分泌細(xì)胞因子、趨化因子等,從而參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激調(diào)節(jié),其中Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4-6]。白藜蘆醇(resveratrol,RES)是存在于花生、葡萄等多種植物中的天然多酚類化合物,具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)免疫力等多種藥理學(xué)作用[7-9]; RES通過抑制TLR4/NF-κB信號通路對脂多糖所致急性肺損傷、缺氧/復(fù)氧所致肝損傷等發(fā)揮保護(hù)作用[10-11]。本研究通過制備急性腦出血大鼠模型并給予RES治療,觀察RES對急性腦出血大鼠腦組織損傷的保護(hù)作用及其機制,以期為防治腦出血提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性Wistar大鼠240只,8周齡,體質(zhì)量(230±20)g,購自河北省實驗動物中心[生產(chǎn)許可證號:SCXK(冀)2018-004],動物合格號:202006008;分籠飼養(yǎng)于滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校[使用許可證號:SCXK(冀)2019-006],飼養(yǎng)溫度25 ℃,相對濕度55%～65%、光照周期12 h/12 h,自由飲水進(jìn)食,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開展實驗。本研究經(jīng)滄州市中心醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗藥物與試劑 RES購自成都普斯生物科技股份有限公司(純度≥99%,批號:20191207);尼莫地平(nimodipine,NMP)注射液購自辰欣藥業(yè)股份有限公司(批號:202003016);末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法(TUNEL)試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號:20200313);白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunoassay,ELISA)試劑盒和丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司(批號:SEKR-0002、SEKR-0005、SEKR-0009、BC0020、BC0170、BC0200);2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉(bicinchoninic acid,BCA)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號:D10616);兔源離子鈣結(jié)合適配分子1(ionic calcium binding aptamer 1,Iba1)、TLR4、NF-κB、β-肌動蛋白(β-actin)和山羊源IgG二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(批號:bs-1363R、bs-20595R、bs-20355R、bs-0061R、bs-0295G);SP法免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(批號:ZLI-2719);二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司(批號:DA1015)。

1.3 實驗儀器 DW-2000型腦立體定位儀(成都泰盟軟件有限公司);微量注射器(上海高欣玻璃儀器);Multiskan FC型酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);Allegra 21R型低溫離心機(美國Beckman公司);UV-1200紫外-可見分光光度計(上海美譜達(dá)儀器有限公司);EG1150H型包埋機、RM2245型石蠟切片機、CM1950型冰凍切片機(德國Leica公司);DYCZ-40型電泳儀(北京六一儀器廠);PAC300型轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司);BX43型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司);GFL-230型烤箱(天津市萊波瑞儀器設(shè)備有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組、模型制備與給藥 將240只實驗用Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、RES低劑量組、RES中劑量組、RES高劑量組和NMP組,每組40只。除假手術(shù)組外,其余組均參照孟令麗等[12]報道的自體血注射法復(fù)制腦出血大鼠模型:造模前禁食禁水12 h,腹腔注射10%水合氯醛溶液(3 mL/kg)麻醉后,由右側(cè)股動脈穿刺取血100 μL備用,取俯臥位固定于腦立體定位儀,沿正中切開頭皮與骨膜、暴露前囟,之后在中線右側(cè)旁3 mm及前囟前0.2 mm交匯處鉆孔,緩慢進(jìn)針6 mm后,以10 μL/min速度緩慢注射50 μL自體血,留針10 min后緩慢退針,無菌骨蠟封閉顱骨鉆孔,逐層縫合皮膚,碘伏消毒。造模完成后,RES低劑量組、RES中劑量組、RES高劑量組分別每日1次腹腔注射濃度6 mg/mL、12 mg/mL、18 mg/mL的RES溶液[13],NMP組每日1次腹腔注射濃度2 mg/mL的NMP溶液[14],假手術(shù)組和模型組給予0.9%氯化鈉溶液,注射體積均為5 mL/kg,療程均為7 d。

1.4.2 神經(jīng)功能缺失評分 各組隨機取10只大鼠,參照Longa評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評分[15]:無神經(jīng)功能缺失,計0分;癱瘓側(cè)前肢彎曲、不能正常伸展,計1分;不能直線行走、向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈,計2分;不能正常站立、向癱瘓側(cè)傾倒,計3分;意識降低、不能主動爬行,計4分。評分越高說明神經(jīng)功能缺失越嚴(yán)重。

1.4.3 失重法測定腦組織含水量 腹腔注射10%水合氯醛溶液(3 mL/kg)麻醉后,頸椎脫臼處死后斷頭取腦,去除嗅球、小腦和腦干后稱重記為W1,置于100 ℃烘箱中24 h,烘干至恒重后稱重記為W2,腦組織含水量(%)=[(W1-W2)/W1]×100%。

1.4.4 腦血腫體積 各組隨機取10只大鼠,腹腔注射10%水合氯醛溶液(3 mL/kg)麻醉后,頸椎脫臼處死后斷頭取腦,4%多聚甲醛溶液固定72 h后,以自體血注射孔為中心行0.5 mm厚度冰凍切片,血腫呈暗紅色,測量血腫最大層面互為垂直的血腫最大橫徑(mm)和最大縱徑(mm),采用多田公式計算腦血腫體積[14],腦血腫體積(mm3)=(π/6)×最大橫徑(mm)×最大縱徑(mm)×血腫層數(shù)×切片厚度(mm)。

1.4.5 HE染色法觀察腦組織病理學(xué)改變 各組隨機取10只大鼠,腹腔注射10%水合氯醛溶液(3 mL/kg)麻醉后,頸椎脫臼處死后斷頭取腦,去除嗅球、小腦和腦干,4%多聚甲醛溶液固定72 h后,經(jīng)石蠟包埋、4 μm厚度連續(xù)切片、展片、二甲苯透明、梯度乙醇溶液脫蠟處理后行常規(guī)HE染色,封片后采用顯微鏡觀察腦組織病理學(xué)改變。

1.4.6 TUNEL觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況 取制備好的腦組織石蠟切片,經(jīng)二甲苯透明、梯度乙醇溶液脫蠟處理后,按照TUNEL試劑盒操作說明進(jìn)行處理,封片后通過顯微鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況。凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)的計算:每張切片選取互不重疊的5個視野,計數(shù)視野內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù),AI(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.4.7 ELISA檢測腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α含量 取各組剩余的10只大鼠,腹腔注射10%水合氯醛溶液(3 mL/kg)麻醉后,頸椎脫臼處死后斷頭取腦,取血腫周圍大腦組織,在冰上剪碎后加入4 ℃ 預(yù)冷裂解液,冰上靜置裂解30 min后,4 ℃離心(轉(zhuǎn)速3 500 r/min,10 min)后取上清液,按照ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行處理,采用酶標(biāo)儀檢測腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

1.4.8 分光光度法檢測腦組織MDA含量和SOD、CAT活性 取血腫周圍大腦組織經(jīng)裂解且離心后的上清液,按照試劑盒操作說明進(jìn)行處理,采用紫外-可見分光光度計檢測腦組織MDA含量和SOD、CAT活性。

1.4.9 免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)法檢測腦組織Iba1蛋白表達(dá) 取制備的腦組織石蠟切片,經(jīng)二甲苯透明、梯度乙醇溶液脫蠟處理后,采用枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)30 min,冷卻至室溫后,采用3%的過氧化氫溶液避光孵育10 min,5%的山羊血清避光孵育30 min進(jìn)行再封閉,滴加Iba1抗體(1∶1 000)4 ℃避光孵育過夜,滴加二抗(1∶200)37 ℃孵育60 min后滴加DAB染色,蘇木素復(fù)染1 min后0.4%鹽酸乙醇溶液進(jìn)行分化,自來水沖洗返藍(lán),之后脫水、二甲苯透明和封片后,采用顯微鏡觀察腦組織Iba1蛋白表達(dá)并拍照,使用Image Pro Plus軟件計算圖片平均積分吸光度值(IOD)。

1.4.10 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測腦組織TLR4、NF-κB p65表達(dá) 取制備的腦組織裂解溶液,4 ℃離心(轉(zhuǎn)速12 000 r/min,25 min)后取上清液,BCA法進(jìn)行蛋白定量后沸水浴10 min,之后依次采用十二烷基酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)分離蛋白、濕法轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1.5 h,滴加TLR4(1∶800)、NF-κB p65(1∶1000)、β-actin(1∶3 000)一抗4 ℃孵育過夜,滴加IgG二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,滴加DAB顯色,以目標(biāo)蛋白條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺失評分、腦含水量、血腫體積比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠神經(jīng)功能缺失評分、腦含水量、血腫體積增加(P<0.01);與模型組比較,RES中劑量組、RES高劑量組和NMP組神經(jīng)功能缺失評分、腦含水量、血腫體積均降低(P<0.05或P<0.01);與NMP組比較,RES高劑量組神經(jīng)功能缺失評分、血腫體積降低(P<0.05);兩組腦含水量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺失評分、腦含水量、血腫體積比較(±s)

2.2 各組大鼠腦組織病理學(xué)改變 假手術(shù)組大鼠腦組織未見血腫,腦組織結(jié)構(gòu)和神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)均未見異常;模型組腦組織呈片狀紅細(xì)胞,腦組織水腫,神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少、間隙增大、細(xì)胞固縮、細(xì)胞核深染,炎性細(xì)胞浸潤等病理學(xué)改變;與模型組比較,RES各劑量組和NMP組大鼠腦組織病理學(xué)呈不同程度改善,RES組上述效應(yīng)呈一定的劑量依賴性。詳見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理學(xué)改變(HE,×200)

2.3 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況比較 假手術(shù)組大鼠腦組織可見極少量凋亡細(xì)胞;與假手術(shù)組比較,模型組腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)量增多;與模型組比較,RES各劑量組和NMP組凋亡細(xì)胞數(shù)量不同程度減少,RES組上述效應(yīng)呈一定的劑量依賴性。與假手術(shù)組比較,模型組AI升高(P<0.01);與模型組比較,RES中劑量組、RES高劑量組和NMP組AI降低(P<0.01);與NMP組比較,RES高劑量組AI降低(P<0.01)。詳見圖2、表2。

圖2 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況(TUNEL,×200)

表2 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞AI比較(±s) 單位:%

2.4 各組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量升高(P<0.01);與模型組比較,RES中劑量組、RES高劑量組和NMP組TNF-α、IL-1β、IL-6含量降低(P<0.05或P<0.01);與NMP組比較,RES高劑量組TNF-α、IL-6含量降低(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較(±s) 單位:pg/mL

2.5 各組大鼠腦組織MDA含量和SOD、CAT活性比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織MDA含量升高,SOD、CAT活性降低(P<0.01);與模型組比較,RES中劑量組、RES高劑量組和NMP組MDA含量降低,SOD、CAT活性升高(P<0.05或P<0.01);與NMP組比較,RES高劑量組MDA含量降低,SOD、CAT活性升高(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組大鼠腦組織MDA含量和SOD、CAT活性比較(±s)

2.6 各組大鼠腦組織Iba1表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織Iba1表達(dá)升高(P<0.01),部分小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)呈阿米巴蟲樣;與模型組比較,RES中劑量組、RES高劑量組和NMP組Iba1表達(dá)降低(P<0.01),阿米巴蟲樣小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少;與NMP組比較,RES高劑量組Iba1表達(dá)降低(P<0.01),阿米巴蟲樣小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少。詳見表5、圖3。

圖3 各組大鼠腦組織Iba1表達(dá)(IHC,×200)

表5 各組大鼠腦組織Iba1表達(dá)比較(±s)

2.7 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)升高(P<0.01);與模型組比較,RES中劑量組、RES高劑量組和NMP組TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)降低(P<0.01);與NMP組比較,RES高劑量組TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)降低(P<0.01)。詳見圖4、表6。

圖4 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)條帶圖(A為假手術(shù)組;B為模型組;C為RES低劑量組;D為RES中劑量組;E為RES高劑量組;F為NMP組)

表6 各組大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)比較(±s)

3 討 論

急性腦出血發(fā)病率約占腦卒中的15%,是死亡率較高的腦卒中類型,且存活病人多留有嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙,是臨床亟待解決的難題[16]。腦出血病理機制復(fù)雜,其中炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞凋亡在疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用[17-18]。目前,西醫(yī)治療急性腦出血主要采取外科手術(shù)結(jié)合血壓管理的方案,雖然可挽救部分病人生命,但死亡率和殘疾率仍居高不下。

近年來,中醫(yī)藥治療急性腦出血逐漸得到人們的關(guān)注與認(rèn)可。中醫(yī)學(xué)將腦出血歸屬于“中風(fēng)”范疇,其病機在于“氣虛血瘀、痰瘀阻絡(luò)”[19]。RES是一種具有多種生物學(xué)活性的非黃酮類多酚化合物,天然存在于葡萄、花生、桑椹、虎杖等植物中,因1939年首次從白藜蘆的根莖中提取出而得名。NMP是一種鈣離子阻滯劑類降壓藥,是臨床防治腦出血等急性腦血管病的常用藥物。本研究通過自體血注射法制備急性腦出血大鼠模型,其病理生理特征與臨床相似,是腦出血動物實驗常用的造模方法[20]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)RES或NMP治療可改善急性腦出血大鼠神經(jīng)功能,降低腦組織含水量和血腫體積,改善神經(jīng)細(xì)胞病變,減輕炎性細(xì)胞浸潤,抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,且RES的作用具有一定的劑量依賴性,RES高劑量組優(yōu)于NMP組,提示RES具有抑制急性腦出血大鼠腦組織損傷,改善神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的免疫細(xì)胞,腦出血所致血腫占位和顱內(nèi)高壓等將病理性刺激小膠質(zhì)細(xì)胞活化,分泌細(xì)胞因子、炎性趨化因子,引發(fā)氧化應(yīng)激和炎性級聯(lián)反應(yīng)[21-22]。Iba1是小膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白,非活化狀態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞Iba1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中,呈細(xì)長分枝狀;腦出血時,小膠質(zhì)細(xì)胞活化,Iba1蛋白表達(dá)量升高,細(xì)胞形態(tài)呈肥大的阿米巴蟲樣[23]。本研究采用IHC法觀察RES對急性腦出血大鼠腦組織Iba1表達(dá)量和形態(tài)的影響,結(jié)果顯示,經(jīng)RES或NMP治療可降低Iba1表達(dá)量,減少阿米巴蟲樣小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量,RES高劑量組作用優(yōu)于NMP組,提示RES具有抑制急性腦出血大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞活化的作用。

活化的小膠質(zhì)細(xì)胞將大量分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子加重炎癥反應(yīng),且IL-1β、TNF-α作為炎性趨化因子引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[24]。SOD和CAT是機體重要的抗氧化酶,可清除體內(nèi)過量的活性氧,減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的毒性MDA,減輕氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)RES或NMP治療可降低急性腦出血大鼠腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA含量,提高SOD、CAT活性,RES高劑量組的作用優(yōu)于NMP組,提示RES可抑制急性腦出血后炎癥反應(yīng),減輕氧化應(yīng)激損傷。

存在于小膠質(zhì)細(xì)胞中的TLR4是一類跨膜識別受體,在腦組織炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要的信號傳導(dǎo)作用[25]。NF-κB為TLR4下游靶基因,可被TLR4誘導(dǎo)表達(dá),活化NF-κB核轉(zhuǎn)位后NF-κB p65亞基與染色體特定位點結(jié)合,進(jìn)而誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子釋放,加重炎癥反應(yīng)[26]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)RES或NMP治療可降低急性腦出血大鼠腦組織TLR4、NF-κB p65表達(dá)量,RES高劑量組作用優(yōu)于NMP組,提示RES可抑制急性腦出血大鼠TLR4/NF-κB信號通路,可能是RES抑制炎癥反應(yīng)的重要分子機制。

綜上所述,RES可抑制腦出血大鼠腦組織炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和神經(jīng)細(xì)胞凋亡,減輕腦組織損傷,其機制可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和TLR4/NF-κB通路有關(guān)。本研究為RES防治腦出血提供了依據(jù)。